扩增4kb的基因怎么设计引物
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dan_nad 共回答了16个问题
|采纳率93.8%- 去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛?>>> 如果你是直接从DNA中克隆基因的话,设计一对引物,用高保真的Phusion或者Vent酶就可以.NEB的产品很不错.
如果你要从cDNA中克隆的话,考虑到RNA的降解,你不能使用一对引物来克隆.而是设计两对或者多对引物.比如,你你针对序列这几两对引物,前一对引物的下游,和后一对引物的上游,应该设计15个bp的重合.前一对引物的上游和后一对引物的下游则位于整个4kb基因的首位两段.
这样,你用这两对引物先克隆出4kb基因的两个短片段.然后将两个短片段作为模板,以前一对引物的上游引物,和下一对引物的下游引物来在一个PCR反应体系中扩增,获得4kb的全片段.、
如果你要设计多对引物,方法类似,都是上一段的下游和下一段的上游有十几个bp的重合
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补充一下,如果你是从基因组中直接克隆的话,那就是设计一对引物.使用高保真的聚合酶做long PCR,目前的Phusion Taq酶对于4kb的片段是没什么问题的.我自己曾经尝试克隆过3kb的片段,非常的清晰,没有任何拖带.但是成功的关键在于你要设计特异性的引物,建议你设计30-50个bp左右的引物(引物越长,对模板的特异性要求越高),提高退火温度,来保证引物的特异性.
此外,加长PCR程序中的变性时间,来保证基因组DNA的完全接连,适度延长退火时间,加大引物使用的量,来保证引物和模板的结合.毕竟你是从整个基因组中寻找你的目的基因. - 1年前
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sinbad9000 共回答了16个问题
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第三泳道:marker、 第四、五泳道:第二轮扩增的阳性对照
第六泳道:用第一轮扩增的阴性对照产物做的模板,按理说不应该有那个100bp的抹带.如果是非特那4、5泳道却没有.引物二聚体也不应该有100bp大吧~
这个是什么,应该怎么消除
七潜1年前2
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漂流的孤独心 共回答了21个问题
|采纳率76.2%第六道的条带并不是扩增产物.
在进行第二轮扩增的时候,需要把第一轮的产物稀释至少100倍在扩增.1年前查看全部
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zingsun1年前2
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专上看书网他娘 共回答了16个问题
|采纳率100%cDNA1年前查看全部
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清醒纪04071年前3
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yorkduan 共回答了15个问题
|采纳率80%DNA marker是用来初步估算你扩增的DNA大小的.电泳时使用,一般加到扩增产物相邻的电泳孔内电泳.Marker大小一般要求有与扩增DNA分子大小相近.比如,如果扩增片段为1kb,则marker中最好有1kb左右的分子,如果扩增产物为3kb,则需要用有3kb大小的marker.1年前查看全部
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zy23120792 共回答了18个问题
|采纳率88.9%根据引物的Tm值来算,一般来说低于Tm值5℃.
当然最好还是做一个梯度试一下.1年前查看全部
- 为什么用pcr技术扩增目的基因不是用含碱基的核苷酸而是用引物,引物是什么东东,我高中的不要说的太复杂
o2jam101年前1
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黄子豪 共回答了18个问题
|采纳率88.9%首先,我们来说一下PCR技术所用的酶.所用的酶是Taq DNA聚合酶,现在已知的所有的DNA聚合酶在使单个的脱氧核苷酸聚合的时候都有一个共性,它无法从头开始,只能在一段序列的末尾续接.在生物体内DNA自行复制的时候也是如此,只不过那个引物是生物体内RNA聚合酶合成的一段RNA,在PCR的时候引物是人们合成的一段DNA.PCR技术大致有三步:第一步94°C使DNA变性,双链变单链;第二步65°C退火;第三步72°C延伸 依次循环.Taq DNA聚合酶是从极端微生物体内提取的,可以耐受高温,所以用它.说到引物,就可以说说一些在引物上做文章的技术.定点突变技术,在PCR的时候把引物的某一个核苷酸换成需要的突变核苷酸,PCR之后的产物就是在人为突变引物的后面续接而成的,就可以得到突变的目的DNA.这里只是举一个典型例子,具体的在你今后学《分子生物学》和《生物化学》会逐步学到.1年前查看全部
- 老师,我想做标准曲线验证一下扩增效率,知道rna的浓度,怎么换算成拷贝数,有人说起码要知道bp数,
老师,我想做标准曲线验证一下扩增效率,知道rna的浓度,怎么换算成拷贝数,有人说起码要知道bp数,
我又不是做的质粒,就是提取标本的rna,然后想倍比稀释做一下曲线,这个bp又是谁的bp呢,ABI7300的标准品要输入拷贝数,我输入RNA的浓度可以吗haojun20011年前1
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西风野狼 共回答了22个问题
|采纳率90.9%你这个情况不需要知道拷贝数目.把样品等比例稀释,比如1:4,或者1:10. 至少做4-5个点.PCR后按照相对浓度和扩增的Ct值做曲线,就可以得到扩增效率了.
