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荧光定量pcr仪是怎样测试dna,rna的

荧光定量pcr仪是怎样测试dna,rna的普通的基因扩增仪(PCR仪)只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多,而且运行成本也要低很多。不过不能直接得到扩增结果,还需要做电泳检测。实际中检测遗传疾病,品种分子标记筛选,甚至亲自鉴定等都可以由普通PCR仪完成。但是,某些需要定量的实验就必须用到实时定量PCR了。比如检测某些病原物的数量(血液乙肝病毒复制程度),特定基因的表达量(比如结合反转录做的RNA定量分析),某些基因在染色体组中拷贝数(以前往往使用southern blot技术)等等。荧光定量PRC一般不需要对扩增产物进行电泳分析,操作相对简单些,但是耗材实在是贵。简单来说,看有没有用普通PCR仪,看有多少用荧光定量PCR

实时荧光定量PCR的结果该怎样分析?

看CT值、起始拷贝数、标准偏差等如果是SYBR做的话,再看下溶解曲线

没有溶解曲线的荧光定量pcr

溶解曲线的意思是:当温度高于扩增产物的TM值时,双链产物变单链,荧光值因为这样的变化而产生变化,根据这一原理,你推算你的体系是是否会在温度变化时产生荧光值的变化,比如你用的是TAQMAN探针,taqman探针产生荧光变化的原理是探针被外切酶活性的TAQ酶剪切断而产生的,那么在只有温度变化的情况下,是没有荧光值变化的,自然就没有溶解曲线了。但是假如你用的分子信标探针或者sybgreen燃料,情况就不同了。

荧光定量pcr sg什么意思

sg荧光定量PCR(也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR)是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术, 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的 ,与变通PCR相比,FQ-PCR具有许多优点。 本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简要叙述。

荧光定量pcr为什么比rt-pcr更能反映细胞里的mrna水平

首先我先看看我理解的问题对不对:你说的RT-PCR是指reverse transcription PCR。那么这种PCR属于半定量PCR,它的定量结果只能全部跑完PCR(终点法)以后,通过琼脂糖电泳的方式,观察最终的核酸条带的亮度,来反映mRNA的量。荧光定量PCR(real-time RT-PCR)可以实时监测PCR的扩增过程,通过达到某个荧光阈值的循环数来反映模板(mRNA)的含量,这种方式比终点法的定量更具有准确度度。因为终点法的结果收到更多的因素干扰(如:酶活等因素),即使是同样的模板,可能最终的条带亮度都不一致,但是荧光定量PCR的结果,在PCR循环的前期,收到多种因素的干扰小,更准确的反映模板含量的不同。

为什么荧光定量pcr可以准确定量

为什么荧光定量pcr可以准确定量实时定量的引物设计要求比较高,可以按普通引物设计的方法来做,但是设计时要注意扩增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之间。同时要保证这对引物有绝对的特异性,因为要是产生非特异性扩增的话,就不能准确的计量模板量了,这样就失去了实时定量的意义了用已知浓度的DNA样本(通常是质粒)梯度稀释成一系列的样本。做实验的时候,这些标准品和待测样本加在同样一块96孔盘的不同孔内。一起做PCR。标准品的荧光强度和已知的浓度作图,可以得到一条标准曲线。而待测样本的荧光强度测出以后,就可以在标准曲线上算出样本浓度了。

做荧光定量PCR和半定量PCR有什么区别?半定量的PCR退火温度和荧光定量PCR是一样的吗?

荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料(sybr green)或者和目的DNA片段结合的荧光探针(taqman),通过监控PCR过程中的荧光的变化,并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量.荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时间.半定量RT-PCR则是通过RT-PCR最终产物电泳后电泳条带的明暗来间接反应出原始模板的丰度.荧光定量PCR因为是全程监控PCR扩增的变化,并且能够同管家基因的扩增曲线进行相对定量,而将基因的表达量数值化,准确度高于半定量RT-PCR.半定量RT-PCR因为是监控的最终产物,而在基因表达水平很高的时候,PCR体系很可能在反应中后期就饱和了,所以对于高水平表达的基因来说,用半定量RT-PCR并不能很准确的说明问题.但是如果要发表比较高档次的论文的话,某些变态的老外审稿并不认可单一的荧光定量PCR的结果,他们会同时需要作者做一个半定量RT-PCR来作为辅助证明. 半定量RT-PCR的引物和荧光定量PCR的引物设计原则并不是一样的,换而言之,二者的引物并不是可以通用的.所以退火温度自然是不同的,具体怎么不同,要根据实际用到的引物去算.

荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思

PCR扩增为指数扩增,每一扩增周期后产物的量可以下式表达: Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n 0≤E≤1 其中E表示扩增效率,Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量,Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。 等式仅在限定的扩增周期数(通常为20或30)内成立。超过此周期数,扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率,最终达到平台,不再扩增.

实时荧光定量PCR与化学花光的区别在哪???

