RT-PCR扩增条件问题我是做real-timePCR,需要测定六个基因的mRNA表达差异.这六个基因我是分开来扩增的,
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RT-PCR扩增条件问题
我是做real-timePCR,需要测定六个基因的mRNA表达差异.这六个基因我是分开来扩增的,因为样本太多.每个样本都达到了平台期的,并且我所加的mRNA的模板数、引物量、dye、mix都是一样的.但是我在扩增的时候,为了达到最大的扩增效率,这六个基因我都分别采取了不用的扩增温度、循环数,这样各组得出来的CT值具有可比性吗?期待尽得到答复,谢谢……
我是做real-timePCR,需要测定六个基因的mRNA表达差异.这六个基因我是分开来扩增的,因为样本太多.每个样本都达到了平台期的,并且我所加的mRNA的模板数、引物量、dye、mix都是一样的.但是我在扩增的时候,为了达到最大的扩增效率,这六个基因我都分别采取了不用的扩增温度、循环数,这样各组得出来的CT值具有可比性吗?期待尽得到答复,谢谢……
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malan868 共回答了11个问题
|采纳率90.9%- 应该可以,CT只是和你初始的mRNA表达量有关,当然的是在各种酶和原料充足的的情况下,和循环次数没什么关系 不过有问题的就是你的荧光蛋白发光会受到温度影响的,你只能大概的比较下,表达量大的话还好,如果差异小的,建议重新做一下
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jeep35702 共回答了20个问题
|采纳率95%我个人感觉对PCR影响最大的是模板质量和退火温度,至于其他的影响因素那就太多了,模板纯度浓度,引物质量,体系中的物质(buffer,酶,Mg2+,dntp浓度),退火和延伸温度.一般来讲,引物从reference上找,然后参照reference上的体系稍作调整即可,有需要直接HI我吧,我不一定在,看到给你回1年前查看全部
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|采纳率89.5%两种反转录的方法,一种是用oligoT作为引物,把所有的mRNA都反转录了,这个应该是有用的.另一种方法,是用特异性的引物去反转录,这个的话,你要看这种基因的转录后剪切有没有把最后一个外显子切掉的情况,如果没有的话,也是可以用Reverse primer去反转录的.
mRNA的选择方面,只要你提取mRNA的细胞是有这种基因表达,且存在可变剪切的机制,这样提取的mRNA就可以做下一步实验的.1年前查看全部
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如果没有非特异性条带,可以取4-5ul产物,直接作模板进行2次PCR..1年前查看全部
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本文通过PCR、转化、提质粒、酶切、连主要接、纯化等步骤构建了质粒pET28a-NULP1.先通过PCR扩增出了nulp1,并将nulp1连接入pMD18-T载体酶切检测并测序,得到正确的nulp1,再将nulp1连接到pET-28a载体,成功构建了pET-28a-NULP1重组质粒.
1楼你纯粹是GOOGLE复制白玉狐狸1年前2
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wuzhiwo 共回答了22个问题
|采纳率100%This aritcle through the steps such as PCR,transformation,distilling plasmid,EcoRI,connecting main links,purification and so on,in order to built the plasmid pET28a-NULP1.First,amplifing the nulp1 through PCR,and connecting the nulp1 to the carrier EcoRI pMD18-T then testing and sequencing,when you got the correct nulp1,then connecting nulp1 to carrier pET-28a,built the regrouping plasmid pET-28a-NULP1 successfully.1年前查看全部
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友东 共回答了24个问题
|采纳率100%两方面考虑:
1 改善PCR反应条件,从你提供的情况看,55度退火太低.建议做个温度梯度PCR,在55度到67度间,每升高2度,做一个反应.另建议将反应体系设为20微升(温度升降过程易于达到目标值).
2. 如果通过改变退火温度,仍然达不到想要效果,考虑模板是否合适;此外,建议对引物重新设计,适当增长引物长度,改变引物位置.
考虑到了上述因素,一般来说,没道理做不出一条带的.1年前查看全部
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我的uu是笨笨 共回答了11个问题
|采纳率90.9%这个,出现非特异性扩增估计跟模板,引物,以至于反应条件都有关系.
