pcr

首先是开机打开主页面-----按C键（programme）进入到---列表页面-----通过方向键选择一个subdirect-----按enter进入-----输入你的programme no 和name----再enter----设置lid temp:99度和preheating: on----继续按enter进入---输入1：94度 5min2：94度 1min3：65度 1min（然后连按向右的方向键3下，进入到另一个界面，在标闪烁处（也就是3的后面）输入-0.5（其上方为dt），其他的不管，然后，再连续按enter键回到编程的主页面，此时（65 度 1min 后面会显示一个加号）4：72度 1min 2 19（Biometra PCR 本身加一个反应即20个循环）5：94度 1min6： 55度 1min7： 72度 1min 5 4（Biometra PCR 本身加一个反应即5个循环）8：72度 10min9 ：4度 10h好了，一个touchdown程序就设好了，本来想照了图片对应说，但是借别人的相机，界面照得不清楚，只好这样写出来了，也不知道说清楚了没有。

对于一个PCR反应，虽然有各种各样的PCR仪引物设计软件或者经验公式计算最适的退火温度，可是由于模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能"P"出来结果，细微的变化对结果都可能产生决定性的影响，因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。不单退火温度，连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要，因为Taq和校正酶的最佳反应温度可能有显著差异，优化延伸温度就显得很重要。多次实验可在一台仪器上完成，既节省实验时间提高效率，又节省实验成本。 检验地带网 对于带梯度功能的PCR仪，需要考虑梯度模式下不同梯度管排间的温度均匀性和准确性，还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。这种差异可能导致在梯度模式下得出的最佳条件与标准模式下单独做的结果出现差异。SteadySlope技术是eppendorf拥有的梯度PCR技术专利，可以同样的温度变化速率到达所有设定的梯度温度，所以在梯度模式下具有恒定的温度性。这一技术保证了在梯度模式和普通模式之间可以进行可靠的信息传递，不会因为温度特性不同而导致产量和特异性的变化。MJ没有付专利费而选择在梯度模式下采用不同的降温速率，每个梯度温度之间的温度曲线不同，从梯度模式向普通模式进行转换的可能会出现问题。此外采用TCT（三组回路）技术的梯度PCR仪由于在梯度PCR模式下增加了一个加热和冷却的控制区域，保证了梯度温度控制的精确性并使不同梯度管排间的温度均匀性更好。 在PCR仪上增加原位PCR模块就可以在玻片上进行原位PCR扩增，MJ和eppendorf的PCR仪都有提供原位适配器以满足不同需要。购买配有支持原位PCR模块的PCR仪对从事医学研究的工作者是很值得的，一机两用。 此外，随着基因组高通量研究的需求的提高，各品牌都推出了多槽式高通量PCR仪，各有特长：MJ有一种一拖四，就是1个主机带4个扩增槽，每个槽可以独立控温，一次可以作96x4个样品的PCR，不过一旦出现问题4个都不能用了。ABI则在原来的9700的基础上推出了双384孔的基座，一次完成384x2个样品，使得9700的功能又扩展到高通量领域而无需购买新的机器，可惜两个384槽不能独立控温。

设一个高的退火温度,设一个低的退火温度,然后会自动计算出中间每排孔的退火温度,你只要用最低和最高的那两个就够了.可以打EPPENDORF的技术支持电话问具体怎么操作.

乙肝基因检测（PCR）是什么？我们都知道，乙肝患者一般要做乙肝两对半、乙肝病毒DNA等检查，那么，是用什么方法做这些检查的呢？什么是乙肝基因检测（PCR）呢？ 云南肝病医院肝病专家翟淑贤教授指出，病毒性肝炎是感染病毒引起的，病毒通常由蛋白质和核酸两部分组成。以乙肝病毒为例，它由几种不同的蛋白质和核酸组成，其中的核酸也就是病毒的遗传物质，我们称之为乙肝病毒DNA。临床上想要检查是否患有乙肝，一般是做乙肝两对半检查，也就是检查血液中有没有乙肝病毒的蛋白质（抗原或抗体）。除此之外，还需要检查乙肝病毒DNA，而乙肝病毒DNA的检查也可以称作基因诊断，目前最常用的是“PCR法”。 翟淑贤教授指出，PCR是一种分子生物学方法，它的全称为：聚合酶链反应。这种方法是用一些特殊的仪器，将非常微量的DNA扩大百万倍，因此，灵敏度非常高。目前很多大医院都有这类检测仪器设备。 可能很多患者还会有疑问，为什么做了乙肝两对半检查还要做乙肝病毒DNA检查呢？翟教授表示，检测乙肝病毒DNA的主要目的是观察治疗的效果、病毒的数量以及传染性大小。乙肝病毒DNA的水平越高，提示患者体内的病毒量越多，病毒可能正在繁殖复制，其传染性就越强。反之，乙肝病毒被抑制或被清除，传染性也相对较小。而乙肝两对半检查只是初步判断是否感染乙肝病毒，以及区分乙肝大小三阳等，不能对病情做出诊断，因此，乙肝病毒DNA检查具有很重要的作用。 推荐阅读》》》PCR法HBV-DNA检测的临床意义 值得关注的是，我院作为云南省首批公立三甲医院，是云南首家通过国家卫生部认证的拥有基因扩增（PCR）实验室的肝病医院，采用国内领先的乙肝基因检测（PCR）系统，它的主要作用是：病例分析，乙肝病毒HBV定量分析，病毒类型分析，病毒变异分析，乙肝病毒HBV耐药测试，药物疗效评估等。通过乙肝基因检测|（PCR）系统可以全面了解病情，结合患者的具体病情分析，从而能达到科学用药，制定科学的治疗方案，联合“体细胞免疫疗法”治疗，大大提高临床治愈效果。

自己上医院！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！

大鼠灌注取脑；用途：；1.用于常规HE染色，免疫组化分析；2.冰冻切片可以不做脑组织固定；3.不可用于westernblot和PCR；4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作；原理：；心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织；必要性：；1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易；2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；3.脑内血液大鼠灌注取脑用途：用于常规HE染色，免疫组化分析。2.冰冻切片可以不做脑组织固定。3.不可用于western blot和PCR。4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1) 麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔麻醉动物。4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排液的有效观察指标。6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。补充：还有一种省时省剂的方法。夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。

我会用，WUrst。 Weepcraft，huzuai把客户端这个文件放入MC中心文件里

转录因子的chip-seq不一定需要qpcr验证，但如果对转录因子进行敲除或knockdown，又不愿意做chip-seq，可对靶基因进行chip-qpcr。做western如果是转录因子，作用位置应该在核内，但有一些TF是细胞质易位到细胞核，所以看你关心的是总量还是什么，是否存在特殊修饰等等，根据需求选择。