原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光。反应要求:荧光定量

荧光定量pcr怎样确定目的基因

概述荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时,Taq酶的5"端-3"端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

实时荧光定量PCR和定量PCR有什么区别

实时荧光定量PCR和定量PCR有什么区别实时荧光是反应荧光数值定量,普通那种是通过条带半定量,现在做半定量的已经很少了,除非是一些验证试验必须要图的

fq-pcr技术用于定量或定性检测病原体核酸需在扩增曲线哪个时期实现

fq-pcr技术用于定量或定性检测病原体核酸需在扩增曲线(指数增长期)实现。实时检测PCR扩增,在扩增的指数期对起始模板进行定量。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值如下图所示。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。PCR扩增时,加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸,两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR 仪检测不到荧光信号。PCR扩增时(在延伸阶段),Taq 酶的 5" - 3" 切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步,这也是定量的基础所在。发展过程:荧光定量PCR最早称TaqMan PCR,后来也叫Real-Time PCR,是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理:随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言,荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段, PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT值(如下图所示)。

什么是实时荧光定量PCR,检测指标是什么?

你要检测什么东西啊?实时荧光定量PCR是检测模板DNA的拷贝数、基因表达量、基因突变等的

为什么要做荧光定量PCR?用最实用的讲法说下,谢谢

检测某个基因的mRNA水平表达量

荧光定量pcr和实时荧光定量pcr还有反转录pcr都是什么呀?有什么区别,分别是什么作用啊?谢谢啊

分别百度下不就知道了前两个是一回事 测mRNA表达量的 第三个只不过是把反转录和pcr放在一个程序里面做了 扩增的

microRNA的荧光定量PCR茎环法和加尾法的引物不同吗

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。|||原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;引物长度,20bp;Tm值可以设置在55度(实验的时候可以用60度退火,两条引物的退火温度不要相差大于2度);产物长度,100-150bp(如果没有合适的引物,产物长度可以设置在80-200)。

在荧光定量PCR中,为什么通常把前15个循环作为荧光本底信号?荧光背景值是哪儿来的?

我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline,基线期),即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍(机器自动设置)。我们在做荧光定量PCR实验时,经常采用手动设置,手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,真正的信号是荧光信号超过域值。

荧光定量pcr和实时荧光定量pcr还有反转录pcr都是什么呀?有什么区别,分别是什么作用啊?

实时就是指每个阶段的荧光都有收集,其实现在所有的荧光定量PCR仪器都是实时的.荧光定量PCR的英文简写是:FQ-PCR,F是荧光的缩写,Q是定量的缩写.(或者写成是RT-PCR.RT就是realtime的缩写). 做定量PCR的目的是为了了解起始模板数的量,这个一下写不清楚,你看一个说明书绝对看得懂. 而反转录PCR就是把mRNA反转录成cDNA,简写也是RT-PCR.不过和上面的不同!这个RT是reverse transcript的缩写! 其实啊,对于做表达量的实验而言,反转录PCR是荧光定量PCR的第一步,很多人是这么来描述的:RT-qPCR.这个RT就是反转录,这个q是指定量. 总之,自己好好看说明书!

荧光定量 PCR 方法:探针法 VS 染料法?

荧光定量 PCR 又称 qPCR,是一项非常常见的分子生物学实验技术。荧光定量 PCR 荧光为基础对核酸进行定量分析,其应用非常广泛,可以用于检测基因的表达量(RNA 的丰度),验证表达谱芯片或转录组测序的数据,确定病原体的载量,对片段的拷贝数(CNV)进行分析,对基因进行分型等等。 大部分研究者主要的应用是对基因的表达量进行测定,其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化,记录检测荧光达到阈值时的循环数(Ct 值)。从理论上说,起始模板量和 Ct 值密切相关,因此我们通过判读 Ct 值从而对样本进行定量。 在进行荧光定量 PCR 时,从技术和产品来说,我们往往会有许多选择,尤其是方法的选择,对最终结果的准确性至关重要。荧光定量 PCR 从方法上来说可以分为染料法和探针法两种。 一、染料法 在国内,染料法一般采用 DNA 染料 SYBRGreenⅠ,染料法使用简单,成本也相对较低,因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。在染料法荧光定量 PCR 实验中,染料能够与双链结合,从而发光,而在游离状态下,SYBR Green I 发出微弱的荧光。所以,一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链 DNA 量呈比列,且会随扩增产物的增加而增加。但是染料法检测的是体系中的所有双链 DNA,因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现,会极大的影响真实结果的准确性。为此,一些厂商提供 ROX 作为内部荧光参考标准,用来校正背景,但是即便如此,染料法特异性的问题依旧无法与探针法相比。另外染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段,对于复杂序列,如果难以扩增的话,也会受到脱靶效应(如引物二聚体)的影响。在这种情况下,就需要在实验前期进行熔解曲线分析,判断扩增所得产物是否只有一种。 二、TaqMan 探针法 TaqMan 探针法 PCR 扩增时,在加入一对扩增引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。Taqman 探针为一段线性的寡核苷酸,两端分别标记一个荧光报告基团(FAM 或 Hex 等)和一个荧光淬灭基团,当探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR 仪检测不到荧光信号;当 PCR 扩增时(在延伸阶段),Taq 酶的 5" -3" 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步,这也就是探针法定量的原理。 探针法与染料法的最大区别在于,理论上探针法中的荧光信号只来源于目标序列,也就是不受非特异性扩增及引物二聚体的影响。除此之外,人们还可以利用不同探针,在一个体系中使用不同的荧光标记同时检测多种指标,达到节省实验成本的目的。在样本量比较大的情况下,成本甚至可以低于染料法。 因此我们可以看到,在选择荧光定量实验时,探针法在特异性和准确性方面远远优于廉价的染料法,但在实际使用时,TaqMan 探针高昂的价格常常让人望而却步。目前,上海捷瑞生物工程有限公司在强大的探针合成能力的前提下,推出了探针法荧光定量 PCR 服务,以染料法的价格,享受探针法的服务,在相同的经费情况下,提高实验的准确性和特异性。

