- 阿啵呲嘚
-
21-25:ADBCC(或上0f,肯定是高4位不变,低4位变F)
26:B(工作在方式2,肯定不会选C)
27:D(JB
为1时转移,记数满后TF0置1)
28:D(T1中断地址)
29:C(开总中断,开外部中断0)
30:C(抄的楼上的,我忘了怎么算)
31:B
32:B(用作地址指针)
33:B
34:D(LCALL调用子程序,要保护现场,子程序完成后再返回,会影响SP)
35:C(SJMP无条件,LCALL,ACALL不是跳转,是调用子程序,DJNZ要有条件)
36:D(或上0b1000000,最高位为1,其它不变)
37:A
38:A(响应外部中断0后PC为外部中断0的入口地址0x0003)
39:A(EA为总中断,置1时开总中断)
40:外部中断0和1
- LuckySXyd
-
C C B A D B B D D D B D C D C C B A A
- 皮皮
-
C C B A D B B D D D B D C D C C B A A
跪求同济大学魏鸿磊单片机原理及应用(C语言编程)课后习题答案
#include<stdio.h>#include<stdlib.h> void swap(int*a,int*b){ int temp; temp=*a; *a=*b; *b=temp;}void select_sort(int A[],int n){ register int i,j,min,m; for(i=0;i<n-1;i++) { min=i;//查找最小值 for(j=i+1;j<n;j++) { if(A[min]>A[j]) { min=j; } } if(min!=i) { swap(&A[min],&A[i]); printf("第%d趟排序结果为: ",i+1); for(m=0;m<n;m++) { if(m>0) { printf(""); } printf("%d",A[m]); } printf(" "); } }}int main(void){ int n; while(scanf("%d",&n)!=EOF) /* VS2013等版本中需使用scanf_s(),VC6.0中使用scanf() */ { int i; int*A=(int*)malloc(sizeof(int)*n); for(i=0;i<n;i++) { scanf("%d",&A[i]); } select_sort(A,n); printf("最终排序结果为: "); for(i=0;i<n;i++) { if(i>0){ printf(""); } printf("%d",A[i]); } printf(" "); } return 0;}2023-08-16 14:28:161
单片机原理与应用(求解答)
呵呵,以后用C语言这个看不懂!2023-08-16 14:28:392
单片机原理与应用
单片机原理与应用R0中有数据,写成十六进制为87H,若是无符号形式,则该数为:135。若是原码形式,则该数为----计算机中,并没有原码。若是反码形式,该数为-----计算机中,并没有原反。若是补码形式,则该数为:-121。若是 8421BCD 码形式,该数为:87。(以十进制表示)-----------------------注意:在计算机系统中,数值,一律采用补码表示和存储。原码反码,只是在草纸上,随便写写而已,并不存入计算机。2023-08-16 14:29:433
第二章 单片机的结构及原理 一、选择题 B 1、单片机应用程序一般存放在( )。 A.RAM B. ROM C. 寄存器 D.
B ROM中2023-08-16 14:29:563
跪求大工12秋《单片机原理及应用》在线作业一、二、三的答案
大工12秋《单片机原理及应用》在线作业1单选:DDDCD CDDAB判断:AABAA BBAAB2023-08-16 14:30:222
单片机原理及应用中的十进制数与二进制数原码、反码、补码详细解答
我托空气为邮差,把我的热腾腾的问候装订成包裹,印上真心为邮戳,37度恒温快递,收件人是你。祝你:春节愉快! 加分吧,嘻嘻2023-08-16 14:30:526
单片机原理及应用
全错的2023-08-16 14:31:253
C51《单片机原理及其应用》 (孙育才 孙华芳 )课后习题答案
其实 ,答案都在前面的章节中2023-08-16 14:31:332
求解2个单片机原理及应用教程的编程题
1:SUM: MOV A,32H ADD A,35H MOV 32H,A MOV A,31H ADDC A,34H MOV 31H,A MOV A,30H ADDC A,33H MOV 30H,A RET2:LEDFLASH: MOV R2,#10LP: CLR P1.0 MOV R3,#50 LCALL DELAY SETB P1.0 MOV R3,#10 LCALL DELAY DJNZ R2,LP RETDELAY: MOV R4,#200DELAY1: MOV R5,#250 DJNZ R5,$ DJNZ R4,DELAY1 DJNZ R3,DELAY RET2023-08-16 14:31:411
单片机原理及应用
