EdU 标记 细胞增殖检测原理 是怎么样的？

在电子耦合试剂（也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢）存在的情况下，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan)。活细胞越多，产生的Formazan就越多，颜色也会越深。Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基－4-硝苯基）－3-(4-硝苯基）－5-(2,4-二磺基苯）－2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。研究方法细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8等方法。其中EdU检测方法是最新的细胞增殖检测方法。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。

增殖是一种在生物医学领域内， 非常常见的表型， 甚至可以说是最常见的一种表型。 细胞增殖是高等生物体最为重要的生命特征。 高等动物体内的细胞，主要有两种增殖的方式。第一种是体细胞的增殖方式： 有丝分裂。 有丝分裂也是最常见的一种增殖方式。 在有丝分裂的过程中， 2 倍体的体细胞在经过有丝分裂之后， 产生两个都是 2 倍体的后代细胞；另一种是性生殖细胞所采用的增殖方式， 被称为减数分裂。 减数分裂最大的特点是， 2倍体的性生殖细胞， 经过减数分裂后， 形成 2 个单倍体的后代细胞。 由于细胞在分裂前是 2 倍体， 而分裂后变成了单倍体， 使得细胞内的染色体数目变成了原先的一半， 因此得名“减数分裂” 。 增殖是最为常见的表型。 无论是正常生理条件下， 还是异常的病理条件下， 无论是正常的细胞， 还是异常的细胞， 增殖现象都是普遍存在的。 一.增殖表型如何检测？ 1.分子层面检测增殖表型 有些分子的表达和增殖的表型有密切的关系， 因此， 只要能检测到这些特定分子的表达， 就表征了增殖现象的发生。 这类分子就是增殖的 marker 分子。 常见的和增殖相关的 marker 分子有如下几种： （1） 与增殖相关的分子标志物 A) MCM （微小染色体维持蛋白， minichromasome maintenance protein， MCM） 。 MCM只存在于真核细胞中。 MCM 在有丝分裂的晚期和 G1 期与染色质紧密结合， 在 S 期和G2 期分开。 MCM 蛋白只在细胞的增殖期才能检测到， 它的表达在 G1/S 转换点达到峰值， 在分化期和静息期时， 表达缺失， 因此可以作为细胞增殖的特殊标志物。 B) 细胞核相关抗原 Ki-67。 这个分子是经典的细胞增殖相关分子标志物， 最早在 1983年在增殖细胞中发现， 目前在病理诊断中使用非常地广泛。 Ki-67 的一级结构比较特殊，还没有发现与之同源的蛋白， 所以目前对于 Ki-67 的功能了解得不多。 推测它可能具有如下的几个功能： 1） 推测 Ki-67 可以调节细胞周期； 2） Ki-67 能和 DNA 或者 RNA 发 生相互结合； 3） Ki-67 在细胞分裂期参与合成核糖体。 Ki-67 在细胞的 G0 期不表达，G1 中期到后期出现表达， S 期和 G2 期表达逐渐增加， 有丝分裂期达到高峰， 细胞分裂后迅速降解。 C) 增殖细胞核抗原 PCNA。 PCNA 又称为周期素， 它是 DNA 聚合酶δ的辅助蛋白。 这个分子也是经典的增殖相关分子标志物， 最早在 1978 年就有所报道。 又因为 PCNA 出现在增殖期细胞的细胞核中， 所以被称之为增殖细胞核抗原。 PCNA 的主要功能有： 1）DNA 聚合酶δ的辅助蛋白； 2） 参与 DNA 损伤的修复； 3） 参与细胞周期的调控； 4）和 p21 相互作用。 P21 是 CDK 的抑制因子， 因此 PCNA 通过和 p21 相互作用， 间接影响细胞周期和增殖。 在增殖细胞的细胞周期中， PCNA 的量会发生明显变化， 它在 G0/G1期几乎没有表达， G1 晚期表达大幅度增加， S 期达到高峰,G2/M 期表达下降。 PCNA 也已经广泛应用于临床病理诊断和相关的生物学研究中。 PCNA 和 Ki-67 作为细胞增殖标志物， 所存在的一些缺陷。 PCNA 和 Ki-67在 G1 早期不表达， 因此在整个细胞周期过程中， 存在表达时间上的间隙。 