荧光PCR法与PCR荧光探针法有何不同

荧光定量PCR法检测的是SYBR Green掺入到双链DNA中的量。SYBR Green掺入到双链DNA中后会发出荧光。但是只要是双链,它都掺。而探针法是当探针结合到目标序列上以后,聚合酶降解探针后,探针上自带的荧光基团离开淬灭基团,从而发出荧光。从两者的原理上来看,不难判断,荧光PCR法更加简单方便,而且成本低。而探针法特异性更强。

请问:做荧光定量PCR时,△△Ct值是什么意思,它的计算公式是什么?

△△Ct是荧光定量计算公式的简化形式,用于比较不同样品之间的差别或变化比率。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgXu2080+lgN/lg(1+Ex),其中,n为扩增反应的循环次数,Xu2080为初始模板量,Ex为扩增效率,N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。△Ct(n)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);△△CT(n)=△Ct(n)-△Ct(1)。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。扩展资料荧光定量PCR的原理:荧光定量PCR技术:在PCR反应体系中加入荧光基团,通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程,然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中,对全程PCR扩增过程进行实时检测,根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I法和Tag Man探针法。Ct值:C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。参考资料来源:百度百科-荧光定量PCR参考资料来源:百度百科-实时荧光定量PCR

普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别

实时定量的引物设计要求比较高,可以按普通引物设计的方法来做,但是设计时要注意扩增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之间。同时要保证这对引物有绝对的特异性,因为要是产生非特异性扩增的话,就不能准确的计量模板量了,这样就失去了实时定...

taqman 荧光 pcr 检测技术和实时荧光定量pcr技术的区别

原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光.反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段.如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳.结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行.荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的.如果还不清楚建议去丁香园等网站逛逛,希望可以帮到你

请问:做荧光定量PCR时,△△Ct值是什么意思,它的计算公式是什么?

我这边有关于△△Ct法的相关文献以及推导公式,方便的话可以给我留一下你的邮箱

实时荧光定量pcr内参是什么东西

如果对内参要求很高的话,可以筛选合适内参,有免费的软件,比如geNorm,normfinder等

荧光定量PCR仪中检测通道的激发光都是靠滤波片来完成的,假如光源为卤钨灯,求滤波片的工作原理

不同的激发光需要不同的滤波片,光源一般为氙灯或汞灯(光电转移效率高),卤素灯是用于明视场照明使用的(发热量高,产生的光子能量弱,对细胞没什么损伤,但不足以激发荧光)

什么是实时荧光定量pcr

实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

一个目的基因在质粒上,如何将其扩增出来并做实时荧光定量PCR?

引物当然要有酶切位点啦,这个是必要的,还需要有保护碱基还有和目的基因对应的差不多有20个碱基

荧光定量PCR与普通PCR相比有哪些不同?.生意经求助

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。|||原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光。反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳。结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的。|||这个还真不大清楚|||貌似前者是定量,后者属于半定量。|||简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人讲过普通PCR后,通过电泳也可以进行定量,其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。|||引物设计是sybr定量PCR法的最大难点,机会好的话,设计一对引物就能得到很好的结果,机会不好的话7、8对引物也出不来,我就遇到过这样的问题,我在prime5.0上设计了8对引物,符合实验要求的一对也没有,我把退火温度提高到了68度也没能把引物二聚体搞定,后来我想通了,可能我这对引物把其它序列扩增出来了,而且扩增效率很高(我一个同学设计了十几对才找到一对好用的)。记住primer5.0设计出来的100%好的引物,到了定量PCR上不一定好使,这是我最大的经验。定量pCR的引物对匹配度要求不高,我现在使用的引物就有几个碱基不匹配,但实验结果很好。有一个办法可以帮助我们绕过引物设计这道坎,直接到罗氏网站上专区上找引物。罗氏网站在线有一个引物设计软件,你只要找好你目的基因的种属,输入你的片段序列就可以得到你要的引物。这个软件有很大的好处,他会自动地把你的种属序列背景扣除,最大限度地去除引物二聚体产生的可以。

PCR和实时荧光定量PCR这两种有什么区别?

PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5"-3")的方向合成互补链。(来自百度百科)实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。(来自百度百科)普通PCR和实时荧光定量PCR的不同,是不同在实时荧光定量PCR的系统中加入了荧光染料(SYBR Green 或Taqman 探针等等)。以SYBR Green为例,这种染料可以结合在双链的DNA上,当PCR不断进行时,每一次退火生成的双链DNA也在增加,荧光染料结合也越多,荧光也越强。在机器中有一个探测荧光的探头,可以定量检测荧光的强度,转换成数值。这样就可以实时记录反映体系中DNA的反应情况。

荧光定量pcr是检查什么

荧光定量pcr是检查支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。 实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

反转录PCR和荧光定量PCR

单独做荧光定量PCR就够了。反转录PCR只能叫半定量。非常精准的定量方法还是实时荧光定量PCR。通过荧光强度实时监测产物产生量的变化。

荧光定量pcr技术是检查什么

妇科的荧光定量检查,它主要是用于支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。常常需要用专门的药敏试验来确诊敏感药物,然后再选择敏感药物对症治疗。如果女性朋友对相应的药物敏感,可以选择相应的进行口服。 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。

力康普通pcr仪和荧光定量PCR有什么区别?

二者结果相同。都能说明生物体外的特殊DNA复制的整个过程的扩增效率和溶解温度情况。区别:1、二者系统组成不同荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。2、二者原理不同荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光,普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终产物量。3、二者反应要求不同荧光定量PCR对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp,普通PCR可以扩增长点的片段。4、二者应用不同荧光定量PCR主要是用来定量分析和确定基因转录水平的,普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段,定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作,反之不行。5、二者测量成本不同定量PCR仪价格较为昂贵,普通的基因扩增仪(PCR仪)只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多,而且运行成本也要低很多。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。

实时荧光定量PCR与普通PCR的区别是什么?结果有何异同?能说明的问题是什么?

所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行“定量分析”的方法。记住,实时荧光定量是定量分析

PCR,RT-PCR,实时荧光定量PCR的区别与联系

你所说的PCR应该就是最常规的PCR,以DNA为模板,通过上下游引物,实现DNA的扩增RT-PCR一般情况下是指反转录PCR(reverse transcription),尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也(realtime fluores-cence quantitative PCR)也简称RT-PCR,但是我觉得这是不对的,不推荐。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录,然后将所获得的cDNA作为模板,设计引物进行扩增,是一种检测基因表达的常用方法。实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR,原理有点多,请自行百度百科,其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。至于三者的关系,RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR,在RNA实验中,这二者都会应用到。例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异,首先你要提取2个组织的总RNA,然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达,然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异

荧光pcr法是什么?

一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。技术原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中。在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

荧光定量pcr技术是检查什么

  妇科的荧光定量检查,它主要是用于支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。常常需要用专门的药敏试验来确诊敏感药物,然后再选择敏感药物对症治疗。如果女性朋友对相应的药物敏感,可以选择相应的进行口服。   实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。

实时荧光定量PCR技术原理是什么?

聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析,分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行, PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。生物帮上面有相关知识, http://www.bio1000.com/zt/cell/201378.html 动物细胞培养, 植物细胞培养, ES细胞(胚胎干细胞)培养, 细胞悬浮培养, 贴壁细胞培养。

荧光定量pcr为什么能够测基因表达差异

概述荧光定量pcr(realtimefluorescencequantitativepcr,rtfqpcr)是1996年由美国appliedbiosystems公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对pcr产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。原理pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时,探针结合在dna任意一条单链上;pcr扩增时,taq酶的5"端-3"端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条dna链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。

荧光定量PCR用10ul反应成吗

荧光定量PCR用10ul反应成荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。|||原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光。反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳。结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的。|||这个还真不大清楚|||貌似前者是定量,后者属于半定量。|||简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人讲过普通PCR后,通过电泳也可以进行定量,其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。|||引物设计是sybr定量PCR法的最大难点,机会好的话,设计一对引物就能得到很好的结果,机会不好的话7、8对引物也出不来,我就遇到过这样的问题,我在prime5.0上设计了8对引物,符合实验要求的一对也没有,我把退火温度提高到了68度也没能把引物二聚体搞定,后来我想通了,可能我这对引物把其它序列扩增出来了,而且扩增效率很高(我一个同学设计了十几对才找到一对好用的)。记住primer5.0设计出来的100%好的引物,到了定量PCR上不一定好使,这是我最大的经验。定量pCR的引物对匹配度要求不高,我现在使用的引物就有几个碱基不匹配,但实验结果很好。有一个办法可以帮助我们绕过引物设计这道坎,直接到罗氏网站上专区上找引物。罗氏网站在线有一个引物设计软件,你只要找好你目的基因的种属,输入你的片段序列就可以得到你要的引物。这个软件有很大的好处,他会自动地把你的种属序列背景扣除,最大限度地去除引物二聚体产生的可以。

PCR和实时荧光定量PCR这两种有什么区别

原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光.反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段.如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳.结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行.荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的.如果还不清楚建议去丁香园等网站逛逛,希望可以帮到你

rtpcr和实时荧光定量pcr区别是什么?

rtpcr和实时荧光定量pcr区别就是过程不同,具体如下:RT-PCR一般情况下是指反转录PCR。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录,然后将所获得的cDNA作为模板,设计引物进行扩增,是一种检测基因表达的常用方法。实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR,Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。PCR原理:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。

恒温PCR和实时荧光定量PCR这两种有什么区别?哪个更有优势?