No Template Control，即无模板对照，是阴性对照

　　聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。　　PCR技术简史　　PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。　　PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。　　PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。　　PCR技术基本原理　　PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。　　PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。　　PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5"端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3"端开始延伸，其5"端是固定的，3"端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5"端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3"端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。　　PCR反应体系与反应条件　　标准的PCR反应体系：　　10×扩增缓冲液 10ul　　4种dNTP混合物 各200umol/L　　引物 各10～100pmol　　模板DNA 0.1～2ug　　Taq DNA聚合酶 2.5u　　Mg2+ 1.5mmol/L　　加双或三蒸水至 100ul　　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。　　设计引物应遵循以下原则：　　①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。　　②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3"端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。　　⑤引物3"端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。　　引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。　　酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。　　dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。　　模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。　　Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。　　PCR反应条件的选择　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　复性温度=Tm值-(5～10℃)　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。　　循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。　　PCR反应特点　　特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：　　①引物与模板DNA特异正确的结合；　　②碱基配对原则；　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；　　④靶基因的特异性与保守性。　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。　　灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。　　简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。　　对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析　　PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。　　凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。　　琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。　　聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。　　酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。　　分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。　　Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。　　斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。　　核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可

呃，一般都有个pcr仪的dna提取出来后，加入四种核酸原料，引物，聚合酶，Mg2＋缓冲液，放到pcr仪里面。里边加热。降温。加热。降温。。。不断复制扩增，引物所对应的一段特定dna。其实没啥技术含量的。。。。

PCR诊断技术又叫多聚酶链式反应技术，它采用分子技术模拟核酸在体内的复制，从而判定疾病病原的种类，所以从本质上来说，这是一种实验室诊断方法。目前省内一些科研和检测机构，如山东省农科院、山东农业大学以及山东省兽医总站都已经熟练掌握了这项技术。 以往给动物治病，兽医都是采用看闻问摸的方法，这就要等到动物表现出明显的症状，才能初步判定疾病的类型，有时病症复杂了，还得经过很长一段时间的治疗性诊断，不仅错过了治疗的最佳时间，还会造成饲料和药品的浪费。甚至还会出现误诊。而PCR技术就不同了，它不需要观察动物的外观表现，所以无论是在潜伏期还是爆发期，只要对动物的相应器官进行检测，在两个小时内就能准确判定出畜禽疾病的原因和种类，这就意味着能够快速治愈爆发的疾病。另外，这项技术也能作为确定某些疾病流行的权威依据。特别是目前其他各种技术都很难确诊的病毒病，通过它就可以非常直观的得出结论。

包括：变性，退火，延伸。主要是用于目的基因的扩增。

聚合酶链式反应，一种人工在体外进行DNA基因片断扩增的方法。用于检验，灵敏度极高。比如要检验人体内是否有某个病毒。只要样本中有一个DNA分子片断，就可以通过倍增的方法迅速复制这个分子片断。复制的数量呈指数增长，几十次就可以以得到足够的分子样本进行后续的检验了。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段.可看作生物体外的特殊DNA复制.DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现 ,而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应.现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的.它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的 酶,但它被广泛运用则于80年代之后.PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出.他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验.而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的,Dr. Mullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位.Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文.此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背.随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术.Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖.

pcreeha可以组成什么单词？cheaper 便宜些的

^表示字符串的开始意思就是匹配/开头的比如：/eeeeaaa//aaa但不能匹配a/eeeees22/aaa

1、连接上相应的linux主机，进入到等待输入shell指令的linux命令行状态下。2、在linux命令行下输入shell指令：rpm-qapcre。3、键盘按“回车键”运行shell指令，此时会看到pcre的版本，说明已安装，否则未安装。

英文和数字

gdm是字符控制台下面使用鼠标跟xwindow 、桌面管理器没关系

换一个

用preg_match正则提取目标内容，死活有问题，代码测得死去活来。后来怀疑PHP 的preg_match有字符串长度限制，果然，发现“pcre.backtrack_limit ”的值默认只设了100000。后来加了这句就OK了pcre.backtrack_limit=-1

你说 的是PCI-E的插口吧!现在新出的都是这样的接口啊!买7600GT吧,上代的经典,现在也不过时.而且价格已经是冰点了.跑游戏一点不比新出的差.通杀一切主流网游