另外 PCNA 在DNA 修复和复制过程中， 发挥了作用， 这会导致结果的“假阳性”。 就是说某些没有发生增殖， 但是发生了 DNA 修复的细胞， 也会上调 PCNA 的表达， 这会让研究者误以为细胞发生了增殖。 Ki-67 也会有类似假阳性现象的存在， 比如说 Ki-67 的表达水平， 会受到外部因素的影响， 比如在营养缺乏的时候。 MCM 蛋白相对于 PCNA 和 Ki-67 而言， 很大的优势在于整个细胞周期中都有表达， 而且它不受 DNA 损伤修复和其他外部因素的影响。 因此有的研究者认为， MCM 蛋白是优于 PCNA 和 Ki-67 的理想的细胞增殖标志物。 但是从实际的应用层面看， 无论是在临床应用当中， 还是在基础科研当中， PCNA 和 Ki-67 的应用， 都更加广泛。 （2） 和干细胞相关的分子标志物 根据肿瘤干细胞的理论， 肿瘤干细胞是肿瘤中， 具有自我更新的能力并且能够产生异质性的肿瘤细胞。 肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖， 维持了肿瘤细胞群的生命力。 因此， 如果通过肿瘤干细胞相关分子标志物的检测， 证实肿瘤干细胞的数量增加， 这就提示肿瘤的恶性程度高， 间接地说明了肿瘤增殖能力的增强。 例如， CD44 是胰腺癌中肿瘤干细胞常用的分子标志物， 因此可以通过检测 CD44 的表达水平， 证实胰腺癌中肿瘤干细胞的情况， 间接地证实肿瘤细胞增殖能力的强弱。 但是采用这种方法是具有局限性的， 因为不同肿瘤的肿瘤干细胞分子标志物是不同的。 而且在很多肿瘤当中， 肿瘤干细胞的标志物， 还存在很大的争议。所以我个人的建议是， 直接检测 PCNA 或者 Ki-67 之类的细胞增殖相关标志物更好更直接；检测肿瘤干细胞相关的分子标志物， 只能间接地说明肿瘤细胞的恶性增殖情况， 只能算是锦上添花而已。 （3） 检测抑癌基因 检测抑癌基因相关的分子标志物也是一类和细胞增殖间接相关的分子标志物。检测这一类分子标志物， 它存在着如下的一种逻辑推理的过程， 首先， 在细胞内抑癌基因的表达水平或者活性明显下降， 就提示肿瘤的恶性程度明显提升， 间接地说明了肿瘤的恶性增殖表型会有所增加。 在这一类分子标志物当中常见的抑癌基因有两个： p53 和 PTEN。 经常可以看到在论文当中， 通过 western 或者 qPCR， 证实 p53 以及 PTEN 分子表达水平降低， 从而间接地说明肿瘤细胞恶性程度上升， 肿瘤的增殖表型也会显著的提升。 2.细胞层面检测增殖表型 （1） 直接检测细胞的增殖状态 A） 最为经典的方法是 MTT 法。 MTT 是一种染料。 它的检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。 DMSO 能溶解细胞中的甲瓒， 最后用酶标仪在特定的波长处， 测定光吸收值， 可间接反映活细胞的数量。 MTT 法早已成为研究细胞增殖的经典方法。 后续基于类似的实验原理，还在 MTT方法的基础之上，演化出了各种不同的替代技术，比如 CCK8染色实验等等。 在做 MTT 实验的时候， 通常取 5 个时间点（通常就是 5 天） 。 把 5 天中每一天的吸光度数据都记录下来， 最后形成一条细胞增殖的曲线。 通过比较不同处理方式或者不同实验组之间， 细胞增殖曲线的高低， 就可以判断细胞增殖情况的快慢。 B） 另一种经常用于检测细胞增殖的经典方法是 Brdu 染色法。 Brdu 是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的 DNA， 可以代替胸腺嘧啶， 选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。 这种渗入可以稳定存在， 随着 DNA 的复制， Brdu 可以进入子代细胞中。 Brdu 特异性抗体可以用于检测 Brdu 在细胞 DNA 中的渗入， 从而判断细胞增殖能力的变化。 通常在使用 Brdu 单克隆抗体之后， 都会结合免疫荧光染色， 显示增殖的细胞， 同时结合其他细胞标记物， 进行双重染色， 可以判断增殖细胞的种类， 增殖细胞的增殖速度， 对研究细胞动力学有重要的意义， 因为组织细胞内没有内源性 Brdu 的存在， 所以这种方法用于检测细胞的增殖， 应用非常广。 另外， 通过 Brdu 染色法可以提供影像学相关的数据， 这比单纯采用MTT 法（只能提供简单的折线图） ， 要更富有视觉效果。 基于 Brdu 染色方法， 又演化迭代出 Edu 的染色方法。 