实时荧光PCR方法灵敏度略高于恒温PCR,但仪器昂贵,试剂消耗也相对更贵,适合向高端客户推广;恒温PCR大部分性能与实时荧光PCR相对,灵敏度稍低于实时荧光PCR,但仪器性价比高,更利于推广。实际推广中对高端客户可以采取用恒温PCR作为契机,在交流中如客户对灵敏度有高要求而又有一定实力的可推荐使用实时荧光PCR产品。

探针法荧光定量PCR

荧光定量PCR法检测的是SYBR Green掺入到双链DNA中的量。SYBR Green掺入到双链DNA中后会发出荧光。但是只要是双链,它都掺。而探针法是当探针结合到目标序列上以后,聚合酶降解探针后,探针上自带的荧光基团离开淬灭基团,从而发出荧光。从两者的原理上来看,不难判断,荧光PCR法更加简单方便,而且成本低。而探针法特异性更强。所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的,因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率,这意味着每次循环中,体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定,那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。如果扩增子的二级结构不能避免,则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中,我们要进行BLAST和类似的分析,以确保特异性。

rtpcr和实时荧光定量pcr区别是什么?

rtpcr和实时荧光定量pcr区别如下:1、所说的PCR应该就是最常规的PCR,以DNA为模板,通过上下游引物,实现DNA的扩增。2、RT-PCR一般情况下是指反转录PCR(reverse transcription),尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也(realtime fluores-cence quantitative PCR)也简称RT-PCR,但是这是不对的,不推荐。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录,然后将所获得的cDNA作为模板,设计引物进行扩增,是一种检测基因表达的常用方法。3、实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR,其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。至于三者的关系,RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR,在RNA实验中,这二者都会应用到。例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异,首先你要提取2个组织的总RNA,然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达,然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异。PCR原理:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。

荧光定量PCR对初始模板量进行定量分析的原理是什么?

基于以下的理论. 1.每一个循环都会扩增一倍 2.引物扩增的效率一致 所以,如果结果X循环,产物得到了2的X次方.如果起始模板只有一半量,那产物就是2的(x-1)次方.如果起始模板的量是一倍,那产物就是2的(x+1)次方,以此类推. 只要在产物指数增加的阶段测量扩增曲线,就可以计算出起始模板的量

荧光定量pcr对基因进行定量分析的原理是什么?有哪些应用

假如模板分子有一个,那么经过一轮pcr,就变成2个,这两个经过又一轮pcr,变成了4个,依次……,发现经过40轮,变成了2的40次方个,伴随着每轮pcr有荧光探针的水解,根据荧光情况判断原始产量,推算初始模板量。

荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思

PCR原理中,反应一个循环,PCR产物扩增一倍,即为之前的2倍.……反应N个循环,理论上应为原来的2的N次方.此时,理论的扩增效率是100%,即1. 但实际上,由于酶,dNTPs,引物,模板等因素,扩增效率达不到100%. 因此,我们就要做标准曲线,看实际的扩增效率是多少,也就是标准曲线的斜率.理论上100%的扩增效率,换算出来的斜率是-3.32.

什么是荧光PCR检测?是用荧光标记基因吗?一直不明白,蛋白可以发光,怎么标记基因能发光呢

想想萤火虫吧,它为什么能发光?它身上不可能有灯泡吧。那就是荧光蛋白。很多蛋白在紫外光激发下都能产生荧光的,这是物理中吸收能量,释放能量的过程。至于荧光PCR检测。如楼上几位所说的,就是用荧光基团嵌合到DNA中,根据荧光的亮度判断DNA的量,从而达到一种定量的检测。

什么是实时荧光定量PCR?有什么作用?请详细说明。

好多生物工作做广告做培训噢。你怎么不去看一下。

探针法pcr,为什么初始本底荧光很强

荧光定量PCR法检测的是SYBR Green掺入到双链DNA中的量。SYBR Green掺入到双链DNA中后会发出荧光。但是只要是双链,它都掺。而探针法是当探针结合到目标序列上以后,聚合酶降解探针后,探针上自带的荧光基团离开淬灭基团,从而发出荧光。从两者的原理上来看,不难判断,荧光PCR法更加简单方便,而且成本低。而探针法特异性更强。

PCR的原理是什么 的原理是什么,它有什么用途

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶(DNA polymerase I)最早于1955年发现 ,而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌(Thermus aquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的 酶,但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的,Dr. Mullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 [PCR原理][编辑本段]DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。