1、编译PCRE正则表达式库 （1） （MinGW + MSYS） 将PCRE源码包直接拷贝到MSYS目录下，（如：C:MSYS1.0pcre） 运行msys.bat启动MSYS， 在命令行输入 cd / // 回根目录 cd pcre // 进入PCRE目录 ./configure // 配置编译 make // 编译全部 完成后，会在C:MSYS1.0pcre.libs 下生成所需要的文件： libpcre-0.dll // PCRE的动态链接库 libpcre.dll.a // 调用PCRE动态链接库所用的LIB libpcre.a // PCRE静态链接库 再配合上C:MSYS1.0pcre目录下的"pcre.h"，就可以在程序中加入正则表达式支持了:) （2） （于windows平台手动编译pcre，转载） 将 config.h.generic 重命名为 config.h 设置其中的 HAVE_BCOPY 参数为 0 (因为windows平台无bcopy()函数) 重命名 pcre.h.generic 为 pcre.h. 重命名 pcre_chartables.c.dist 为 pcre_chartables.c. 编译 dftables.c 成可执行文件，要加入参数 -DHAVE_CONFIG_H，以便导入 config.h 文件中的设置 /* 重命名 pcre_chartables.c.dist 为 pcre_chartables.c */ 运行编译的可执行文件 dftables.exe ，参数为 pcre_chartables.c 即 dftables.exe pcre_chartables.c 新建工程，包含下列文件，编译成lib文件即可 pcre_internal.h ucp.h ucpinternal.h ucptable.h pcre_chartables.c pcre_compile.c pcre_config.c pcre_dfa_exec.c pcre_exec.c pcre_fullinfo.c pcre_get.c pcre_globals.c pcre_info.c pcre_maketables.c pcre_newline.c pcre_ord2utf8.c pcre_refcount.c pcre_study.c pcre_tables.c pcre_try_flipped.c pcre_ucp_searchfuncs.c pcre_valid_utf8.c pcre_version.c pcre_xclass.c 这样就可以生成 libpcre.a 文件了 (vc,bcc生成的是pcre.lib，大同小异)2、使用生成的 libpcre.a （静态链接库） 在你的程序中添加： #define PCRE_STATIC // 开启静态链接库支持（一定要添加该行，否则无法使用静态链接库） #include "pcre.h" // PCRE头文件 并且添加 libpcre.a 到工程中，然后就可以在程序中使用PCRE函数了：） 编译选项 添加 /MT ,无头文件预编译.3、使用生成的 libpcre-0.dll 和 libpcre.dll.a （动态链接库）在你的程序中添加： #include "pcre.h" // PCRE头文件并且添加 libpcre.dll.a 到工程中，然后就可以在程序中使用PCRE函数了：） ================================================================================ 命令行下的批处理解决方法 .如果已经下载,可以不用第一行.goto START首先确保控制台环境中有：1、VC6命令行编译环境2、wget.exe、unzip.exe、sed.exe、mv.exe然后执行这个批处理文件，就可以得到VC版本的pcr.lib。:STARTwget ftp://ftp.csx.cam.ac.uk/pub/software/programming/pcre/pcre-7.7.zipunzip pcre-7.7.zipcd pcre-7.7sed -e "s/#define HAVE_BCOPY 1/#define HAVE_BCOPY 0/g" config.h.generic > config.hmv pcre.h.generic pcre.hmv pcre_chartables.c.dist pcre_chartables.ccl -MD -DHAVE_CONFIG_H dftables.cdftables.exe pcre_chartables.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_chartables.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_compile.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_config.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_dfa_exec.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_exec.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_fullinfo.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_get.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_globals.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_info.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_maketables.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_newline.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_ord2utf8.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_refcount.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_study.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_tables.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_try_flipped.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_ucp_searchfuncs.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_valid_utf8.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_version.ccl -O1 -MD -DHAVE_CONFIG_H -c pcre_xclass.clib -out:libpcr.lib pcre_chartables.obj pcre_compile.obj pcre_config.obj pcre_dfa_exec.obj pcre_exec.obj pcre_fullinfo.obj pcre_get.obj pcre_globals.obj pcre_info.obj pcre_maketables.obj pcre_newline.obj pcre_ord2utf8.obj pcre_refcount.obj pcre_study.obj pcre_tables.obj pcre_try_flipped.obj pcre_ucp_searchfuncs.obj pcre_valid_utf8.obj pcre_version.obj pcre_xclass.obj 这样就出来了: pcre.h + libpcr.lib==============================================================================最近使用VC编译了一下她的源代码，其实步骤很简单， 如下1 一些源文件改名config.h.generic 改名为 config.h (注意里面的配置)pcre.h.generic 改名为 pcre.hpcre_chartables.c.dist 改名为 pcre_chartables.c2 建立VC工程建立一个VC的DLL工程，去掉原有的包含文件将PCRE的所有pcre_*.c都加进去, pcre后面没有_的不要加, 后缀名是.cc的不要加可以参考上面的.还有.h 文件也是要的.3 修改工程设置增加工程预编译宏 HAVE_CONFIG_H不使用预编译头 Not Using Precompiled Headers编译选项 添加 /MTOK 完成以上三步，就可以在 VC 上编译通过了。4 编译结果使用时只需要编译出来的 .DLL .Lib 和 源代码目录的 pcre.h

pcre是正则标准，是一个库，而snort是使用了这个库，他们怎么可以做比较呢

rpm -qa pcre 如果安装了 会显示版本 没安装就啥都没有

是一个正则表达式库，里面提供了很多正则函数，但是使用的语法是perl5The PCRE library is a set of functions that implement regular expression pattern matching using the same syntax and semantics as Perl 5.

核酸检测缩写英文pcr是指阴性，全名为negative PCR test result。虽然中文称为核酸检测，英文说法并没有包含nucleic acid核酸这个词语。PCR这个缩写的全称形式是polymerase chain reaction，含义是聚合酶连锁反应。从学习英语的角度来说，PCR这个缩写中，包含了一个偏门的词语前缀poly，也包含了一个常用的比喻成语chain reaction。另外在测试采样过程中，还会用到swab这个形象生动的关于液体的词语。核酸检测简介核酸检测的物质是病毒的核酸，核酸检测是查找人体的呼吸道标本、血液或粪便中是否存在外来入侵的病毒的核酸，来确定是否被新冠病毒感染。因此一旦检测为核酸阳性，即可证明患者体内有病毒存在。新冠病毒感染人体之后，会在呼吸道系统中进行繁殖，因此可以通过检测痰液、鼻咽拭子中的病毒核酸判断人体是否感染病毒。所以说核酸检测阳性，可以作为新型冠状病毒感染确诊的新标准。2022年4月，核酸检测降价。7月29日，国务院联防联控机制印发通知，要求进一步推动新冠病毒核酸检测结果全国互认。以上内容参考：百度百科—核酸检测

扩增阻滞突变系统PCR,也叫等位基因特异性PCR。基于引物3"末端碱基与模板结合的严谨性而发展起来的一种技术，最初主要是用于等位基因分型，目前已经有基于该技术的体细胞突变检测试剂盒问世

pcr这里是指常规的pcr吧？就是以dna为模板，dntp为原料，在taqdna聚合酶的作用下，扩增dna。rt-pcr即reversetranscription-pcr，顾名思义就是讲mrna通过反转录成第一链cdna后，以第一链cdna为模板进行pcr。

enzyme linked immunosorbent assay,ELISA.指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反应的定性和定量方法.这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性.在测定时,把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例.加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析.由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度. 聚合酶链式反应,简称PCR.聚合酶链式反应,其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点.它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术.

首先，从引物设计上避免基因组DNA的扩展，设计引物的时候扩展的区域在两个不同的外显子上，这样的话中间有一个内含子，如果PCR扩增的时候将基因组DNA也扩增出来的话，电泳条带长度会比目地带长另外，提取好RNA之后，可以加入DNA酶进行消化，这样可以消除RNA模板中的基因组DNA污染，TAKARA公司有卖的。做到以上两点基本可以保证没有基因组DNA的干扰了

a quantity of指的“一些”，通常用法是a small/larege quantity of，比如说“少量食物”a small quantity of food。the quantity of指的是“……的数量”，后面可以＋可数名词／不可数名词，比如说The quantity of books in the library is 1000。词语用法quantity的基本意思是“数量”，是正式用语。作与质量相对而言的“数量”解时是不可数名词，指事物的“量”或“总数量”时是可数名词。quantity强调大批计量，含有准确测量的意味。quantity不能用much, less等表示“多少”意义的词修饰，可用large, great, small等表示“大小”意义的词修饰。quantity既可用于可数名词也可用于不可数名词，如a quantity of flowers和a quantity of water。