看到这题目时,恐怕已经晚了。楼主还需要程序吗?2023-08-16 14:31:501
急急,单片机原理及应用的考题。单片机单片机编程题100分
1.CLR IT0CLR PX0SETB EX0SETB EA2.SETB IT1SETB PX1SETB EX1SETB EA3. 题目不全,其余四位,不知道应该怎么处理。MOV A, P14, 题目不全,其余四位,不知道应该怎么处理。MOV A, P13. ;假设原来的带符号数是“原码”。MOV DPTR, #0020HCLR AMOVC A, @A+DPTRJNB ACC.7, XXXCPL AINC AXXX:MOV 30H, AEND2023-08-16 14:31:591
海尔单片机原理是什么及应用pd
海尔单片机原理及应用pdf您好,很高兴为您解答!您可以在网上搜索“海尔单片机原理及应用”,可以找到一些相关的PDF文档,例如:1、《海尔单片机原理及应用》:http://www.doc88.com/p-9078450014072.html2、《海尔单片机原理及应用》:http://www.docin.com/p-845001407.html3、《海尔单片机原理及应用》:http://www.doc88.com/p-9078450014072.html4、《海尔单片机原理及应用》:http://www.docin.com/p-845001407.html希望我的回答对您有帮助!2023-08-16 14:32:061
跪求《单片机原理及其应用(MCS-51)》 蒋廷彪 刘电霆 重庆大学出版社 课后答案
这个恐怕没有吧编书的人等书出版了,一般懒得去公布答案了。具体什么题目,发上来看有人会做不嵌入式单片机学习社区:http://bbs.gongkong.com/product/embed.htm2023-08-16 14:32:391
求《单片机原理及应用——C51编程+Proteus仿真》张毅刚 第1版的课后题答案!!
你看看是不是你需要的,我也没仔细看过2023-08-16 14:32:461
请高手帮忙解答,单片机原理及应用u200b知识的难题,非常感谢。
好的丘上说吧我id2023-08-16 14:32:553
单片机原理及应用魏鸿磊那本书的课后答案谁能给一份,急
不好意思替你搜索了一下。网上没有类似的参考答案;你可以取购买相关的参考书,或对个别的题目提问;望对你有帮助。2023-08-16 14:33:051
单片机原理及应用作业
每道题后面,都有 P??,应该是,正确答案所在的页码。网友也没有你用的教材,哪能回答你的问题。即使正确回答,和你的教材,难免也会有不同,你老师未必会给分。2023-08-16 14:33:121
单片机原理及应用 黄勤编 答案 你找到了吗
d2023-08-16 14:33:234
单片机原理与应用
请不要作弊2023-08-16 14:33:462
MCS-51单片机原理、接口及应用课后题详解(主编郭文川,电子工业出版社)
2023-08-16 14:33:551
求新编单片机原理与应用的答案
没有人有这个精力来做吧,反正我是不行的。2023-08-16 14:34:041
MCS-51单片机原理及嵌入式系统应用 答案
推荐你看哈尔滨工业大学张毅刚主编的51最新版本的那书说的很明白2023-08-16 14:34:141
单片机考试求答案,急急急!请高手帮忙!
不懂2023-08-16 14:34:282
单片机 考试。。。
这个,貌似应该去学校找老师和同学解决...2023-08-16 14:34:403
单片机问题急需答案!!!
请加入单片机技术交流qq群:313715372023-08-16 14:34:483
单片机原理与应用
10001110=8eh=142 ,补码求负整数的补码,原码符号位不变,先将原码减去1,最后数值各位取反最高位1为负数,10001110-1=10001101,取反01110010=72h=1142023-08-16 14:35:112
单片机试题答案 后面还有加分
1、已知:(A)=80H,(R7)=08H,(40H)=F0H,(R0)=30H,(30H)=0FH,请指出下列伪程序执行的结果,即(A)=?,(R7)=?,(40H)=?,(30H)=?XCHA,R7;A=08HR7=80HXCHA,40H;A=F0H(40H)=08HXCHA,@R0;A=0FH(30H)=F0H2、已知:(A)=85H,(R0)=20H,(20H)=AFH,则执行指令ADDA,@R0后,累加器A的值及程序状态寄存器PSW中的CY,AC,OV,P各位的状态如何?;A=34H,CY=1,AC=1,OV=1,P=13、统计下列程序中累加器ACC被取反的次数MOVA,#55H;MOVR6,#30BACK:MOVR5,#10HHERE:CPLA;16*30=480DJNER5,HERE;累加器ACC被取反的480次数DJNER6,BACK2023-08-16 14:35:301
单片机原理与应用及C51程序设计答案(谢维成)发到710229697@qq.com
不要认为百度回答问题的人都是没事干的人,问题不要这样题,看到会很反感。2023-08-16 14:35:371
什么是A类功放?什么什么是B类功放?什么是AB类功放?