实时定量PCR的结果是怎样分析的

BIOGHSC Super Probe Kit在20ul的反应体系里,只要有几个拷贝的DNA分子就能被检测出来,具有非常强的抗干扰能力,能够对土壤、粪便、肿瘤和血液来源的复杂样本中的靶基因进行检测分析,适合探针法定量PCR检测,试剂以预混液的形式包装,使用极其方便。

荧光定量PCR中分子信标技术的原理? fgege

分子信标是一段呈茎环结构的寡核苷酸探针,中间的环序列与目标核酸序列互补,茎的两端分别连的荧光分子和猝灭分子,如下图: 当无目标核酸序列时,荧光分子和猝灭分子距离近,荧光分子发出的能量被猝灭分子吸收并以热能消耗,不发荧光;当有目标核酸序列时,中间的环序列与目标核酸序列结合,荧光分子和猝灭分子距离远,此刻猝灭分子不能吸收荧光分子的能量,可以检测到荧光. 大概原理就这样,分子信标技术属于RT-PCR中的荧光探针,详细的原理和技术应用变化找几篇文献看看吧. 觉得可以别忘了给最佳答案哈,还有疑问就追问或者百度HI我,都OK!

荧光定量PCR为什么先提RNA

可以看一下荧光定量PCR 的原理。http://www.majorbio.com/Products/Real_Time_PCR

实时荧光定量PCR与普通PCR的区别是什么?结果有何异同?能说明的问题是什么?

二者结果相同。都能说明生物体外的特殊DNA复制的整个过程的扩增效率和溶解温度情况。区别:1、二者系统组成不同荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。2、二者原理不同荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光,普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终产物量。3、二者反应要求不同荧光定量PCR对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp,普通PCR可以扩增长点的片段。4、二者应用不同荧光定量PCR主要是用来定量分析和确定基因转录水平的,普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段,定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作,反之不行。5、二者测量成本不同定量PCR仪价格较为昂贵,普通的基因扩增仪(PCR仪)只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多,而且运行成本也要低很多。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。参考资料来源:百度百科-实时荧光定量PCR参考资料来源:百度百科-PCR

什么是荧光PCR检测?是用荧光标记基因吗?一直不明白,蛋白可以发光,怎么标记基因能发光呢

荧光定量pcr会加入带有荧光基团的探针,探针是能和目的基因结合的单链dna,如果合成双链dna后,荧光基团就会激活发光,所以实时检测反应物的荧光强度,反应的就是双链dna的浓度,由于合成双链dna的速率和模板浓度有关,所以和参考曲线比较以后是可以计算出模板的相对浓度,当模板是信号rna是,其反应的就是基因发达的量。

荧光定量pcr是检查什么

  荧光定量pcr是检查支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。   实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。   Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

荧光定量pcr技术是检查什么

妇科的荧光定量检查,它主要是用于支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。常常需要用专门的药敏试验来确诊敏感药物,然后再选择敏感药物对症治疗。如果女性朋友对相应的药物敏感,可以选择相应的进行口服。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。

荧光PCR技术的原理是什么?

http://baike.baidu.com/view/1478017.htm

简述定量PCR的原理和过程

引物,四种脱氧核糖核苷酸,DNA序列,耐高温的DNA聚合酶额额额原理啊 啊,就是碱基互补配对原则把,,55555

荧光定量pcr

荧光定量pcr(也称taqmanpcr,以下简称fq-pcr)是美国pe(perkinelmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术,该技术是在常规pcr基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的,与变通pcr相比,fq-pcr具有许多优点。

荧光定量PCR(一)— 基础介绍

当有入射光照射物质时,其分子会吸收入射光的能量从而受到激发使得其电子由低能级跃迁至高能级,此时处于激发态的分子其结构并不稳定,会通过跃迁而失去能量返回基态,这个过程会伴随着荧光或者磷光的产生。如图所示 所有荧光物质都具有两个特征光谱,也即激发和发射光谱。 通常情况下,物质的发射光波长总是大于其激发光波长,这是因为,物质在收到激发的过程中,存在着一定的能量损失。激发和发射光波长的差值称之为斯托克位移。 荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或者化学作用过程 荧光淬灭的形式很多,机理也比较复杂。主要有如下几种类型 荧光定量PCR技术是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。为了达到高效反应,应将实时PCR应用的引物设计为能生成短的扩增子。常用的方法有SYBR Green的荧光染料法和TaqMan探针法,两种方法的特点及应用如下表: 由于目前不同荧光定量PCR仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异,因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择(探针法可连接我们的荧光定量PCR试剂盒的编号及对应的机器型号) 由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes),或称"TaqMan"探针,用于Real Time PCR实验。由于这些淬灭染料的光谱学性质不同(见下图),作为淬灭基团使用时的特点也不同,现说明如下:

概述荧光定量PCR技术的原理。

又称实时PCR技术。该技术在常规PCR基础上,添加了一条标有两个荧光基团的荧光双标记探针,一个标记在探针的5u2032端称为报告基团(Reporter,R);另一个标记在探针的3u2032端称为荧光抑制基团或称淬灭基团(Quencher,Q)。两者可构成能量传递结构,即5u2032端R发出的荧光信号可被3u2032端R基团抑制。3u2032端的-OH已被封闭,不具有延伸的能力。探针引物在无特异性PCR扩增时,荧光信号不改变。在PCR反应开始后,随着链的延长,荧光定量PCR的Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合部位,发挥它的5u2032-3u2032外切酶活性,将荧光探针切断。一但切断,Q基团的抑制作用消失,从而引起R基团的荧光信号增长,被释放的游离R基团的数目和PCR产物的数量是一对一的关系,因此R基团的荧光信号的强弱就与PCR产物的数量成正比关系。测定出前者就可以推算出后者。这就是荧光定量PCR的原理。在PCR的过程中,连续不断地检测反应体系中的荧光信号的变化,当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和标准差,计算出99.7%的置信度大于平均值的荧光值,即阈值),此时循环次数(ct)就被记录下来,该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系,利用阳性梯度标准品的ct值,制成标准曲线,再根据样品的ct值就可以准确定出起始DNA的拷贝数。

荧光定量PCR(FQ-PCR)的原理和优点是什么

博凌科为-为你解答:荧光定量PCR:融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和荧光 淬灭基团),结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术。主要原理是在待扩增区域结合上DNA探针,PCR过程中,具有53外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时,将DNA探针逐个降解,释放出荧 光报告基团,这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系,可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。荧光定量PCR的优点: 1.可进行准确的定量检测。用于基因诊断。 2.定量范围宽。 3.特异性更强,克服了假阳性。 4.操作简单快速,无须后处理和电泳检测。 5.安全,技术易于学习,易于进行电脑化数据管理。

荧光pcr法是什么?

荧光pcr法是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。也叫实时荧光定量PCR技术。荧光-PCR法技术原理:将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中。在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

荧光定量pcr原理

荧光定量PCR原理:随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。荧光定量PCR最早称TaqMan PCR,后来也叫Real-Time PCR,是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的一般而言,荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段, PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT值。荧光域值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍,即threshold。Ct 值:是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系:研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值如下图所示。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光定量检测荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术(分子信标技术,以美国人Tagyi为代表)、 TaqMan探针(以美国ABI公司为代表)和FRET技术(以罗氏公司为代表)等;荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料,非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ;饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。嵌合荧光染料法(SYBR GreenⅠ)SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料,与双链DNA非特异性结合。在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合,其荧光增加1000倍。所以,一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列,且会随扩增产物的增加而增加。

荧光定量pcr原理

荧光定量pcr原理如下:荧光定量PCR(Real-time PCR),是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团,通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以探针法荧光定量PCR为例:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时,探针完整地结合在DNA任意一条单链上,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,检测不到荧光信号;PCR扩增时,Taq酶将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。传统的PCR进行检测时,扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离,并且只能作定性分析,不能准确定量,易造成污染出现假阳性,使其应用受到限制。实时定量PCR技术不仅实现了对模板的定量,且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点,使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即是基线,这条线是可以自动生成也可以手动设置的。之后反应会进入指数增长期,这个期间扩增曲线具有高度重复性,在该期间,可设定一条荧光阈值线,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般会将荧光阈值的缺省设置是3—15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值,这个值与起始浓度的对数成线性关系,且该值具有重现性。Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量,此时就有两个概念容易被提及,那就是绝对定量和相对定量,绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。Ct值诚然可以被利用来计算这两种定量结果,但是绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线。绝对标准品制作困难难以获取,实验室基本都是选择相对定量的方法来计算相对基因表达量。

怎么找c-myc的pcr引物设计

首先要查找序列可以用软件设计,primer5,primer6,primer express,beacon design等也可以用在线的引物设计软件,在百度搜索primer3,会有引物设计的网站

二代测序和pcr检测哪个简单

二代测序。二代测序是对第一代测序技术的划时代变革的核心。即通过引物来定位核酸信息,技术平台有AppliedBiosystems/SOLiDsystem。以上技术平台所运用的测序原理均为循环微阵列法。

pcr所有样本出现阈值错误

通常QPCR实验中CT值的异常主要有以下几种情况: 一、扩增曲线正常,CT值偏大或偏小从CT值表达公式中我们可以看出初始模板的质量和扩增效率,会直接影响到CT值的大小。 如果扩增起始模板量浓度高或引物设计不合适那么所用的循环数就会小,即出现Ct值过小;反之,起始模板量浓度过低,Ct值会偏大。 PCR扩增效率与 CT 值也是成反比关系,扩增效率高则CT值小,扩增效率低则需要要用到的循环数增加所对应的CT值也会偏高。另外,合理的引物设计,防污染试剂的应用也会影响到CT值的大小。二、 有扩增曲线,但却没有CT值,CT值显示状态为Undetermined这种情况下你通常也会发现由于阀值位置不

QPCR中标准品与待测物质的关系

同为参考物质。一般而言,检验工作中使用的标准品属应用标准。将符合质量标准的纯品使用称量法和容量法配制成溶液。用决定性方法反复测定,结果在规定的范围内属合格。而待测物质则是还未精确测量的物质。