你在网上下载个医学电子词典吧。或者买一本英汉医学词典也可以，要不用个电子词典下载医学词汇也不错。医学简称非常多也很难记，接触多了你自然可以比较清楚，但是前期还是先抱字典吧。

Pcr之后如何能快速的测得DNA浓度是否够测序高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。 基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3"末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

荧光定量pcr操作步骤荧光定量PCR　实验步骤：样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10×MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS，pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备RNA样品取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。③电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

PCR主要组分包括：双蒸水、引物、10X缓冲液、dNTP、模板和酶。引物是与模板配对的十几二十个碱基，起始PCR的合成部位10X缓冲液成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构dNTP是四种脱氧核苷酸，A、T、C、G，PCR扩增中用于合成DNA的原料模板是待扩增的DNA序列酶能够催化DNA序列的合成PCR程序主要包括：预变性：95-98度5min，双链DNA解旋形成单链变性：95-98度20-30s，双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA退火：55-60度，30s，系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。延伸：72度，在酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端→5′端延伸，合成与模板互补的DNA链。循环变性至延伸步骤30-35次最后72度5min其中变性温度与时间跟选用的酶相关，退火温度跟引物设计有关，延伸时间跟你扩增片段长度和选用酶相关。

变性：加热使模板DNA在高温下（94℃左右）双链间的氢键断裂而形成两条单链。退火；使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5"一3"方向复制出互补DNA。扩展资料PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg离子）。引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子。二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。参考资料来源：百度百科-PCR技术参考资料来源：百度百科-聚合酶链式反应

卸载了你电脑上的QQ电脑管家，然后你就永远看不到他了。。。哈哈哈哈

问题签名:问题事件名称:APPCRASH应用程序名:DllHost.exe应用程序版本:6.1.7600.16385应用程序时间戳:4a5bca54故障模块名称:ffdshow.ax故障模块版本:1.1.3838.0故障模块时间戳:4dc1dcec异常代码:c0000005异常偏移:0000000000011587OS 版本:6.1.7601.2.1.0.256.1区域设置 ID:2052其他信息 1:5715其他信息 2:5715a15d05a7f74edd492bdb3b5baa1b其他信息 3:cbfa其他信息 4:cbfaec85e9787699d18d9d3fc3044c78联机阅读隐私声明:如果无法获取联机隐私声明，请脱机阅读我们的隐私声明:C:Windowssystem32zh-CNerofflps.txt

lamp快速检测运用扩增原理，其优势如下：（1）恒温扩增，扩增阶段对仪器的要求低。（2）视觉直观检测，不需要检测仪。（3）反应速度快，灵敏度较高。（4）用多个引物，特异性好。（5）价格便宜。希望以上对您有所帮助，望采纳~

去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛？>>> 竞争定量PCR（competitive quantitative PCR） 竞争定量PCR是先构建一个与靶基因相同的扩增效率和引物结合位点仅探针结合位点不同的内标，在同一反应管内，靶基因和内标物和引物（primer）竞争性结合，进行同步扩增，由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物相对逐渐减少，但两种扩增产物的比值和两种初始状态时模板分子数的比值是一致的。根据标准品的准确含量制作标准曲线，从而进行准确核酸定量。由于内标品构建中特别要求是Ev与靶基因扩增效率一致，如果靶基因序列和内标相同，那么扩增过程中两者的实际扩增效率就接近一致，就可以对靶基因进行绝对定量，即确定样品中靶基因准确分子数，否则只能相对定量，即确定样本间靶基因分子数的差异，总体上说，加入内标物，消除PCR扩增过程中于反应管和反应管间以及标本之间存在差异。因此，内标法是目前PCR定量方法中最准确的方法，但构建内标物是建立本方法的关键。 构建内标物的基本原则是内标物具有靶基因的相同扩增条件和相同扩增效率。和可区别于靶基因探针结合位点与不干扰靶基因的扩增。因此，理想的内标物应具备与靶基因序列待分析序列相同的引物结合位点，相似的或相同大小、相似的碱基排列顺序。

说明被测试者身体内在表达这个MAGE—A3基因，而这个基因和某些疾病有关，可作为诊断的一种依据。

PCR中哪有MAKER啊？是PCR之后进行琼脂糖电泳时加的MAKER吧，MAKER的作用通俗点讲就是起了指示作用，指示你P出来的片段的大小，再通俗点讲，MAKER是起了刻度尺的作用。

PCR实验本身中不需要加入marker，但是在PCR过后跑电泳的时候需要加入marker。用来对比PCR产物的大小，看看产物的电泳条带是不是符合你的预期的。marker是人为的把一系列已知大小的DNA（或已知质量的蛋白，当然PCR中用的是DNA marker不是蛋白marker）混合在一起，在电泳的时候对照用。跑完电泳之后，会看到marker的有几条清楚的条带，而每条的大小都是可以在这个marker的说明书上查到的。所以，跟你的条带对照，就大体知道你需要的条带的大小范围了。ps.又是你啊，上次转化那个你还没给我采纳呢=.=

PCR实验本身中不需要加入marker，但是在PCR过后跑电泳的时候需要加入marker。用来对比PCR产物的大小，看看产物的电泳条带是不是符合你的预期的。marker是人为的把一系列已知大小的DNA（或已知质量的蛋白，当然PCR中用的是DNAmarker不是蛋白marker）混合在一起，在电泳的时候对照用。跑完电泳之后，会看到marker的有几条清楚的条带，而每条的大小都是可以在这个marker的说明书上查到的。所以，跟你的条带对照，就大体知道你需要的条带的大小范围了。ps.又是你啊，上次转化那个你还没给我采纳呢=.=

不是样本。所谓marker是指以此参照，衡量目的条带片段的大小。marker是通用的。

PCR实验本身中不需要加入marker,但是在PCR过后跑电泳的时候需要加入marker.用来对比PCR产物的大小,看看产物的电泳条带是不是符合你的预期的.marker是人为的把一系列已知大小的DNA（或已知质量的蛋白,当然PCR中用的是DNA marker不是蛋白marker）混合在一起,在电泳的时候对照用.跑完电泳之后,会看到marker的有几条清楚的条带,而每条的大小都是可以在这个marker的说明书上查到的.所以,跟你的条带对照,就大体知道你需要的条带的大小范围了.ps.又是你啊,上次转化那个你还没给我采纳呢=.=