纯甲类功率放大器又称为A类功率放大器(Class A),它是一种完全的线性放大形式的放大器。在纯甲类功率放大器工作时,晶体管的正负通道不论有或没有信号都处于常开状态,这就意味着更多的功率消耗为热量,但失真率极低。乙类功率放大器,也称为B类功率放大器(Class B),它也被称为线性放大器,但是它的工作原理与纯甲类功率放大器完全不同。B类功放在工作时,晶体管的正负通道通常是处于关闭的状态除非有信号输入,也就是说,在正相的信号过来时只有正相通道工作,而负相通道关闭,甲乙类功率放大器也称为AB类功率放大器(Class AB),它是兼容A类与B类功放的优势的一种设计。当没有信号或信号非常小时,晶体管的正负通道都常开,这时功率有所损耗,但没有A类功放严重。当信号是正相时,负相通道在信号变强前还是常开的,但信号转强则负通道关闭。2023-08-16 14:32:193
如何利用raptor用各种特殊符号,字母等打出一个图形。求大神指导......
多元汉字与图形符号输入法可以打出各种点的图形符号,这里打出来的是GBK字符集里的:“.”、“u2219”、“u2024”、“˙”、“u2219”、“·”、“u2022”。拷贝下来,分别去试试看吧。2023-08-16 14:32:202
功放三极管管脚的BCE发射极、基极、集电极,的意思。
晶体三极管是一种固体半导体器件,其应用十分广泛,可以用于检波、整流、放大、开关、稳压、信号调制和许多其他功能,在电子电路中是主要的器件之一,它的作用是对信号进行放大或者工作在开关状态对电路进行控制。 晶体三极管是由两个靠得很近并且背对背排列的PN结,它是由自由电子与空穴作为载流子共同参与导电的,因此晶体三极管也称为双极型晶体管。 三极管是各种电子设备中的信号放大器器件,其特点是在一定条件下具有电流的放大作用。常见的三极管有NPN型、PNP型三极管。 三极管都分为发射区、基区和集电区,三个区域的引出线分别成为发射极、基极和集电极,分别用E、B和C表示。发射区域基区间的PN结称为发射结,基区与集电区间的PN结称为集电结。NPN型和PNP型三极管的工作原理相同,不同的是使用时连接电源的极性不同,管子各极间的电流方向不同。 :三极管共有下列3个电极电流。 ①基极电流。基极电流用IB表示,这是流过三极管基极的电流,对于不同极性的三极管,其基极电流的方向是不同的。 对于NPN型三极管而言,基极电流是从管外流入管内的;对于PNP型三极管而言,基极电流是从管内流出管外的。 ②集电极电流。集电极电流用IC表示,这是流过三极管集电极的电流,对于不同极性三极管,其集电极电流的方向是不同的。对于NPN型三极管而言,集电极电流是从管外流人管内的;对于PNP型三极管而言,集电极电流是从管内流出管外的。 ③发射极电流.。发射极电流用IE表示,这是流过三极管发射极的电流,对于不同极性三极管,其发射极电流的方向是不同的。对于NPN型三极管而言,发射极电流是从管内流到管外的;对于PNP型三极管而言,集电极电流是从管外流人管内的。 无论流过三极管各电极的是直流电流还是交流电流,都符合上述各电极的电流关系。但是,工作在放大状态下的三极管,没有直流电流,就谈不上交流信号电流。转自电子线路识读,供参考2023-08-16 14:32:291
NEWSMY(纽曼)MP4无法开机怎么办?