CHIP-qPCR/CHIP-Seq,哪个更好做

随着学科的发展,目前许多研究都涉及高通量数据分析 (high throughput data analysis)。比较常见的是测序结果分析,例如RNA-seq、CHIP等等。 众所周知,数据分析是高通量测序应用于生物研究最关键的步骤,分析不好,得到的海量数据无异于一堆垃。

QPCR运行过程中仪器和电脑卡住了

可以尝试重启仪器。如果重启失败可以联系工程师。即时聚合酶链锁反应(Real-time polymerase Chain Reaction,简称 Real-time PCR、即时PCR),又称定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,简称 Q-PCR/QPCR/qrt-PCR、定量即时PCR、即时定量PCR),是一种在DNA扩增反应中,以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法。定量即时PCR及定量反转录PCR(quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)已被众多科学家采用,因为其侦测范围广、灵敏度高、准确、专一及快速。qPCR的发展因为侦测感染病患的病毒或细菌量、癌症监测、诊断个别基因差异的用药反应等应用而大幅提高。qPCR的方法是基于侦测目标物在反应前及PCR后产物的量化关系。相对于终端PCR方式(end-point PCR,传统的PCR配合凝胶电泳,在反应后侦测)qPCR有许多优点。其结果可以较快取得且稳定,因为是采用非常敏感的化学萤光,而且不需要在PCR反应后的侦测步骤。此外,因为反应后不需打开管子而减少了操作污染。qPCR分析亦适于更具挑战性的应用,如多重侦测与高通量分析。

不同小鼠qpcr结果怎么趋势都不一样那怎么看结果

不同小鼠qpcr结果怎么趋势都不一样那怎么看结果曲线,是微分几何学研究的主要对象之一。直观上,曲线可看成空间质点运动的轨迹。微分几何就是利用微积分来研究几何的学科。为了能够应用微积分的知识,我们不能考虑一切曲线,甚至不能考虑连续曲线,因为连续不一定可微。这就要我们考虑可微曲线。但是可微曲线也是不太好的,因为可能存在某些曲线,在某点切线的方向不是确定的,这就使得我们无法从切线开始入手,这就需要我们来研究导数处处不为零的这一类曲线,我们称它们为正则曲线。正则曲线才是经典曲线论的主要研究对象。

RTQPCR所需时间

一般1-2天出结果。定量逆转录PCR是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中,总RNA或信使RNA(mRNA)首先通过逆转录酶转录成互补DNA(cDNA)。随后,以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中,其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

qpcr仪关闭 之前数据找回

qpcr仪关闭之前数据找回,方法如下:1、要想恢复未保存的qpcr仪器的文档,首先要做的事情就是开启qpcr仪器的文件自动保存文档功能,且将保存文档时间间隔设置小一些,这样就可以最大化避免文档内容的丢失。具体操作方法:点击“Office按钮”,从其扩展菜单中选择“qpcr仪器的文件选项”。2、在打开的“qpcr仪器的文件选项”窗口中,切换到“保存”选项卡,勾选“保存自动恢复信息时间间隔”项,同时设置时间间隔,在此小编设置为“3分钟”,可以根据实际情况来进行设置。3、设置“自动恢复文档位置”,建议使用自定义位置,这样方便因非法操作或断电时及时恢复文件。点击“浏览”按钮就可以定位到自定义位置。点击“确定”完成设置。4、以后当编辑文档时,必须确保至少保存一次,原因在于通过首次保存可以确定文档名称,这样就为qpcr仪器的文件的恢复操作坚定了基础。5、最后来测试一下:创建一个新的qpcr仪器的文件,输入部分内容,点击“保存”或“另存为”将该文档进行保存。6、接下来再输入一些内容,并等待“时间间隔”所设置的最小时间,即等待3分钟以上。7、然后模拟断电或程序非法操作而退出:右击任务栏,选择“启用任务管理器”。8、在打开的“Windows任务管理器”窗口中,切换至“应用程序”选项卡,选中当前正常编辑的qpcr仪器的文件,点击“任务结束”按钮。9、然后再次打开之前保存的文档,则会自动弹出“文档恢复”窗口,点击要恢复的文档,就会发现丢失的内容被找回来啦。10、当然,也可以通过之前所设置的“Excel文件自动恢复”目录中恢复未保存的文档。找到要恢复的文档,直接使用qpcr仪器程序打开即可。

qpcr和ddpcr基因检测的区别

数字PCR因为灵敏度高、绝对定量、适合医院操作等优点,在肿瘤液体活检、无创产前筛查、感染性疾病早期诊断等临床应用方面具有显著优势。而qPCR适用于较常规的临床分子诊断项目。瞬渺光电为您的PCR仪器光路部分提供更低噪声稳定型激光,为仪器带来更好的表现,详询payne@rayscience.com

qpcr一般做多长时间

1-2天。定量逆转录PCR是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法,所需要的时间会长一些能达到1~2天,确保实验效果更加准确。
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