引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%.这句话如何理解?什么是非特异性扩增区?为什么同源性不能过高?过高会造成什
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引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%.这句话如何理解?什么是非特异性扩增区?为什么同源性不能过高?过高会造成什么后果?
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龙卷风了 共回答了28个问题
|采纳率75%- 非特异扩增区就是,设计引物的时候设计的引物靶序列以外有可能跟引物结合的序列.与非特异性结合位点的同源性越高,引物就越有可能与其结合,而不是结合到你设计的模板靶序列上去,于是就越有可能PCR出你不想要的序列出来.
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|采纳率100%说明没扩出来呗
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vdge 共回答了16个问题
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一蓑烟雨客_潇潇 共回答了18个问题
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大代表表的是碱基.
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agogos 共回答了16个问题
|采纳率100%找亲缘性最好的物种,看看能不能找到它们的序列,或者看看有没有人发这方面的文章
又或者,用oligo dT反转录,然后根据亲缘性序列在前端设计引物,看看能不能扩增出来,多设几个,拿扩增出来的进行测序再设计引物1年前查看全部
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失忆的柏拉图 共回答了13个问题
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如果是为了对目的基因片段测序,用普通taq酶pcr没问题,而且,也没必要做到克隆里再测,可直接用pcr产物测;
如果是为了做克隆已备后续实验,建议你用高保真的taq酶,普通taq错的随时随地,运气好一次就成了,运气不好,能把人折磨死.1年前查看全部
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复制是一条DNA双链解旋以自身为模板复制为2条DNA双链
转录是一条DNA双链解旋以自身为模板转录成一条RNA单链就是信使RNA
不需要引物,但PCR技术分工合成DNA需要引物1年前查看全部
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如题,这样是否正确.
错了··是50ul的体系123hyf4561年前1
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葬花的MM 共回答了19个问题
|采纳率84.2%你这引物含量太高了
我的引物为20um,10ul体系的话加0.2ul足够了
50ul体系加1ul肯定没问题,要不了10ul1年前查看全部
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闻香拾女人 共回答了15个问题
|采纳率86.7%博凌科为-为你我觉得一种可能是模板量过多,如果55度条带最亮的话你可以把它稀释10-50倍做模板.再就是产物降解,这方面也很有可能,我以前也遇到过相同问题,最后还是换了模板成功的.还有建议你下次批的时候做55和62两个梯度,这样比较保险1年前查看全部
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ww002 共回答了18个问题
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另外你是做DNA还是cDNA,如果是前者,点开就是了.如果是cDNA,要在点开的页面的左侧找出并点击CDs,这次出来的序列才是cDNA
一般是要提RNA,再逆转录成cDNA的,不知道你是不是直接提DNA,做PCR?1年前查看全部
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真核细胞有5种DNA聚合酶,分别为DNA聚合酶α(定位于胞核,参与复制引发,不具5'-3'外切酶活性),β(定位于核内,参与修复,不具5'-3'外切酶活性),γ(定位于线粒体,参与线粒体复制,不具5'-3',有3'-5'外切活性),δ(定位核,参与复制,具有3'-5',不具5'-3'外切活性),ε(定位于核,参与损伤修复,具有3'-5',不具5'-3'外切活性
我们用的taq酶是 Taq DNA 聚合酶 由一种水生栖热菌yT1株分离提取出,是发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种,达200,000单位/mg.具有5'-3'外切酶活性,但不具有3'-5'外切酶活性,因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能.1年前查看全部
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前导链与解链方向相同
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|采纳率93.8%去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛?>>> 如果你是直接从DNA中克隆基因的话,设计一对引物,用高保真的Phusion或者Vent酶就可以.NEB的产品很不错.
如果你要从cDNA中克隆的话,考虑到RNA的降解,你不能使用一对引物来克隆.而是设计两对或者多对引物.比如,你你针对序列这几两对引物,前一对引物的下游,和后一对引物的上游,应该设计15个bp的重合.前一对引物的上游和后一对引物的下游则位于整个4kb基因的首位两段.