按开机键同时连上电脑,之后屏幕会显示 英文,你按提示操作(应该是 提示 按M键 再按OK键)之后等待 2分钟,然后电脑上会出现一个 16M的系统盘,然后把固件复制进去就行。 不过固件版本有好多,要分清楚,固件错的话可能会白屏不开机等等, 不行的话就一个一个的试 。 答案补充 那应该是你下载的电影里面有病毒2023-08-16 14:32:311
Taq DNA聚合酶有几种
Taq DNA聚合酶有几种,除了普通扩增用的Taq DNA聚合酶外,还有以下几种特意性Taq DNA聚合酶。a,保真性的一个通用标准是错配率,错配率越低保真性越好。普通 Taq 酶的错配率在 10 -5 碱基 / 循环数,而高保真 Taq 酶错配率可降到 10 -6 数量级,大大降低了出错的可能性;它适合对 PCR 保真性要求较高的实验,如基因筛选、测序、突变检测等等。高保真 Taq 酶的保真原理是:高保真 Taq 酶具有 3‘ 到 5" 核酸外切酶的活性。目前市面上主要有两类产品:一类是混合型的高保真酶,将带有 Proofreading 活性的酶与普通 Taq 酶(用于提高扩增效率)混合起来;另一类是单一型的高保真酶。 b,热启动Taq酶(高特异Taq酶):在 PCR 第一个循环变性之前,有一个升温的过程,引物和模板会有一些非特异性配对,如果这时 Taq 酶发挥活性,就很容易产生非特异性扩增,由于循环初期模板量非常少,产生的非特异性条带经过后面的指数扩增,就会严重干扰目的片段的扩增,甚至导致特异性条带不能扩出;而热启动 Taq 酶是必需经过高温才能激活的酶,因此在初始循环的变性之前它没有活性,不会产生非特异性扩增,这就大大提高了 PCR 扩增的特异性。c,高耐热Taq酶: 对于有些模板变性温度较高,需要时间较长,可能要求高耐热性 Taq 酶,如 NEB 公司的 Vent 和 Deep Vent DNA 聚合酶系列,两者都是从海底火山口分离出来后克隆的,是普通 Taq 酶耐热性的三倍以上,前者在 95°C 半衰期近 7 小时, 100°C 近 2 小时;而后者分别为 23 小时和 8 小时。d,超长片段扩增Taq酶:对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的科研人员,可能会用到超长片段的扩增, Clontech 公司的 Advantage Genomic 系列混有 Tth DNA 聚合酶, Proofreading 酶和热启动抗体,对复杂模板可扩增 10kb 片段,简单模板可达 40kb 。2023-08-16 14:32:312
功放放大管为什么要同级配对,为什么不是pnp跟npn配对,有什么区别
确切说准互补功放电路的功放输出管是用同极型管子组成的。那是因为一般直接耦合甲乙类功放管必须要用一对NPN和PNP的互补管子组成,旦考这对管子的电流增益不够,为此有必要再复合输出三极管来增大输出电流增益。在选择复合输出三极管时也可以有NPN和PNP和两个都是NPN管子的选择,但一般都选择后者。那是因为三极管是非线性元件,在大电流的情况下要选择两个不同类型的三极管具有相同的输出特性相对比较困难,而同类型的三极管具有相对一致的输出特性则比较容易,尤其是在集成电路制作中,不同类型的三极管是制作在两个不同层面上,参数几乎不可能一致,而同极型三极管的参数特性几乎完全一致。2023-08-16 14:32:381
taq酶结冰
不要离开冰.酶制剂在保存的时候都需要低温保存.在PCR加样中也不要离开冰,这是使PCR进行冷启动,有利于提高扩增特异性. 还有,你说Taq会结冰?这是不可能的.应为酶溶液都是加有甘油的,因此在-20度时也不会结冰.如果确实结冰,说明此Taq已经被污染.2023-08-16 14:32:391
复读机哪个品牌好
比较好的复读机品牌有aigo爱国者、Newsmy纽曼、小霸王、文曲星、Panda熊猫等。1、Newsmy纽曼纽曼公司创立于1996年,现有员工2000余人,是一家集研发、制造、销售、服务为一体的中国高新技术企业。2、小霸王中山市小霸王集团创建于1987年,旗下拥有三大系列产品:电子教育类产品、AV数码产品、卫厨电器系列产品,是目前中国最大的教育产品、电子产品的生产基地。3、Panda熊猫熊猫电子集团有限公司,始创于1936年,是一个具有71年历史的国有综合性大型电子企业。4、文曲星北京金远见电脑技术有限公司,复读机学习机电子词典十大品牌,台北远见集团全资子公司,北京市著名商标,北京市高新技术企业,中国软件行业协会会员。5、aigo爱国者爱国者数码科技有限公司,始于1993年,国际领先的IT品牌,民族数码品牌典范,中国数码科技类产品领域知名企业,移动存储产品销量火爆。2023-08-16 14:32:401
热稳定DNA聚合酶就是taq酶的全称吗?PCR中用到的那个酶……
Taq DNA聚合酶是第一个被发现的耐高温DNA聚合酶2023-08-16 14:32:492
场效应管组成的推挽式功放的原理是怎么样的??