可以减少延伸时间,因为你扩的片段很小,没有必要花很长时间延伸.
我P SSR的程序是94度 35s
55度 35s
72度 45s
前面的预变性和最后的延伸时间都可以随便定,没有严格要求.
如果还不行的话,你可以把模板或者引物换一换,看看有没有效果.1年前查看全部
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23zt1年前4
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公园5 共回答了13个问题
|采纳率92.3%你用的应该是DL2000Marker 每一条带都代表一个分子量 看一下目的条带靠近哪条带能估算出分子量
PCR扩增是为了得到目的带 扩大浓度进行后续试验
DNA扩增前后的位置取决于你扩增的目的片段的长度 以及PCR体系是否合理1年前查看全部
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1 ttgtaaaaaa attaaattaa taagaaatta aatgagatca ttaaatttag ataatttggc
61 ggtattttaa atagttagag gaatttgtca gttaaatgat actccacgag tggaatgtcc
121 tagtgaagtt tttatgtatt gttgtataaa aattatttta taagaattat aattaaaata
181 tttaatttaa tttgaattca aatcaaaatg tagaattatt agggttagat gaattacaat
241 ttaatttaac attggagtta tttttttaat taaaataata aaaaaggatt taaaagtaaa
301 tttaagtaaa tatttaaatt gaaatattaa ttaaaatatg树梢上的麻雀1年前2
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cte7 共回答了10个问题
|采纳率90%F Primer:5'- TTG TAA AAA AAT TAA ATT AA-3'
R Primer:5'- CAT ATT TTA ATT AAT ATT TC -3'
你这个序列AT含量太高,尤其是5'端A有7个连续重复,引物本身很容易自我折叠或者与DNA链产生非特异性结合,所以强烈建议将引物至少设计在20bp以上,最好可以到30bp.1年前查看全部
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(2012•泰州一模)重叠延伸pcr技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次pcr扩增,从而获得目的基因的方法.该技术在扩增较长片段的dna、不同来源的dna片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景.如图是利用重叠延伸pcr技术扩增某目的基因的过程.其主要没计思路是用具有互补配对片段的引物(图中引物2、引物3),分别pcr,获得有重叠链的两种 dna片段,再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得目的基因.结合所学知识,分析下列问题.
(1)引物中g+c的含量影响着引物与模板dna结合的稳定性,引物中g+c的含量越高,结合稳定性______.
(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段dna 的过程中,必须将引物l、2和引物3、4置于不同反应系统中,这是因为______.
(3)引物l、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制,***生______种双链dna分子.
(4)在引物1、引物2组成的反应系统中,经第一阶段形成图示双链dna至少要经过______次复制.
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(2)从图中可以看出,引物2和引物3相应的碱基之间可以进行配对,所以如果将引物2和3放在一个反应系统中,则会引起引物2和3 的失效.
(3)两个反应系统中各自形成两种DNA分子,但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子,所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA,故总共形成三种DNA分子.
(4)第一次复制形成的两个DNA分子分别含有引物1和引物2,图中第一阶段形成的DNA分子同时具有引物1和引物2,图示双链DNA分子至少要经过第二次复制才能形成.
(5)利用微生物扩增该目的基因,需要将目的基因导入受体细胞,而导入受体细胞首先要将目的基因与载体结合.
故答案为:(8分)(每空1分,特殊说明除外)
(1)越高 (2)引物2和3中存在互补配对片段,置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用
(3)3 (4)2 (5)目的基因与载体结合(2分) 将重组DNA导入受体细胞(2分)点评:
本题考点: PCR技术的基本操作和应用.
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1.你跑胶一般都要放MARKER或者叫DNA LADDER吧,这个MARKER除外对DNA标记大小以外,还可以用来监控ELECTROPHORESIS的质量,如果MARKER显示而DNA没显示,说明ELECTROPHORESIS正常而DNA有问题,如果MARKER和DNA都没有显示,说明是你的电永出现了问题.