Edu 也是一种胸腺嘧啶核苷类似物， 能够在 DNA 复制时期代替胸腺嘧啶， 渗入正在合成的 DNA 分子中。 而且在检测的时候， 直接采用荧光染料与 Edu 特异性反应， 直接准确地检测出 DNA 复制活性， 能更有效地检测细胞增殖现象。 C) MTT 法或者 Brdu 染色法， 这类技术都属于 End-point assay（终点分析法） 。 因为这类技术对于细胞都有破坏作用， 在检测过程中， 细胞已经死亡， 结构也不再完整。 因此， 有公司（例如罗氏） 研发了实时记录细胞增殖状态的设备和方法， 这种设备成为 RTCA（real time cell analyzer， RTCA） 。 RTCA 这类技术的特点就是实时（real time） 。 RTCA 实时细胞分析仪， 需要用到特定的细胞培养板（被称为 E-plate） ， 在 E-plate 每一个孔的底部都含有特制的电极。 电极的作用就是实时记录孔内的电阻抗（electric impedance） 。 当细胞在孔内发生粘附， 转移， 增殖的时候， 孔内的电阻抗发生变化， 被电 极实时记录， 研究者也就获得了相关的实时数据。 不过需要特别强调的是， 采用这种 RTCA的方法， 不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取， 也可以用来检测细胞的黏附， 细胞的凋亡、细胞的转移等等， 所以它的应用范围是非常广的。 （2） 检测细胞的克隆形成能力 肿瘤细胞由于恶性程度高， 因而还具有一类特殊的增殖能力--被称为克隆形成能力。 正常细胞在增殖的时候， 需要细胞与细胞之间的信号传递。 这些信号的存在， 使得正常细胞增殖过程中， 可以有序地受到调控。 但是肿瘤细胞具有高度的恶性， 它的增殖是不受调控的， 所以即便缺少细胞之间的交互和信号通路， 肿瘤细胞也可以由单独一个细胞， 增殖形成大量的子代细胞， 最终形成一个细胞克隆。 这种现象就被称之为克隆形成能力， 可以通过克隆形成实验， 加以检测。 对于干细胞， 也有一种类似于克隆形成实验的技术， 用于检测干细胞的增殖能力， 这种方法被称为“干细胞悬浮成球试验” （microsphere formation assay） 。 鉴定干细胞需要很多的指标， 能在离体条件下， 形成微球/悬浮球（microsphere） 是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。 3.组织层面检测增殖表型 （1） 检测分子标志物 临床上最容易获得的组织样本， 通常都是石蜡切片。 基于石蜡切片， 可以进行免疫组织化学IHC 的研究， 检测和增殖相关的分子标志物， 比如 PCNA 和 Ki-67。 （2） 细胞形态和组织结构上的差异 在临床组织样本当中， 除了检测和增殖表型相关的分子标志物之外， 还可以通过形态学的方式， 检测细胞形态的多样性和组织结构上的巨大差异。 通过石蜡切片的染色实验， 可以观察到恶性肿瘤细胞一般比正常细胞要大。 而且即便是同一种肿瘤， 在相同的组织部位， 肿瘤细胞的大小和形态也会很不一致， 很不均匀， 有时甚至会出现巨细胞。 在有些肿瘤细胞的细胞核内， 会出现细胞核体积增大的现象， 这就使肿瘤细胞的细胞核与细胞浆的比例异常。 肿瘤细胞的细胞核大小， 形状都很不均一， 甚至会出现巨核、双核、 多核或者是形态奇异的奇异型细胞核。 通过详细的形态学观察可以判定细胞发生了恶性增殖。 正常组织当中， 是由很多不同类型的细胞所组成。 不同类型的细胞在组织内， 以特定的、 有序的排列顺序， 组成了健康的组织。 但是在组织内发生肿瘤之后， 由于肿瘤细胞发生不受控制的恶性增殖， 并且挤压了周围的正常细胞， 导致整个正常组织内细胞的有序排列顺序被破坏， 组织内不同类型细胞的排列结构发生异常。 通过对于组织内部细胞排列顺序和排列结构的检测， 也能够获得肿瘤细胞发生恶性增殖的证据。 4.动物层面检测增殖表型 大部分的疾病类型都有与之相对应的， 可用于研究的动物模型。 在肿瘤研究当中， 用于研究增殖相关表型的动物模型， 最常见的就是移植瘤动物模型。 在移植瘤当中， 为了获取和增殖相关的表型， 通常要记录几个参数， 比较简单的有肿瘤的大小也就是体积， 其次是肿瘤的重量， 这些参数是反应肿瘤大小和细胞增殖特性， 最直观的数据。 有了移植瘤的样本之后， 我们还是可以通过降低维度的方式， 以移植瘤的样本作为检测对象， 检测分子标志物以及检测细胞相关的行为学和形态学。 二.总结 u200b