你的浏览器是什么版本的，IE的吗？IE9吗？如果是IE9，很不幸的告诉你，目前这一个bug还没解，建议换回到IE8，目前IE9还有很多相容性的问题没解决！补充----------如果还想继续用IE9，按照如下方法来：1.关闭所有 Internet Explorer 或 Windows Explorer 。2.打开Internet Explorer。3.按一下 [工具]，选 [网络选项]。4.按一下 [高级] ，选 [重设]。5. [删除个人设定] 。6.在 [重设 Internet Explorer 设定] 中，按一下 [重设]。7.按 [关闭]，然后按 [确定]。8.关闭 Internet Explorer。接下来重启IE，看看还有没有问题，不过这不是最终解决这个问题的方法了！

声控灯改装正常灯用

1、按 PCR 仪正面左下角电源开关，启动 PCR 仪。2、放 PCR 离心管，先把顶盖向上扳，再往前推，露出放样孔，PCR 管放入前应加好反应体系各组分，再放入 PCR 离心管。3、反向重复第二步骤将顶盖板向后拉，盖好顶盖。4、按 F2“Create”新建一个扩增的 PCR 程序。5、按控制台面右方上下左右方向键，可随意移动编辑位置，输入需要的温度、时间、循环数等。6、据 PCR 离心管中加入的反应体积总量，在“Reaction volume”后输入相应数值，有 Std“1～100ul”和 9600“1~50ul”两档可供选择。7、按 F1“Start”启动8、按“INFO”对应键查看 PCR 结束键。9、扩增完成后按台面左方“Stop”键退出。10、按“Hist”，可查看上次扩增的历史记录。11、完全退出后，按台面左下方电源开关，拔出插销，切断电源

你所说的情况是由可变剪切造成的。下面是引物设计原则，希望能够对你有所帮助：Firstly of all, you should know what you want to dectect. for example, one gene has 2 spliced forms (transcript variants), but contain differenent exons, the first variant contains exon 1, 3, and 4, the second contains exon 1, 2, and 4. so if you want to detect the total level of this gene, you should design the primer to clone the sequence of exon 1 or 4, if you want to dectect just variant 1, you should design the primer based on exon3. others just like this.

你想要多长的PCR产物？ 上游：5"GCTGAACCAGTAGAAGACAA 3" 下游：5"AGTCTTCGTTTTGAACAGTG 3" 产物574bp,退火温度49.9度。 评分94分，没有发卡结构，不能形成引物二聚体。 可以么？如果你这个是一个编码序列（因为我看到前三个碱基是ATG，编码甲硫氨酸）用楼下那个：5" ATGGCTGCTGAACCAGTAGA 3" 5" CTAGTCTTCGTTTTGAACAG 3"也是可以的。只是两个引物的退火温度要相差将近6度。

你要扩增这个片段 只给出其序列不行。请给出外侧2翼的序列才能设计引物。

你也得打全部序列，就必须多给出些上下游的基因片段序列，还要说明你的实验目的及需不需要加酶切位点。

引物就是为了增幅目的DNA而导入的短小DNA片断,在PCR反应中,新合成的DNA是要接在引物上才能继续按照模版DNA复制.引物的设计因需要增幅的序列而不同.举个例子来说,你要增幅如下序列：accctcccgccccccccgtat(互补碱基不写了）那么一般来说,你就要导入以accctc结尾的引物使得增幅继续下去,具体方法和注意事项楼主可以看gee_an大侠的资料.查了一下测序公司的网页,如果要同定微生物,楼主需要准备如下东东：1、待测菌体.试管或培养皿都可以,但必须是纯粹的待测菌体,不能含有其他的微生物.2、提纯的DNA.如果1有致病性或传染性,那么楼主就得自己提纯DNA再交给测序公司.DNA纯度要求可以做PCR.

一般PCR使用两条引物，前后各一条，与模版DNA结合上后，前后的引物形成复制起始位点，共同向中间扩增，直到连上，一次扩增完成。

PCR的目的是大量扩增你所需要的片断。换句话说，就是用人工的方法大量复制DNA。而DNA的复制是以一条链为模板，新合成链按照碱基互补配对进行的。可是有一个问题，DNA的合成必须是前端有一小段序列，他接着这段序列合成，而不能从无到有，凭空合成。它前面这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp.需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物

PCR引物又称为寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，分为两种，引物1和引物2。由于DNA聚合酶只能从核苷酸链的5"端到3"端进行复制，也就是只能识别3"的尾端。而且只能把核苷酸连到已经和DNA模板互补产生的多核苷酸链上，所以引物1和2分别于双链DNA的两条链的尾部（就是末尾是3"端的那一边）结合，为那些脱氧核苷酸提供3"的末端，就相当于开了个头。然后在DNA聚合酶的作用下合成两条新链。而那段引物就成了新链的一部分。扩展资料：引物设计：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用u2206G值反映)。形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。参考资料来源：百度百科－引物参考资料来源：百度百科－寡核苷酸

这个东西你做一次PCR实验就明白了。

这个问题 有好几个原因：1：你的引物设计有没有问题？2：你用的taq 聚合酶有没有问题？3：你PCR 时的温度恰不恰当？（ 不同的引物有时温度影响也不同，多做几个看看）一般出现这种情况，确定taq 聚合酶没有问题，引物设计没有问题的情况下，改变PCR 时的温度就可以了。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获1993年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿，发展至今已有三代产品：第一代PCR定性检测技术及设备由基因扩增热循环仪（DNA Thermal Cycler）+电泳仪+紫外分析仪+定性试剂构成；第二代PCR-DNA终点定量技术及设备（End-point quantitative PCR detection）由基因扩增热循环仪+荧光仪+终点定量试剂构成，其又分为终点酶免定量（End-point ELISA-PCR）和终点荧光定量（End-point Flour-PCR）两种；第三代产品为QPCR-DNA/RNA实时荧光定量检测。 QPCR检测灵敏度高，检测线性范围宽，检测精度和重复性好等突出优势，因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇。被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有：乙肝病毒HBV DNA，丙肝病毒HCV RNA，艾滋病病毒HIV RNA，沙眼衣原体CT，淋病双球菌NG，巨细胞病毒CMV，结核分支杆菌Mtb等。实时荧光PCR仪研发技术难度大，门槛高，发达国家也只有有限几家知名公司生产，且售价昂贵，在50－120万元。 可见，在病人看来，哪家医院应用了QPCR技术便是先进诊断技术的象征，在发达国家也是如此。参考资料： http://zhang120jing.ebigchina.com

卡里·穆利斯(KaryMullis)