这样,你用这两对引物先克隆出4kb基因的两个短片段.然后将两个短片段作为模板,以前一对引物的上游引物,和下一对引物的下游引物来在一个PCR反应体系中扩增,获得4kb的全片段.、
如果你要设计多对引物,方法类似,都是上一段的下游和下一段的上游有十几个bp的重合
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补充一下,如果你是从基因组中直接克隆的话,那就是设计一对引物.使用高保真的聚合酶做long PCR,目前的Phusion Taq酶对于4kb的片段是没什么问题的.我自己曾经尝试克隆过3kb的片段,非常的清晰,没有任何拖带.但是成功的关键在于你要设计特异性的引物,建议你设计30-50个bp左右的引物(引物越长,对模板的特异性要求越高),提高退火温度,来保证引物的特异性.
此外,加长PCR程序中的变性时间,来保证基因组DNA的完全接连,适度延长退火时间,加大引物使用的量,来保证引物和模板的结合.毕竟你是从整个基因组中寻找你的目的基因.1年前查看全部
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第一次延伸:上游引物是识别B链往下延伸的,它延伸出来的碱基序列跟A链一样.下游引物是识别A链往下延伸,它延伸出来的序列跟B链一样.
5'----------------3’A
3------5 上游引物
下游引物5------3
3'----------------5'
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所以显然D是对的,无论转录还是复制还是PCR,都需要DNA做模板,没有DNA模板,反应就无法完成.
A的错误在于,用的是三磷酸核苷,不是二磷酸.
B的错误在于,转录和复制都是不需要引物的(只有PCR反应需要).所以两个酶都无需引物即可作用(注意区别引物和模板).
C和E的错误一样.DNA和mRNA的延长方向相同,都是从5'到3',而不会反过来.换言之,核苷酸都是加在3',不是加在5',更不是两边都加.1年前查看全部
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0.5µL下游引物
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95度30秒 55度30秒 72度30秒 25到35个循环
最后72度10min
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反向测序结果可以找到正向引物的反向互补序列1年前查看全部
- 5'race 只扩增出一条带 测序回来不对,能找到通用引物,找不到特异引物,是什么原因啊
spcflying1年前1
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jingxingweixian 共回答了23个问题
|采纳率95.7%可以只加入通用引物做一个control,怀疑你扩出来的片段是只有通用引物结合扩增出来的,而特异性引物并没有结合1年前查看全部
- ATGGAATATCTWATACCTGTTTTGC 这段引物有什么问题吗,有出现内含子的剪切位点么?
ATGGAATATCTWATACCTGTTTTGC 这段引物有什么问题吗,有出现内含子的剪切位点么?
我用这段引物可以扩出cDNA全长,但却扩不出基因组全长,请问可能是哪里出现了问题?zhoulin8ss231年前1
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不平坦 共回答了21个问题
|采纳率90.5%如果扩的出cDNA却扩不出基因组的话,那么可能你的引物跨了内含子了.1年前查看全部
- 10ul体系pcr中所加引物的浓度
angelall1年前2
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air_force_one 共回答了22个问题
|采纳率90.9%一般5~10uM加1uL,相对来说少一点更好1年前查看全部
- 引物的作用?为什么DNA聚合时要引物先与另一条链结合,俩条链才能结合?引物在其中起到了什么作用?PCR技术里引物是启动子
引物的作用?
为什么DNA聚合时要引物先与另一条链结合,俩条链才能结合?引物在其中起到了什么作用?PCR技术里引物是启动子吗?那普通聚合时它也是启动子吗?成熟靓丽人1年前1
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rrrr我 共回答了21个问题
|采纳率85.7%因为DNA聚合酶不能直接在一条DNA单链上复制,一定要先让一小段寡核苷酸与模板DNA互补配对,然后聚合酶才能在引物的一端继续复制下去1年前查看全部
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