没有确定的最大和最小值，Cell Counting Kit-8（简称 CCK-8 ）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。 其 基本原理 为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基 苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能够反应材料在体内的生物活性，具体检测方法如下：1.SBF 配置由于SBF 溶液对于磷灰石过饱和，所以配备方法不恰当会导致溶液中磷灰石沉淀产生。整个配备过程需要确保溶液无色、透明，容器表面无沉淀出现，如果过程中产生沉淀，倒去溶液，洗净仪器重新配制。准备一个 1000ml 的塑料烧杯。首先于塑料烧杯中装好 700ml 离子交换蒸馏水、一个适当大小磁子，杯口密封以蒸发皿或塑料薄膜。搅拌并调节水温至 36.5±1.5C。按表1所列顺序在 36.5C 恒温下逐个溶解第一到第八个化合物，溶解过程表1 配置1000 ml SBF 溶液时试剂添加顺序、添加量 Order Reagents Amounts Containers Purities（%） Formula weights 1 NaCl 8.035 Weight paper 99.5 58.4430 2 NaHCO3 0.355 Weight paper 99.5 84.0068 3 KCl 0.225 Weight bottle 99.5 74.5515 4 K2HPO4·3H2O 0.231 Weight bottle 99.0 228.2220 5 MgCl2·6H2O 0.311 Weight bottle 98.0 203.3034 6 1.0 M-HCl 39ml Graduated cylinder — — 7 CaCl2 0.292 Weight bottle 95.0 110.9848 8 Na2SO4 0.072 Weight bottle 99.0 142.0428 9 Tris 6.118 Weight paper 99.0 121.1356 10 1.0 M-HCl 0-5ml Syringe — — 2.磷灰石形成能力测试对于密质薄片材料，测出样品尺寸并计算样品表面积精确到 2mm 应用如下公式计算出 SBF 用量：Vs=Sa/10,Vs（ml）是 SBF 的体积量，Sa（mm）表示样品的表面积。对于多孔材料，SBF 的用量应大于上式计算量准备好塑料瓶或烧杯，装入计算出的 SBF 体积量加热到 36.5C， 然后按示意图往里放置样品。 笔记：样品在容器中放置有两种情况，如图 1(a)，1(b)。少数情况下，SBF 溶液会生成同 质磷灰石沉积于样品表面。所以如果样品放置是图 A1(b)种情况，表征实验应该检测样品的 下表面。 四个星期内，分别取出恒温浸透不同时长的各组样品，纯水轻盈洗净。然后将样品放入干燥 器中常温干燥。图1 SBF中样品浸泡示意图 1.四唑盐（MTT）比色法：检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色法试验（MTT）。此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（OD），选波长490nm。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。3.2.2 CCK-8 法Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。● 制备细胞悬液：细胞计数● 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。● 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。●加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。●培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。●测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。优点1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT法；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