PCR plastic就是环保的回收再利用塑料post consumer recycled Plastic国内暂时没有， 美国KW Plastic 做这个很专业

相信大家在做PCR反应时总能遇到这样或是那样的问题，但多数都可以归为两个主要问题： 使用添加剂是解决这些问题的常用策略之一。通常添加剂的作用有两方面： 今天我就简单给大家介绍一下PCR反应中常见的添加剂以及它们的作用。 二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO） DMSO可以降低DNA的二级结构，所以通常在扩增GC含量很高的基因样本的时候都会添加。但是，DMSO 也会大大降低Taq 聚合酶（Taq polymerase）的活性（activity）。所以，大家要权衡好模板的接近率（template accessibility）和聚合酶的活性。我建议大家可以尝试不同的DSMO的浓度，例如从2% 到10%，来找出适合自己实验的浓度。 非离子性洗涤剂（Non-ionic detergents） 非离子性洗涤剂，例如0.1-1% 的Triton X-100, Tween 20 或是NP-40，通常可以降低DNA二级结构。虽然这样可以增加模板基因的扩增，但也会带来非特异性扩增的困扰。所以，这些添加剂对无杂物低产量的PCR反应很管用，但对相对不太纯的PRC反应就没那么好了。非离子性洗涤剂的另外一个好处就是可以减少SDS 污染。通常在DNA提取过程中，SDS会被带到PCR这个步骤，这就大大抑制了聚合酶的活性。所以，反应中加入0.5% 的Tween-20 或是Tween -40 可以中和SDS带来的负面影响。 甜菜碱（Betaine） 甜菜碱可以通过减小二级结构的形成来提高DNA的扩增，并且一般是商用PCR kit的“神秘”添加物。如果大家要用甜菜碱的话，应该放甜菜碱或是一水甜菜碱（Betaine or Betaine mono-hydrate），但不是盐酸甜菜碱（Betaine HCl）, 调成最终浓度为1-1.7M 的浓度。甜菜碱还可以帮助提高特异性，因为它能消除DNA融化/变性时对碱基对的依赖（eliminate the base pair composition dependence of DNA melting/DNA denaturation） 。 甲酰胺（Formamide） 甲酰胺是一种常用的有机PCR添加剂。它可以和DNA中的大沟（major groove）和小沟（minor groove）相结合，从而降低母版DNA双螺旋的稳定性并且减低DNA的解链温度（melting temperature）。甲酰胺在PCR实验中使用的浓度通常在1%-5%。 四甲基氯化铵（Tetramethyl ammonium chloride，TMAC） 四甲基氯化铵可以增加杂化的特异性（hybridization specificity）并且提高DNA的解链温度。因此，TMAC 可以去除非特异性的启动，并且减少DNA和RNA的错误结合。如果大家在PCR反应中使用简并引物（degenerate primers）时，记得可以添加TMAC，它常用的使用浓度为15-100mM。 其他常见的添加剂 除了以上提到的两大类添加剂，PCR反应中还有许多常见的添加剂，虽然作用不同，但也至关重要。 镁离子（Magnesium ion） 镁离子是聚合酶不可缺少的一个辅因子（cofactor），也就是说如果没有镁离子的话，聚合酶是没有活性的。但是，过多的镁离子同样也会影响聚合酶的工作效率。每种PCR反应中镁离子的浓度都不尽相同。螯合剂（Chelating agents，例如EDTA 或是 citrate）, dNTP 的浓度和蛋白质都会影响镁离子的浓度。所以，如果你的PCR实验有问题，可以尝试改变不同的镁离子浓度，例如从1.0到4.0mM，中间间隔 0.5–1mM 就可以。 值得注意的是，多次冻融循环能够导致氯化镁溶液（magnesium chloride）的浓度分层。所以大家在每次使用之前一定要完全溶解，并且混合均匀之后再使用。 牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA） 在分子化学实验中，牛血清白蛋白是很常见的添加剂，尤其在限制酶酶切和PCR的实验中。在PCR反应中，BSA 对于减少污染物，例如酚类化合物（phenolic compounds）有一定帮助。而且也有说法是它能减少反应物附着在试管壁的情况。在PCR反应中，通常BSA添加的浓度可达到0.8 mg/ml。 原文链接： PCR反应中各种添加剂的作用（上） - BioEngX PCR反应中各种添加剂的作用（下） - BioEngX

M有摩尔每升的意思。10M就是10mol／L但是，一般引物是不会这么高的浓度滴，应该是10mM，正好是引物的工作浓度。

dghdvfd

Primer5.0

a 引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。b 引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer 5，primer 6，primer express等一般可以设置在55-58度，beacon design可以设置在65左右。c GC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。d 产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不易区分，超过200bp可能会影响PCR扩增效率。e 软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。f 引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。

引物设计参数：a引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。b引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer5，primer6，primerexpress等一般可以设置在55-58度，beacondesign可以设置在65左右。cGC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。d产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不易区分，超过200bp可能会影响PCR扩增效率。e软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。f引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。

是的，聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。 DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现 ，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

小时候，我在 TBtools 中写了一个功能，“Primer Check (Simple e-PCR)” 。可以用于简单的 PCR 引物特异性检测，需要用户提供两个输入： 当然还有其他。既然不完美，那就值得改进。于是推出“Prime Check”插件。 具体结果如下 《TBtools Cookbook》 - 写给「TBtools」所有用户的参考手册 https://www.yuque.com/cjchen/hirv8i 你想知道的，都在里面了：

protocols英-["pru0259u028atu0259ku0252lz]美-["protu0259"ku0254lz]释义n. 协议；礼仪礼节；条款（protocol的复数）v. 拟定议定书；拟定草案（protocol的三单形式）