如果要知道拷贝数目,必须有已知浓度的含有该序列的质粒来作为批准品做标准曲线.1年前查看全部
- PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,其基本原理和过程与细胞内DNA的复制类似.下列关于两者共同点的叙述,不正确的是
PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,其基本原理和过程与细胞内DNA的复制类似.下列关于两者共同点的叙述,不正确的是( )
①边解旋边复制
②遵循碱基互补配对原则
③需要引物
④过程可分为变性、复性、延伸等步骤.
A.①⑦
B.⑦③
C.③④
D.①④3713305411年前1
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一叶飘香80 共回答了14个问题
|采纳率92.9%解题思路:PCR是体外扩增DNA的技术,该反应需要在一定的缓冲液中才能进行,需要提供:DNA模板,分别于两条模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行.PCR过程可分为变性、复性、延伸等步骤.①PCR反应和体内DNA复制都是边解旋边复制,故①正确;
②PCR反应和体内DNA复制都遵循碱基互补配对原则,故②正确;
③PCR反应需要引物,但体内DNA复制不需要引物,故③错误;
④PCR过程可分为变性、复性、延伸等步骤,而体内DNA复制没有这些步骤,故④错误.
故选C.点评:
本题考点: 用DNA片段进行PCR扩增.
考点点评: 本题考查PCR技术与体内DNA复制的比较,意在考查考生的识记能力和理解所学知识要点,把握知识间内在联系,形成知识网络结构的能力;能运用所学知识要点,准确判断问题的能力.1年前查看全部
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RA2000 共回答了20个问题
|采纳率95%RAPD,即随机扩增多态性DNA技术:既然是随机引物,那么他在整个基因组中都有结合位点,当然结合也是随机的,只要能够互补上去都能够扩增出条带,经电泳检测变可以检出1年前查看全部
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在基因工程中,把选出的目的基因(共1000个脱氧核苷酸对,其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个)放入DNA扩增仪中扩增4代,那么,在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是( )
A. 540个
B. 8100个
C. 17280个
D. 7560个qiujiayuantysq1年前2
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菜子地 共回答了22个问题
|采纳率86.4%解题思路:计算DNA分子复制过程中需要的某种游离的脱氧核糖核苷酸数量,先根据DNA分子的碱基互补配对原则计算出DNA分子中该脱氧核糖核苷酸的数量,然后用DNA该脱氧核糖核苷酸的数量乘以增加的DNA分子数.解;由题意知,目的基因含有1000个碱基对,即2000个脱氧核糖核苷酸,其中腺嘌呤脱氧核糖核苷酸为460个,那么该DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸=(2000-460×2)÷2=540个,DNA扩增仪中扩增4代,在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是(24-1)×540=8100个.
故选:B.点评:
本题考点: DNA分子的复制;DNA分子结构的主要特点.
考点点评: 对于DNA分子复制过程和碱基互补配对原则的综合应用是解题的关键.1年前查看全部
- PCR技术能扩增血液中的病毒核酸吗?
pcr技术能扩增血液中的病毒核酸吗?
若要检测一个人是否患***,可以用pcr技术扩增血液中的什么?
a白细胞dna b病毒蛋白质 c血浆抗体 d病毒核酸
难道pcr技术可以直接扩增hiv病毒?大家知道hiv病毒是rna病毒.大家一起学.szyhdavis1年前4
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bgbg123 共回答了13个问题
|采纳率92.3%普通PCR:RNA病毒的扩增是要经过逆转录的,把RNA转录为DNA,然后通过引物结合,PCR扩增,在电泳跑胶看条带得到结果!
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malan868 共回答了11个问题
|采纳率90.9%应该可以,CT只是和你初始的mRNA表达量有关,当然的是在各种酶和原料充足的的情况下,和循环次数没什么关系 不过有问题的就是你的荧光蛋白发光会受到温度影响的,你只能大概的比较下,表达量大的话还好,如果差异小的,建议重新做一下1年前查看全部
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紫蝶_漂雪1年前1
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爱的泡泡 共回答了13个问题
|采纳率100%PCR技术过程简介
1.将目的基因与引物,以及耐高温的DNA聚合酶加入PCR扩增仪中.加热到90~95℃.让目的基因解旋.
2.降温至55~60℃,让引物与①中的DNA单链结合.