2。1、cck8的吸光度读数是针对不同的菌种和不同的培养基均不同，需要自己前期做一个标准曲线。2、也就是用培养基为空白对照，不同生长阶段发酵液为样品测定OD值，并测定这些阶段的活菌数，此后再按照发酵时间对比标准曲线得出单位活菌数。3、一般读数为2最合适，十几的话可能就是培养液中产生了吸光色素之类的。

我们在实验过程中,经常被该如何设计实验而困扰,不知从何下手开展实验,细胞实验作为被经常用到的体外实验,在科研工作中占有很大的比例。下面就盘点一下实验室常用的细胞实验技术1细胞增殖常用来检测细胞增殖的方法是CCK8法和Brdu法。CCK8主要通过分光光度计进行检测,OD只越高,说明存活的细胞越多,增殖能力强。Brdu是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中,最后通过荧光强度的变化来判定细胞的增殖能力。

cck8实验算出大于百分之百的存活率正常。细胞毒性通常是指在某一个药物处理浓度下细胞的死亡率，所以在某个浓度下细胞的存活率与100%之间无统计差异，那么就说在该浓度下是无毒的。但是如果笼统的说某个药物是否有毒，是在说该药物相对毒性大小，通常要比较IC50，即半数致死量。化疗药物的IC50通常<10uM，如果要说某个药物无任何毒性，那么其IC50值可能要>1mM。不过这个并没有严格的定义，你可以设计个阳性对照。基本概念意义：细胞增殖是生活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征。细胞的增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。方式：真核生物的分裂依据过程不同有三种方式，有有丝分裂，无丝分裂，减数分裂。其中有丝分裂是人、动物、植物、真菌等一切真核生物中的一种最为普遍的分裂方式，是真核细胞增殖的主要方式。减数分裂是生殖细胞形成时的一种特殊的有丝分裂。

cck-8孵育时间1~2h足够，孵育前将孔里原来的 液体吸尽，cck-8与新鲜培养基按照1：10比例混匀后，每孔加入100ul,孵育1h，上机检测OD450。

CCK-8计算增殖速率有两种方法，一种是绘制生长曲线，计算线性阶段的吸光度的均值另一种是计算某时间点的（实验组与对照组吸光度的差值）/对照组的比率

不能。1、CCK8可以检测大肠杆菌，但不能在一个板子上检测ros细胞，需要分开测量。2、在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。

6孔板的情况下直接加药，无需更换培养基，记得两组的细胞浓度要稀释到差不多

建议用CCK8，可以直接加CCK8到细胞内

查查与其同源的基因在其它生物尤其是亲缘关系很近的生物体内有没有已经被证明功能的，或者猜想与什么功能有关的。寻找突变体（该基因缺失的个体）或者设计序列沉默该基因，然后观察其表型和正常个体有什么差别。寻找该基因过量表达的个体，观察表型和一般个体的差异，也可以作为一个参考。这些知识给你的研究提供思路，最后你要克隆得到该基因，在一个该基因缺失的突变体（株）内表达该基因，如果你在该个体内检测到表达并且该个体和一般个体性状差异消失，那么证明该个体是控制此性状的基因（之一）。

额。 96个孔除去你加的8个对照品而外，其他的孔全部用来加样品，88孔，88种样品（按照的说法的话，88个孔可以同时检测88个病人的某一指标），也就是可以检测88种样品的结果，如果你每个样品准备做复孔求平均值的话，可以检测44种样品。

DMSO可以提高PCR的特异性，帮助扩增一些难扩的模板。但要摸索，量大的话会抑制扩增，而且最好用于扩增1KB以上模板。

还是比较常用的. 但是因为MTT价格相对CCK-8试剂盒更便宜,实验室更较多采用MTT法.CCK-8法更灵敏,而且不用用DMSO溶解,减少接触有毒试剂的机会. 96孔板培养细胞,检测时每孔加入10%培养基体积的CCK-8,在细胞培养箱中继续孵育0.5-4个小时,时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定,初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测,检测波长为450nm.

不需要，如果你的药物需要饥饿处理，那就另当别论，就CCK8检测而言是不需要的。

标准曲线法中为消除试剂影响，最适合用十字校验来进行零点校正，通过对十点四个角和方向来进行的这种情况也可以，更好更准确完成校验

终点法。一、实验原理：细胞活力检测试剂盒(CCK-8)可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】。在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪_硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。二、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。三、优点：使用方便，无需洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂。CCK-8法能快速检测。CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度。CCK-8法的重复性优于MTT法，产生的formazan是水溶性的，减少因洗涤和溶解带来的误差。CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT方法相比线性范围更宽，灵敏度更高。CCK-8细胞活性检测试剂无需预制，即开即用。

细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8等方法。CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒是西安百萤生物生产的一种基于 SST-8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。其主要成分为水溶性四唑盐 SST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，SST-8 是一种类似于 MTT 的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜（formazan，参考图1)。SST-8 被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系

cck8实验怎么看有没有细胞毒性CCK-8是一种基于WST-8的检测细胞增殖和细胞毒性的方法。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。数据呢，一般根据原始资料来选择统计分析方法，肿瘤细胞cck8增值这是什么，这个一般是计量资料，如果符合正态分布及方差齐性检验，可以用t检验或方差分析，不符合可以采用非参数检验，即秩和检验。

数据呢，一般根据原始资料来选择统计分析方法，肿瘤细胞cck8增值这是什么，这个一般是计量资料，如果符合正态分布及方差齐性检验，可以用t检验或方差分析，不符合可以采用非参数检验，即秩和检验。

cck8实验怎么看有没有细胞毒性CCK-8是一种基于WST-8的检测细胞增殖和细胞毒性的方法。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。数据呢，一般根据原始资料来选择统计分析方法，肿瘤细胞cck8增值这是什么，这个一般是计量资料，如果符合正态分布及方差齐性检验，可以用t检验或方差分析，不符合可以采用非参数检验，即秩和检验。