ELECTROPHORESIS的可能问题有,1.ELECTROPHORESIS BUFFER浓度问题,2.BUFFER太陈旧了从而失效 3.跑过了(根据SIZE来看)
2.如果证明是DNA复制也就是PCR的问题,可能性就太多了.
具体包括你所使用的PCR
BUFFER:浓度问题(需要1X),盐析问题(有时候放置太久其中的SALT会析出,溶解不透彻就会失效),氯化镁浓度问题.
DDNTP:浓度问题(可能配得浓度不够),陈旧性问题.
TAQ:你的酶有可能失效.
PRIMER问题:你的PRIMER可能NOT WORK.也可能你的ANNEALING TEM有问题,初次使用PRIMER的时候建议作温度的GRADIANT TEST,测试最佳ANNEALING TEM.PRIMER也可能太陈旧了,浓度或高或低.PRIMER容易行程DIMER.
PCR PROGRAMME的设置问题:这个最简单,建议仔细过一遍.
总之,如果是PCR的问题,建议每次保持其他不变,只改变其中的一项来把问题找出来,另外提醒你最好要作POSITIVE 和NEGATIVE CONTROL.1年前查看全部
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就是说引物序列与目标基因是否有交叉?
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(在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上叫"退火")1年前查看全部
- 要用PCR扩增下图所示的两段序列之间的DNA,请从所列出的引物中选出合适的一对.
要用PCR扩增下图所示的两段序列之间的DNA,请从所列出的引物中选出合适的一对.
5’-GACCTGTGGAAGC----------------CATACGGGATTG-3’
3’-CTGGACACCTTCG-----------------GTATGCCCTAAC-5’
引物 1 引物2
1) 5’-CTGGACACCTTCG 5) 5’- GTATGCCCTAAC
2) 5’- GCTTCCACAGGTC 6) 5’- GTTAGGGCATAC
3) 5’-CGAAGGTGTCCAG 7) 5’-CAATCCCGTATG
4) 5’- GACCTGTGGAAGC 8) 5’- CATACGGGATTG醉是那朵茉莉1年前1
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我为球狂168 共回答了14个问题
|采纳率92.9%4,7
按照碱基互补配对原则
3’-CTGGACACCTTCG 目的DNA
5’- GACCTGTGGAAGC 引物1年前查看全部
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又龙又贝1年前2
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jikyhew 共回答了12个问题
|采纳率91.7%http://baike.baidu.com/view/352480.htm1年前查看全部
- PCR扩增实验之后,产物用琼脂糖凝胶电泳,为什么看不到光带?添加试剂没有问题
yizhi11年前5
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chenchen0099 共回答了10个问题
|采纳率100%实验有没有跑标准分子量DNA Marker?如果Marker电泳后条带正常,那么就是PCR无扩增条带;如果Marker也看不见,那就是配胶有问题,或者配胶用的试剂(比如染料)有问题1年前查看全部
- 做细菌pcr扩增的时候,琼脂糖电泳在100到250之间有亮条带,但是在250到500之间多出了一亮条带,这是怎么回
wtianqya1年前2
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laogongaiwo123 共回答了21个问题
|采纳率90.5%那是非特异性扩增片段,因为你使用的引物不光扩增了你的条带,还复制了其他一段DNA,只要非特异性扩增不是很强你也不是做qPCR,基本没有影响的,做PCR常会遇到.1年前查看全部
- 关于pcr扩增上游引物扩增到什么地方终止,怎么终止是上游引物选扩增模板,然后下游引物以新合成的模板为模板扩增?
carol13951年前1
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如是忘了多好 共回答了21个问题
|采纳率90.5%DNA有终止子的,扩增到终止子的地方就停止了.具体终止子怎么把它终止的,看生化课本吧.不同物种的DNA也不一样.
一般给你碱基序列的那条模板,假设为A链,它的互补链是B链.
第一次延伸:上游引物是识别B链往下延伸的,它延伸出来的碱基序列跟A链一样.下游引物是识别A链往下延伸,它延伸出来的序列跟B链一样.
5'----------------3’A
3------5 上游引物
下游引物5------3
3'----------------5'
第二次延伸:新合成的链同原始的模板一样也可作为模板扩增.1年前查看全部
- PCR扩增中需要能量吗?