3.加热至70~75℃,让耐高温的DNA聚合酶工作,大量扩增目的基因.1年前查看全部
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划盘子后剩余的菌液提质粒测序结果与预期的片段相同,通用引物和自身引物开始都能得出很亮的带,而且质粒酶切后切成两段,也与预期结果相同大小,PCR的阳性对照出现正确结果,目的片段与载体脱离还是保留的菌种失活?h寒羽良h1年前3
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fenbad 共回答了17个问题
|采纳率88.2%如果你确认 “转化后挑取含有目的片段的单菌落”这个步骤正确的话,就是你的PCR出问题了么,继续扩增便可.
目的片段与载体脱离还是保留的菌种失活? 应该都不会.我认为你的PCR体系除了问题,换一组酶和buffer,提一下模板,重做吧,会出来的.1年前查看全部
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skycrazy 共回答了18个问题
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不同点:1.相关酶及蛋白:体内基因复制需要单链DNA结合蛋白,DNA解链酶,DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ等共同作用;体外扩增一般使用耐高温的TaqDNA聚合酶.2.子代DNA分子形成方式:体内基因复制前导链为5'端到3'端的连续延伸,滞后链为半不连续延伸;体外扩增两条链均为5'端到3'端的连续延伸.3.体外扩增需要经历高温解链(90-96摄氏度)、低温退火(25-65摄氏度)、延伸(70-75摄氏度)三个过程来完成一次扩增;体内复制则是在相对均一的温度下完成解链与延伸.
参考:DNA复制和DNA聚合酶链反应1年前查看全部
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PCR所用的DNA聚合酶只能顺着已经存在的一小段DNA的尾巴来接着合成,它不会自己起头.引物就是这么一小段用来起头的DNA.
DNA本身很长很长,我们扩增时,只能扩增其中一小段基因.如何确定扩增哪一小段呢?就需要引物来帮忙了.引物具有特殊的核苷酸序列,使它正好能与DNA中某个特定的部位结合起来.你想一想,从直线上截取线段时是不是需要一左一右两个点呢?引物就相当与这两个点,所以PCR需要两个引物.这两个引物,我们通常称之为一对引物,一个叫上游引物,一个叫下游引物.1年前查看全部
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扩增两倍 400 X2 X2 = 1600个
扩增三倍 400 X2 X2 X2=3200个
去掉原来的 3200 -400 = 2800个 也就是2的3次方 (8-1)X 400=2800
RI,2520,我假说你的引物 两条,每条都是20,那么一次扩需要2引物,二次扩需要4引物,三次扩需要8引物,加起来 2 + 4 + 8 =14条引物,共消耗14 X 20=280 个固定的NTP
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会有什么不良影响呢?为什么定量就不好?骠手一1年前2
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shihf2001 共回答了14个问题
|采纳率71.4%做普通PCR可以的,问题不大.定量就最好不要了.1年前查看全部
- 在PCR技术中,循环四次后为什么会得到11条目的基因?是不是也算上了第二轮所扩增的目的基因了?
在PCR技术中,循环四次后为什么会得到11条目的基因?是不是也算上了第二轮所扩增的目的基因了?
请说出目的基因的计数过程,johoney1年前1
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醉翁亭记 共回答了17个问题
|采纳率94.1%公式:m=2^n-n-1
m为目的基因数,n为循环次数u1年前查看全部
- 不同基因组用同一引物扩增的结果会怎样
198410241年前1
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58wo4 共回答了14个问题
|采纳率85.7%你可以在NCBI中比对这两种基因组mRNA中上下游引物即将扩增的那一段,看看是否一致,若一致,则PCR产物是相同的,不一致的话则不同1年前查看全部
- 若以N 表示扩增循环数,当一条双链模板循环扩增30次时,反应体系中总分子数多少?非目的产物多少?目的产物多少?
钱江江1年前1
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jxw_9911 共回答了22个问题
|采纳率95.5%这取决于你的模板和引物的关系,以及扩增效率.
如果引物是从模板的两端开始,也就是扩出的产物和模板一样,那么总的拷贝数为A*(1+Y)^N(其中A为初始拷贝数,Y为扩增效率,N为扩增循环数)
如果是从大的双链DNA模板中扩增一个小片段,期望的目的产物首先在第2个循环后第3个循环时出现,然后扩增产物呈指数增长,同时非特异扩增产物是线性扩增的,需要注意的是非特异产物在下轮会产生一个特异产物.为方便理解我先假设扩增效率Y=1,初始拷贝数A=1,做一下推导.注:以双链算一个分子.
第1轮后:目的产物:0,非目的产物:1
第2轮后:目的产物:0+1,非目的产物:2
第3轮后:目的产物:2+2,非目的产物:3
第4轮后:目的产物:8+3,非目的产物:4
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第N轮 后:目的产物:(2^N)-N-1,非目的产物:N
(+号前面是目的产物扩增,加号后为非目的产物扩增)
所以体系中总分子数为:(2^N)-N-1 + N +1(模板)=2^N
非目的产物为:N
目的产物为:(2^N)-N-1
如果考虑A和Y的话,就将上面的数字乘A,2用1+Y代替.1年前查看全部
- 关于pcr扩增上游引物扩增到什么地方终止,怎么终止是上游引物选扩增模板,然后下游引物以新合成的模板为模板扩增?
carol13951年前1
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如是忘了多好 共回答了21个问题
|采纳率90.5%DNA有终止子的,扩增到终止子的地方就停止了.具体终止子怎么把它终止的,看生化课本吧.不同物种的DNA也不一样.