一、含义不同：空白试验是指在不加试样的情况下按试样分析，规程在同样的操作条件下进行的分析。所得结果的数值为空白值。然后从试样测得结果中扣除此空白值就得到比较可靠的分析结果。对照实验就是进行两组实验，控制变量，比较不同。二、作用不同：对照组采用一种无药理作用的假药，它在药物剂型或处置上不能为受试者识别，称安慰剂。用现有标准方法或常规方法做对照。这种对照在临床试验中用得较多，因为很多情况下不给病人任何治疗是不符合医德的。另外，还可用于某种新的检验方法是否能代替传统方法的研究。条件对照指虽给对象施以某种实验处理，但这种处理是作为对照意义的，或者说这种处理不是实验假设所给定的实验变量意义的。例如，“动物激素饲喂小动物”实验，采用等组实验法，其实验设计方案是：甲组：饲喂甲状腺激素（实验组）；乙组：饲喂甲状腺抑制剂（条件对照组）；丙组：不饲喂药剂（空白对照组）。显然，乙组为条件对照，该实验既设置了条件对照，又设置了空白对照，通过比较、对照，更能充分说明实验变量——甲状腺激素能促进动物的生长发育。以上内容参考：百度百科-空白对照组

不变颜色最好，变了没准是污染了。如果是观察细胞死活状态什么的，推荐用显微镜观察、细胞计数什么的。推荐注意拍照，保存好实验记录。

　　rightleder超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤原理也是一种膜分离过程原理，超滤利用一种压力活性膜，在外界推动力(压力)作用下截留水中胶体、颗粒和分子量相对较高的物质，而水和小的溶质颗粒透过膜的分离过程。通过膜表面的微孔筛选可截留分子量为3x10000—1x10000的物质。当被处理水借助于外界压力的作用以一定的流速通过膜表面时，水分子和分子量小于300—500的溶质透过膜，而大于膜孔的微粒、大分子等由于筛分作用被截留，从而使水得到净化。也就是说，当水通过超滤膜后，可将水中含有的大部分胶体硅除去，同时可去除大量的有机物等。超滤原理并不复杂。在超滤过程中，由于被截留的杂质在膜表面上不断积累，会产生浓差极化现象，当膜面溶质浓度达到某一极限时即生成凝胶层，使膜的透水量急剧下降，这使得超滤的应用受到一定程度的限制。为此，需通过试验进行研究，以确定最佳的工艺和运行条件，最大限度地减轻浓差极化的影响，使超滤成为一种可靠的反渗透预处理方法。　　原水-原水加压泵-多介质过滤器-活性炭过滤器-软水器-精密过滤器-一级反渗透设备-中间水箱-中间水泵-离子交换器-纯化水箱-纯水泵-紫外线杀菌器-微孔过滤器-用水点 (2000版中国药典传统工艺)原水-原水加压泵-多介质过滤器-活性炭过滤器-软水器-精密过滤器-第一级反渗透-PH调节-中间水箱-第二级反渗透(反渗透膜表面带正电荷)-纯化水箱-纯水泵-紫外线杀菌器- 微孔过滤器-巴氏消毒—用水点 (2005版中国药典目前流行工艺)原水-原水加压泵-多介质过滤器-活性炭过滤器-软水器-精密过滤器-一级反渗透机-脱气膜-中间水箱-中间水泵-EDI系统-纯化水箱-纯水泵-紫外线杀菌器-微孔过滤器-巴氏消毒-用水点 (2005版中国药典新工艺 )

公元1912年是民国元年，往前推三十年是公元1882年，当时处于慈禧太后垂帘听政的清朝末期。

towel gourd是丝瓜

它是控制发动机怠速的位置安装在电喷嘴上方

热力环流说明了只要有冷热差异后，就会引起气流的运动，最终形成环流。城市与乡村比较，因为燃烧化石燃料排放的废气更多，汽车尾气的排放以及植被也较缺乏稀疏，所以城市大量废气吸收地面辐射而稳定比郊区更高，越接近城市稳定越高，越接近市中心附近就越高，所以形象称之为热岛，由于城市温度高气流上升，近地面形成低压，郊区温度较低气流下沉，近地面形成高压，所以近地面就会形成从郊区到城市的风，高空风向从城市到郊区，从而形成了热岛环流。同理海陆热力性质不同(同一时间吸热放热速度不同，所以海陆温度总是不同)，白天时，陆地温度高于海洋，所以陆地气流上升，近地面形成低压(类似于城市)，海洋温度较低气流下沉，近地面形成高压(类似于郊区)，近地面的风从海洋吹向陆地，高空风相反，形成了环流，夜晚时，陆地气温低，海洋气温高(相当于城市郊区的角色晚上互换了)同理也形成了环流。我们把近地面随昼夜交替而变化的风就称之为海陆风。