中大垃圾1年前3
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fengye4400 共回答了16个问题
|采纳率100%PCR扩增中需要能量,因为需要外界能量断开DNA分子内的氢键.
❤您的问题已经被解答~(>^ω^1年前查看全部
- 为什么PCR扩增循环数30次为宜?
fgetzg9l1年前2
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406006311 共回答了33个问题
|采纳率90.9%一般情况下,循环30次产生的基因片段就够用了,在进行下去酶的活性可能也不会太好1年前查看全部
- 筛选引物PCR扩增后变性聚丙烯酰胺跑不出条带,或条带模糊,是怎么回事?
xxm3051年前3
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大土炮 共回答了23个问题
|采纳率91.3%首先我想问问pcr的产物不都是跑agarose胶吗?你怎么跑变性聚丙烯酰胺胶呢?
如果是agarose胶,跑不出来,你有没有做阳性对照啊?你的pcr work不work啊?可能是pcr就不work呢?然后你pcr的产物是如何保存的?如果放在4度时间长了,是会降解的.就是出现条带模糊.或者是你agarose胶融的不好?1年前查看全部
- 博凌科为的长片段PCR扩增试剂盒
咬一口mengmeng1年前1
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爱梦笑 共回答了19个问题
|采纳率94.7%长片段PCR扩增试剂盒所用的酶是Taq聚合酶和有校正功能的聚合酶的混合酶,这种混合酶可以染色体和其它细胞器的DNA为模板高效进行PCR反应.在人的染色体上可以扩增出27kb的DNA片段,而以DNA为模板则可以扩增出40 kb的片段.
质量控制:每批长片段PCR扩增试剂都进行功能测试,常规条件下可以用特异性引物从λDNA上扩增出30 kb的片段.
一般建议:
长片段PCR扩增试剂盒可以很稳定的扩增出终长度小于1 2 kb的片段位口基因组DNA);当扩增片段终长度在12~20 kb时(如基因组DNA),那么模板质量,变性条件和恰当的dNTP/Mg离子浓度等相关条件对于实验结果非常关键;如果扩增片段总长度大于20kb,则操作条件需要进步优化.
注 意:
※ 对于长片段扩增,请使用薄壁PCR管.
储存条件:
-20℃一年有效1年前查看全部
- PCR扩增过程中,生成的扩增片段大小一样吗?如果不一样,是否影响扩增片段的纯度?
znwll1年前1
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paddy_84 共回答了20个问题
|采纳率100%如果引物特异性比较高,模板比较纯的话产物也是一样的,如果担心有其他的片段,可以用第一次PCR产物稀释后作为模板继续PCR,这样就能得道比较纯的产物了.1年前查看全部
- 在PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳实验中,如何知道所观察的样品在电泳过程中的大概位置
今天看了1年前1
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speedis11 共回答了15个问题
|采纳率66.7%看溴酚蓝作为指示,溴酚蓝大概跟250bp的条带位置差不多,如果你的条带长度短于250bp,那么溴酚蓝跑到胶的一半长度就可以拍照了;如果你的条带长度大于250bp,那么溴酚蓝跑到胶的三分之二或者四分之三位置就可以拍照了.主要看你经验,多跑几次就有感觉了.1年前查看全部
- 在基因进行PCR扩增过程中涉及到哪些要素?其中哪些因素决定了PCR的效率?
lvgirl1年前1
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198759 共回答了18个问题
|采纳率88.9%预变性
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟.
变性步骤
循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间
变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败.
引物退火
退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度.然后在此次实验基础上做出预估.
引物延伸
引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度).
循环数
大多数PCR含25-35循环.
最后延伸
在最后一个循环后,反应在72℃维持10-30分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链.——————————————————————————————————————————
如果进行PCR首先确定的是底物的纯度,苯酚有报道称会印象PCR过程.
引物就不多说了,退火温度对PCR的特异性有较大影响.延伸时间要看扩增片段长短,循环数不能太多要不非特异性扩增太多.1年前查看全部
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