一般给你碱基序列的那条模板,假设为A链,它的互补链是B链.
第一次延伸:上游引物是识别B链往下延伸的,它延伸出来的碱基序列跟A链一样.下游引物是识别A链往下延伸,它延伸出来的序列跟B链一样.
5'----------------3’A
3------5 上游引物
下游引物5------3
3'----------------5'
第二次延伸:新合成的链同原始的模板一样也可作为模板扩增.1年前查看全部
- 大肠杆菌16S rDNA鉴定用27F和1492R引物扩增时候的PCR条件是什么?
黑夜之神1年前1
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我是爱相随 共回答了17个问题
|采纳率88.2%预变性 94℃ 5min 1 cycles
变性 94℃ 30s
退火54℃ 30s
延伸72℃ 1min30s 35cycles
延伸 72℃ 10min 1cycles1年前查看全部
- 运用PCR技术复制DNA时,DNA的扩增方向是什么?是不是DNA的合成方向总是从5“端向3”端延伸
lvli991年前1
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mamingyue 共回答了22个问题
|采纳率95.5%用pcr扩增时,就是5'到3',因为所用的酶就只有5'到3'DNA聚合酶
DNA在体内生物合成时,也是5'到3',另外一条反向DNA链看上去是3'到5',其实也是先5'到3'合成冈崎片段后,再进行连接合成.1年前查看全部
- 英语翻译随着经济的持续发展和基础建设工程的扩增,为了提高生产效率,人们对筑路养路机械的质量和稳定性都有了更高的要求.本文
英语翻译
随着经济的持续发展和基础建设工程的扩增,为了提高生产效率,人们对筑路养路机械的质量和稳定性都有了更高的要求.本文对稳定土拌和机中WBY210型稳定土拌和机的系统组成和功能进行了简单介绍,并在此基础上对起重机常见故障以及故障的原因进行了分析,提出了故障排除和检查的一般方法,并且设计一套液压系统故障自诊断系统方案.以保证工程的正常运行减少经济损失和人员伤亡,也可以为稳定土拌和机的维修人员和售后服务人员参考之用.
关键词 稳定土拌和机 故障检测 自诊断系统zhongkeyu1年前1
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yanlin329 共回答了15个问题
|采纳率86.7%With the development of economic and infrastructure engineering amplification, in order to improve production efficiency, people on the road maintenance machinery quality and stability are higher requirements. The stabilized soil mixing machine WBY210 stabilizer system composition and function are introduced, and on the basis of the crane faults and fault reason undertook an analysis, put forward the troubleshooting and examining method, and design a set of hydraulic system fault self diagnosis system. In order to ensure the normal operation of the project to reduce the economic losses and casualties, also can be stabilized soil mixing machine repair personnel and customer service staff for reference.Key words soil stabilization machine fault detection diagnosis system1年前查看全部
- PCR扩增过程中,生成的扩增片段大小一样吗?如果不一样,是否影响扩增片段的纯度?
znwll1年前1
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paddy_84 共回答了20个问题
|采纳率100%如果引物特异性比较高,模板比较纯的话产物也是一样的,如果担心有其他的片段,可以用第一次PCR产物稀释后作为模板继续PCR,这样就能得道比较纯的产物了.1年前查看全部
- PCR热循环仪中的扩增DNA Probe不再需要加入一层油的原因
PCR热循环仪中的扩增DNA Probe不再需要加入一层油的原因
过去不用热循环仪是需要在所有反应试剂比如:dNTP,MgCl2,Prime等加完后,最后在表面加入一层油的,而现在热循环仪中不再需要加入,请教长期从事PCR的前辈.向丽江1年前3
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—树心— 共回答了20个问题
|采纳率95%以前用的PCR仪是从离心官底部加热的,不加入石蜡油的话,本来微量的溶液就会因为水的挥发而导致体系浓度增高,难以扩增成功.
现在的PCR仪改良了,都是从离心管盖上边加热的,解决了那个麻烦.
你可以打开仪器看看的.1年前查看全部
- 5'race 只扩增出一条带 测序回来不对,能找到通用引物,找不到特异引物,是什么原因啊
spcflying1年前1
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jingxingweixian 共回答了23个问题
|采纳率95.7%可以只加入通用引物做一个control,怀疑你扩出来的片段是只有通用引物结合扩增出来的,而特异性引物并没有结合1年前查看全部
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