退休年龄是国家规定的，公务员不应该有特权，不到法定退休年龄是不能退休的，除非你失去了劳动能力，经专业鉴定机构鉴定，符合病退条件，经社保中心批准后才可以提前退休

毛巾的英文是towel。一、毛巾释义：n.毛巾；纸巾；手巾；抹布。vt.用毛巾擦干。二、towel的用法：作及物动词：表示为“用毛巾擦”。作不及物动词：表示为“用毛巾擦干身体”。作名词：表示为“毛巾，手巾；（纸）纸巾”。三、towel的短语搭配：towel ring毛巾环；手巾环；毛巾挂环；毛巾圈。sanitary towel卫生带；卫生巾；月经垫；护垫。face towel面巾；洗脸毛巾；小方巾；毛巾。towel rack毛巾架；浴巾架；纸巾架。tea towel茶巾；擦拭杯盘用的抹布；抹布。Towel的造句：1、You just wanted to hand him a towel and give him a hug.你就特别想递给他块毛巾，然后拥抱他。2、Clever beach towels and creative towel designs from all over the world.以下呈现全球富有创意和设计聪颖的沙滩毛巾。3、It can produce wet towel with air-laid paper, non-woven fabric and the packaging is round-sealed.可生产无尘纸、无纺布的湿巾产品，包装严实。4、I like to towel off by rubbing hard after a bath or swim.洗澡或游泳后，我喜欢用毛巾使劲擦搓把身体弄干。

1、使用膜清洗不同超滤：超滤用的膜可以通过反洗来有效的清洗膜面，以保持其高流速。反渗透：反渗透用的膜不能反洗。2、原理不同超滤：超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤原理也是一种膜分离过程原理，超滤利用一种压力活性膜，在外界推动力(压力)作用下截留水中胶体、颗粒和分子量相对较高的物质，而水和小的溶质颗粒透过膜的分离过程。反渗透：把相同体积的稀溶液（如淡水）和浓液（如海水或盐水）分别置于一容器的两侧，中间用半透膜阻隔，稀溶液中的溶剂将自然的穿过半透膜，向浓溶液侧流动，浓溶液侧的液面会比稀溶液的液面高出一定高度，形成一个压力差，达到渗透平衡状态，此种压力差即为渗透压，渗透压的大小决定于浓液的种类，浓度和温度，与半透膜的性质无关。若在浓溶液侧施加一个大于渗透压的压力时，浓溶液中的溶剂会向稀溶液流动，此种溶剂的流动方向与原来渗透的方向相反，这一过程称为反渗透。3、优点不同超滤：超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冷冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。反渗透：压力是反渗透分离过程的主动力，不经过能量密集交换的相变，能耗低；反渗透不需要大量的沉淀剂和吸附剂，运行成本低；反渗透分离工程设计和操作简单，建设周期短；反渗透净化效率高，环境友好。参考资料来源：百度百科-超滤参考资料来源：百度百科-反渗透

夏季陆地升温较海洋为快，陆地近地面空气受热上升，气压下降，海洋上空的空气补充过来，形成海洋吹向陆地的夏季风。

月明星稀:指月亮很明亮时，星星就显得很稀疏了。出自曹操的《短歌行》“月明星稀，乌鹊南飞。”

“月明星稀，乌鹊南飞”直接释义：月光明亮星光稀疏，一群寻巢乌鹊向南飞去。2、在曹操《短歌行》中：用来比喻那些犹豫不定的人才，他们在三国鼎立的局面下一时无所适从，曹操以乌鹊南飞的情景来启发他们，不要三心二意，要善于择枝而栖，赶紧到自己这一边来。

海水比热容小于陆地比热容白天陆地温度高于海面温度。夜晚降临陆地气温低于海面气温，热气上升冷气下降，海陆之间形成热力环流。低空风由陆地吹向海面，冷热交替形成降水锋面，就下夜雨了。好多年不做地理题，大概就是这个原理吧。