这个电路本身是错的: 那个U3的S极不应直接接地。U3的S极直接接地后,U4b就无存在的意义了。2023-08-16 14:32:491
皮影戏是利用了光的什么原理
皮影戏是利用了光的什么原理我国有一种民间艺术,叫做皮影戏,相信很多同学都在影视剧里见过。皮影戏是一种以兽皮或纸板做成的人物剪影以表演故事的民间戏剧,那么同学们知道皮影戏中有什么物理知识吗?今天科学高分网的小编就来问同学们揭秘一下!皮影制作过程:1、选皮2、制皮3、画稿4、过稿5、镂刻6、敷彩7、发汗熨平8、缀结完成皮影戏中的物理知识。皮影戏中运用的是光的直线传播相关知识。光源发出的光沿直线传播,在传播途中被不透明的“皮影”挡住,在皮影后面的屏幕上,形成与皮影形状完全相同的影子,这是由光的直线传播形成的。光的直线传播的应用。1、激光准直:在开凿大山隧道时,T程师们常常用激光束引导掘进机,使掘进机沿直线前进,保证隧道方向不出偏差。2、射击时利用“三点一线”进行瞄准。3、站队成直线:前面的人挡住了后面人的视线,使后面的人只能看到前面相邻人的后脑勺。4、木工检测木料的表面是否平滑。以上就是科学高分网为同学们讲解的中国皮影戏中包含的物理知识,同学们平时在生活中也可以观察其他的光的直线传播的应用,相信对同学们的物理学习也会有很大的帮助。2023-08-16 14:32:541
raptor中输入变量a b,然后交换两个数,最后输出a b怎么操作?
raptor中输入变量a b,然后交换两个数,最后输出a b怎么操作?2023-08-16 14:32:102
请帮我翻译这句英文
一头成年象每天要吃300磅的食物。为了寻找食物,大象往往长途跋涉。如果它们找不到喜欢的草时,它们会剥掉树皮吃。2023-08-16 14:32:055
福特F150RaptorSuperCrew为底特律发芽后门
策划一场穿越荒野的高速戏?这是你的旅程。这是我们去年在底特律车展上展示的福特F-150猛禽。现在只有四个合适的门。SuperCrewedition包的功能与现有的短SuperCab相同。这意味着3.5升EcoBoostV6比6.2升V8Raptor更好,拥有411马力和434磅-英尺的扭矩。它通过一个十速自动变速箱将动力传递给所有四个车轮,悬架行程超过11英寸,以吸收任何可能抛向它的灰尘路径。这个版本比超级跑车版本长一英尺,有四个全尺寸的入口,而不是两个大门和两个半门。现在,只要迪尔伯恩能告诉我们要花多少钱,有多快就好了。百万购车补贴2023-08-16 14:31:531
技俩,长途跋涉,穷愁潦倒,风尘苦旅,低眉顺眼,生死祸福的拼音,解释?