1目的 </B>保证GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪的正常使用。 2 该SOP变动程序 </B>本文件的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报经室技术负责人，由季度组长会议决定。如通过则公布实行。 3 适用范围 </B>GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪。 4 使用方法 </B>⑴依次打开电脑显示器和电脑主机电源开关，进入Windows 2000界面。 ⑵接着打开PCR仪电源开关，预热5分钟。 ⑶按需要在电脑上设定一个新的运行版面和程序。 ⑷推开滑门，将样品放入样品槽内，关上仪器滑门。 ⑸运行程序，在反应结束后按Save键储存实验结果。 ⑹关闭PCR仪电源开关。 ⑺分析实验结果；发放临床报告。 5 注意事项 </B>⑴仪器应放置在水平坚固的平台上，外界电源系统电压要匹配，并要求有良好的接地线。 ⑵环境温度保持在23℃左右，湿度保持在60％左右。 ⑶仪器应配备功率≥3000W的稳压器。 ⑷仪器应定期清洁维护。 ⑸仪器使用时应严格遵守上述使用步骤。 6 维护方法 </B>6.1微软Windows 2000操作系统的维护 </B>硬盘驱动器每月29日运行一次碎片清除程序，使用Norton Utilities或类似软件。现以Norton为例： ①放入Norton Utilities光盘，运行安装（Setup）文件。 ②安装完后取出Norton Utilities光盘，重新启动计算机 ③运行Norton Utilities软件，并启动其清理碎片/优化程序。 ④运行完成后，检查以确信无严重错误记录，退出Norton Utilities。 ⑤以后每次运行Norton Utilities软件中的清理碎片/优化程序就行了。 6.2 7000 PCR扩增仪的维护 </B>1.样品槽的清洁 样品槽每月29日进行一次清洁，如出现样品槽污染情况则随时清洁。 操作方法： ①运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。关闭仪器，等待10分钟。 ②从样品槽移去样品架。 ③在样品槽中加入少量95％乙醇，用棉签擦洗反应孔。 ④用干棉签吸干乙醇。 ⑤向里推动滑门，锁住，使样品槽升温到50℃，以蒸发掉多余的乙醇。 2.热盖的清洁 热盖每月29日进行一次清洁，如有需要随时进行。 ①运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。关闭仪器，等待10分钟。 ②逆时针旋转GeneAmp 7000光源检测器顶部旋钮。向后推GeneAmp 7000光源检测器至滑轨距离的大约1/3处。 ③GeneAmp 7000光源检测器滑轨上有缺口。从这些缺口垂直抬起GeneAmp 7000光源检测器，小心侧放于仪器顶盖上。不要从仪器取走热盖。 ④用湿润的镜头纸清洁加热盖，待干。 ⑤将GeneAmp 7000光源检测器重新安装回滑轨。 6.3 GeneAmp 7000光路系统的维护 </B>1.调准ROI参照条 调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器定期校准或仪器维修后进行。不得由一般实验人员进行该项操作。 ①推开滑门，在样品槽中放入荧光检测板。 ②GeneAmp 7000仪器滑门向前滑移盖住样品槽，并关紧。 ③从Start菜单或桌面点选运行GeneAmp 7000 SDS管理软件。 ④积分时间从512ms开始，用位置调整点，调节ROI的高度与右边线。 ⑤逐渐增加积分时间，直到可以看到至少四个块（约4096ms）。 ⑥调整最左侧位置调整点。 ⑦减少积分时间到1024ms，调整上方与底部的位置调整点。 ⑧减少积分时间以便最右侧块可见但未饱和（约512ms），调节最右侧位置调整点。如有需要用右上角拖动点调整图象的倾斜度（以左上角为中心旋转）。 ⑨调节后的参照条宽度必须在ROI参照块间有小空隙。 2.校正ROI光路 ROI光路校正每月29日进行一次，以便确信结果仍然是优化的。 ①推开滑门，在样品槽中放入荧光检测板。 ②GeneAmp 7000仪器滑门向前滑移盖住样品槽，并关紧。 ③从Start菜单或桌面点选运行GeneAmp 7000 SDS管理软件。 ④点选Show ROI复选框。每个样品孔周围出现一蓝色椭圆圈。 ⑤点选Show Saturation复选框。 ⑥设定积分时间为1024ms；打开卤素灯和光闸。 ⑦点击LIVE按钮获取图象，然后在任何地方左击停止。获取中等程度未饱和图象（无红色图象）。 ⑧从Edit菜单中选择Calibrate ROIs每个孔都会选取合适的ROI，确定96孔都被蓝色椭圆圈正确界定。 ⑨图象太亮太暗都会出现错误信息，相应增加或减少积分时间，并重复上述第8步直到无错误信息出现。 ⑩检查孔ROI位置，所有孔信息都应包含在96个ROI椭圆圈中。如果没有，重复8和9步。 3.检查样品槽的荧光污染 检查样品槽的荧光污染每月29日进行一次，如有需要随时进行。 ①开启GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪电源。 ②从Start菜单或桌面点选运行GeneAmp 7000 SDS管理软件。 ③从样品槽中移去反应板。GeneAmp 7000仪器滑门向前滑移盖住样品槽，并关紧。 ④单击New Document建立一个新的GeneAmp 7000文件 ⑤点击instrument中的catibrate显示ROI inspector窗口 ⑥把Exposure Time调到最大，把Capture image From调到最敏感的FiterB点,单击Snapshot获取图象。 ⑦减少积分时间，改变Capture image From中的A，B，C，D单击Snapshot 观察96孔中背景荧光。如孔有显著荧光则表示该孔存在荧光污染。 ⑧按照样品槽的清洁程序清洗样品槽。 4.更换卤素灯 仪器使用大约2000小时后应更换卤素灯。 ①关闭仪器，冷却15分钟。 ②将样品板放入仪器样品槽，关闭滑门。在仪器的顶部向上打开灯舱门。 ③拧下固定灯罩的螺丝，将灯罩向前滑移，使其从设备上取下。 ④将旧灯泡向前滑移，使其从夹状支架上取下，并将灯泡从灯座上拔下。 ⑤把新灯泡尾部的插杆插入灯座上的插孔，使二者连接起来。 ⑥使灯的长轴与仪器前向平行（即竖直于地面），将新灯泡滑回灯位。 ⑦在灯舱门处于打开状态下，打开仪器，确证在仪器运行时灯也能打开。 ⑧盖上灯罩，拧紧螺丝，关上灯舱门。 ⑨若新卤素灯不工作，GeneAmp 7000电源保险丝可能有问题。 7 校准 </B>GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪为复杂精密仪器，其校准工作需由专业工程师进行。除与仪器厂家达成协议定期校准以外，以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准提供信息。 ⑴通过对室内质控图的分析，我们可以及时发现系统误差的出现。经过分析排除了试剂和人员误差后，应怀疑是否仪器出现了检测偏差需要校准。此时进行仪器状态效验实验确定是否需要进行仪器校准。 ⑵仪器状态效验试验 ①使用标准化试剂作为效验试剂。 ②在仪器处于校准状态下，由固定人员用标准化试剂对102、103、104、106标准品进行扩增实验。该实验在两个月内应进行20次。分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。 ③每年6月、12月由固定人员进行上述实验，观察标准曲线的三个参数是否处在控制范围和102标准品是否检出。 ④当102标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时，先排除实验的人员、试剂因素，再重复实验。如结果依然，联系厂家立即进行仪器校准。 ⑤当仅有102标准品未检出时，检查实验全过程。再次上机检测102标准品 两枚。仍未检出联系厂家进行仪器校准。 ⑥仪器经过校准后，重复该实验。结果归入仪器档案。标本前处理标准操作程序 </B>1 目的 </B>保证标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。 2 该SOP变动程序 </B>本文件的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报经室负责人决定。如通过则公布实行。 3 适用待处理标本范围 临床基因扩增实验室现行检测项目。 4 标准操作程序 4.1 DNA血清类（例如HBV） </B>⑴双手戴上手套，从冰箱取出标本，将验单和试管依次编号，收起验单，弃去手套。 ⑵双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出1.5ml离心管，对应标本编号，置于离心管架上。 ⑶将移液器调到5008l，先吸取5008lDNA提取液加入到编好号的离心管中。然后吸取5008l血清，加入离心管中混匀，注意每吸取一份血清标本应更换一次枪头。处理全部标本，然后将离心管插到水浴板上，用镊子放入水浴锅，沸水浴10分钟。 ⑷水浴完成后用镊子将水浴板取出，转至4℃静置8～12小时，然后10000转 5分钟离心，取上清液208l点样上机。 ⑸收拾台面至准备状态。 4.2 RNA血清类（例如HCV） </B>⑴双手戴上手套，从冰箱取出标本，将验单和试管依次编号，收起验单，弃去手套。 ⑵双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上。 ⑶先用5～4008l的移液器，吸取1008lRNA提取液A加入到编好号的离心管中，再用40～20008l的移液器吸取5008l 血清加入，最后用200～1000 08l移液器加入200 08lRNA提取液B，在震荡器上震荡混匀，冰上放置5分钟，然后6000转1分钟离心。 ⑷去上清，留沉淀。加入45008l 用DEPC水配制的75%的预冷乙醇洗涤沉淀，然后6000转1分钟离心，去上清。相同方法再洗一次，吸干上清，65℃10分钟烘干。 ⑸给烘干的沉淀中加入18 08l的反应液I，混匀，再加入2 08l逆转录酶，充分混匀，瞬时离心（3秒），放入温箱，37℃45分钟逆转录。 ⑹逆转录后95℃3分钟高温灭活，瞬时离心（3秒），取5 08l上清立即点样上机。 ⑺收拾台面至准备状态。 4.3 分泌物类（例如CT） </B>⑴双手带上手套，从冰箱取出标本，将验单和试管依次对应编号，收起验单，弃去手套。 ⑵双手换上新手套，用镊子（夹取灭菌物品专用）取出1.5ml离心管，对应标本编号后，置于离心管架上。 ⑶用镊子拧下全部试管盖并依次置于实验台面上，试管对应放置于试管架上。 ⑷向每只试管中缓慢加入1ml无菌生理盐水。 ⑸用左手取试管于旋涡振荡器上充分振荡。 ⑹将试管中的洗脱液全部转至相应离心管。 ⑺将试管和离心管分别放回试管架和离心管盒中前一排对应位置，并用镊子将管盖对号盖回，把试管架放回冰箱。 ⑻双手换上新手套，用左手将离心管全部配平，按顺序置于离心机中相应位置，以 12000转离心5分钟。去上清，沉淀再加1ml生理盐水打匀，15000 rpm离心5分钟。（如超过12管，则需分批进行）。 ⑼离心完毕后，左手取出离心管，倾倒上液，再瞬时离心，右手取移液器将管内残液吸尽，只留下沉淀。如无明显肉眼可见沉淀，则可在管内留下约5008l液体。 ⑽依次向管中各加入5008lDNA提取液，此时移液器应与管壁约成30度角，吸头抵至沉淀上方靠管壁处，来回抽吸，将沉淀与DNA提取液混匀。 ⑾将加入DNA提取液的标本沸水浴10分钟。 ⑿将沸水浴后的标本放置至室温，并将其放入4℃冰箱中6～8小时保证充分裂解。 ⒀离心标本10000 转5分钟。 ⒁换上新手套，取上清液208l点样上机。 ⒂收拾台面至准备状态。 4.4痰液类（例如TB） </B>⑴取晨痰加入4倍体积4％氢氧化钠待其充分液化(30分钟)，液化过程中，振荡2～3次，如痰液粘稠，可延长液化时间。 ⑵取1 ml消化液加入离心管，10000转离心5分钟 ⑶弃上清留沉淀，加入1ml生理盐水洗涤，10000 转 5分钟离心。 ⑷重复⑶操作，留沉淀，加入5008lDNA提取液，混匀。 ⑸沸水浴10分钟，4℃放置8～12小时。 ⑹10000 转5分钟离心，取上清208l点样上机。

RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 原理是提取组织或细胞中的总RNA或者mRNA，在反转录酶的作用下将RNA或者mRNA反转录成cDNA，再以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。Real-time PCR（实时荧光定量PCR）也可以缩写为RT—PCR，此外还有一个qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ），有人可能将这三者搞混。 其实Rea-ltime-PCR和 qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ）都是指实时定量PCR，即在PCR进行的同时，对其过程进行实时监测，可以对起始模板数量进行精确的分析。并且国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为 qPCR（quantitative real-time PCR）。 RT-PCR的方法已经广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件.目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液,20℃时其pKa值为8.3,△pKa值为-0.021/℃.因此,20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中,pH变化于6.8-7.8之间.改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol/L,pH8.9,有时会增加产量.反应混合液中50mmol/L以内的KCl,pH8.9有利于引物的退火,50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性.有些反应液中以NH+4代K+,其浓度为16.6mmol/L.反应中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助于酶的稳定,反应中加入5mmol/l 的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用,尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时,加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的.

一种PCR反应的化学试剂。PCR缓冲液（Buffer）是一种PCR反应的化学试剂，在PCR实验中起到重要的作用，能够提高PCR反应的效率和特异性。

PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。 反应混合液中50mmol/L以内的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+，其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助于酶的稳定，反应中加入5mmol/l 的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。

PCR实验室超纯水机是用于制备PCR反应体系中所需的超纯水的设备，选购时需要考虑其纯度、稳定性、易操作性以及售后服务等因素。以下是几个比较知名且在PCR实验室领域中比较受欢迎的超纯水机品牌：Millipore（美国米利波尔）：该品牌是生命科学领域的知名品牌，在PCR实验室领域也有着很高的技术实力和产品质量。Sartorius（萨特利斯）：该品牌也是生命科学领域的知名品牌，在PCR实验室超纯水机领域中也有着广泛的应用和良好的口碑。Merck（默克）：默克是一家全球领先的生命科学和高科技公司，其超纯水机产品在PCR实验室中具有良好的性能和可靠的品质。EMD Millipore（美国艾玛迪-米利波尔）：EMD Millipore是默克旗下的一个品牌，其超纯水机产品也在PCR实验室中具有较高的市场份额和用户评价。除了以上几个品牌，还有一些国内外的优秀品牌，如日本Elix（艾力克斯）、德国ELGA和中国Haier（海尔）等。需要根据实际需求选择适合自己的品牌和型号。