技俩 [jì liǎng] 手段,花招长途跋涉,cháng tú bá shè 释 义 跋涉:翻山越岭、趟水过河。指远距离的翻山渡水。形容路途遥远,行路辛苦。穷愁潦倒,qióng chóu liáo dǎo 穷愁:穷困愁伤。潦倒:颓丧,失意。形容贫寒困窘,愁苦失意的样子。亦作“羁愁潦倒”、“潦倒穷愁”。 风尘苦旅,fēngchénkǔlǚ形容旅途奔波,忙碌劳累,风尘是用两个名词作形容词用。低眉顺眼, dī méi shùn yǎn 低着眉头,两眼流露出顺从的神情。形容驯良、顺从。 生死祸福shengsihuofu,是含盖人生世事的意思,出自战国·楚·屈原《离骚》。2023-08-16 14:31:533
孩子做事慢拖拉怎么暗示 孩子拖拉如何运用心理暗示方法
1、皮克马利翁效应:这个效应专门治疗那些不积极的孩子,因为曾经罗森塔尔曾经做出了一个这样的实验,他对一些孩子做了一次测试。他发现只要给孩子一些期待,那么孩子就会变得自信,并且变得容易进步。 2、正性强化效应:这个效应主要是为了提高孩子的主动性的,这也是美国心理学家斯金纳提出的一个理论。他觉得如果想要激励一个人,那就要刺激对方发生行为。所以在教育孩子的时候,也可以使用这样的理论,譬如对孩子正性强化,这要比负面的批评好得多。 3、普雷马克原理:这个效应主要是对付那些拖延的孩子,而这个原理也是非常有效的。主要的做法就是,想要实现B,那就必须要完成A,因此,孩子为了达成自己的目的就必须要做成一些事情。可以通过这样的做法,来让孩子克服懒惰和一些缺点。2023-08-16 14:31:521
录音笔十大名牌排行榜
录音笔十大名牌:SONY索尼,OLYMPUS奥林巴斯。aigo爱国者,京华数码,飞利浦PHILIPS,Panasonic松下,Newsmy纽曼,TASCAM达斯冠,Lenovo联想,Shinco新科。SONY索尼,是横跨电子3C、游戏、金融、娱乐领域等大大小小电子领域的世界级公司,拥有世界首屈一指的品牌影响力。奥林巴斯,作为世界相机领域的巨头,凭借着卓越的生产技术和时尚的设计理念在激烈的市场竞争中不断领先推出了引领数码相机发展潮流的全新产品等等。含义智能录音笔是基于人工智能技术,集高清录音、录音转文字、同声传译、云端存储等功能为一体的智能硬件,是AI落地应用场景的代表性产品。与第一代数码录音笔相比,新一代的智能录音笔的特点是可以将录音实时转写为文字。数码录音笔,也称为数码录音棒或数码录音机,数字录音器的一种,为了便于操作和提升录音质量造型并非以单纯的笔型为主,携带方便,同时拥有多种功能,如激光笔功能、FM调频、MP3播放等。2023-08-16 14:31:461
魔兽世界:TAQ的虫炮属性不是很好吗,为什么连猎人都不待见它?
虽然这个属性很好,但是它的杀伤能力不是特别强,所以就有很多人不待见这个英雄。2023-08-16 14:31:355
raptor中的mod是什么意思
在Raptor软件中,mod是用来求余数的运算符。2023-08-16 14:31:341
十二个月的英语单词写法
既然他们都说了,那我来回答最后一个词组可参考http://s5.xswg.com/Students/yyj/20061124/091457.htm单词可参考http://yingyu.tp3.cn/s/15632/ClassList/?LB3LS1=Rt2J4LPlsR2023-08-16 14:31:346
功放的功率大小依靠功放管吗
1、功放的功率=输出电压X输出电流,所以需要做大功率的功放,功放电压、电流要足够大。2、当电流流过功放元件时,又会产生耗散功率(无用功),以发热的形式消耗掉。3、功放管的耐压、耐电流越高、那它的输出功率就可以做得高,就不容易因发热而烧毁。4、你爸爸说的有道理,前提是电源供电功率(包括变压器功率、整流管耐电流值,滤波电容容量等)要满足功放管的需要。5、TDA2030的功率太小了,推不动15寸的喇叭的,TDA2003就更不用说了。2023-08-16 14:31:282
什么是PCR的变性?
无明显同源性。 引物量: 每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接 用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则 需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。 ②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度: Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5~10℃) 在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性: 70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。 PCR反应特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为: ①引物与模板DNA特异正确的结合; ②碱基配对原则; ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性; ④靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增 ,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论。PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 凝胶电泳分析:PCR产物电泳,EB溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件。 琼脂糖凝胶电泳: 通常应用1~2%的琼脂糖凝胶,供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳:6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析。 酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究。 分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 Southern印迹杂交: 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研。 斑点杂交: 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 核酸序列分析:是检测PCR产物特异性的最可2023-08-16 14:31:261