三年前，陈冠希被爆出出轨女模，但是双方都没有解释这件事情，后来也逐渐平息了

热力环流是大气运动最简单的形式，由于地面的冷热不均而形成的空气环流。其形成过程为：受热地区大气膨胀上升，近地面形成低气压，而高空形成高气压；受冷地区相反，从而在近地面和高空的水平面上形成了气压差，促使大气的水平运动，形成高低空的热力环流。热的地方空气受热膨胀上升，冷处收缩下沉。于是上空相同高度处，热地方单位面积空气柱重量（即气压）大，冷地方高空气压小，高空形成热－冷的气流。热处气流流失后，整个空气柱减轻，地面形成低压，冷处则形成高压，近地面形成冷－热的气流。加上上升、下沉气流，构成了热力环流。

初看这本书是在2014年，那年我研究生毕业，已经失掉了作为学生的纯真之心，很难静下心看长篇巨作。 但这本书，让我几天几夜没合眼，从头到尾一气呵成。直到现在这本书也是我KINDLE里的常驻之客，无聊时就翻出来，每次都收获良多。 这本书是一本经济历史学的科普读物，也是描写改革开放最为宏大最为细致的一本书。从专业性来说， 比罗纳德科斯的《变革中国》稍差一池（科斯是诺贝尔经济学奖获得者，专业水平首屈一指，《变革中国》也很值得一看），但可读性更胜一筹。 这本书以编年史格式讲述了中国企业从改革开放到千禧年之后的成长之路，时间跨度1978-2008三十年。每一年为一章，每章中，择政策变化、经济景气、社会事件讲述，穿插以典型之企业家的生平经历，让人读来手不释卷。 作为改革开放的主体，本书将企业以所有制划分为三个阵营：国有企业、民营企业、外资企业，然后以此三者之间的此消彼长进行论述。 这本书最值得称道的地方是把中国三十年之企业发展史通过典型企业家人物的起伏来讲述，即可当作经济历史学，又有精彩的故事引人入胜，在描述改革开放的书籍中，与描写明史的《明朝那些事》不遑多让。 不同于其他专业性较强的经济或财经学著作，这本书最为我称道的是贯穿于史料中，对于时代和人生的思考。 比如在改革开放伊始面对挫折时，国家领导集体的决心和远见，他写到： “改革是一项特别复杂的社会系统工程，不可能在事先设计的天衣无缝的情况下进行，改革过程中不同利益群体的摩擦和碰撞是不可避免的。” 在描述个人发展如何适应社会发展大势时，他写到： “世事的起伏本来就是波浪式的，人们要是能够趁着高潮一直向前，一定可以功成名就，要是不能把握机会，就要终身蹉跎，一事无成。” 在爱国和个人利益之间，他提到98年大使馆游行大学生的表现： “学生的情绪很微妙，北京大学计算机系的学生在学校贴出标语-‘抵制美国货，除了计算机"，而更多地学生在白天的游行结束后，晚上又到等下复习托福。” 在谈到企业家群体在暴富之后急于占领道德制高点时，他写到： “一个很突出的现象是，凡是儒商涌现最多的地方，往往是那些最热门灰色、最有暴利倾向的行当。《中国经营报》的记者曾发现一个秘密：中国的地产巨头几乎都自诩为儒商，而京城的地产界更是‘理念人人有，儒商遍地走"。” 这些记载和感悟，让人不得不感叹于吴晓波对这个激荡时代极为精准的眼光，对个体命运起伏极为敏锐的感受。 《激荡三十年》，几乎耗尽了吴晓波作为财经作家的所有才华，以至于这两年出版的《腾讯传》和《激荡十年：水大鱼大》，非常不好看。 他在某一期《吴晓波频道》回答观众问题“人是不断进步的还是有所退化的？”，曾提到退化最典型的是周国平。 周国平在上世纪80年代就写出了《尼采：在实际的转折点上》，启蒙了那个激荡年代整个中国的哲学思考。 但2000年以后，却只能写写风花雪月，给大众灌灌无用的鸡汤，从先锋的变革哲学家退化成一位庸俗的人生导师。 吴晓波举周国平的例子恰如其分，但很不幸的是，吴晓波先生本人的才华也是以肉眼可见的水平下降。或者更准确的说，心不在焉。 他用精力大部做自媒体，忙于变现和赚钱。这也可以理解，拥抱时代获得财富，无可厚非，尤其是财经作家，本身所接触到的都是富商权贵，金钱的影响会比其他人更甚。 只是《激荡三十年》这种作品，再多的金钱也换不回。 这种作品，需要无与伦比的才华、精力与拼搏作为祭品。读这本书，我能看到年轻的吴晓波白天辛苦的爬山涉水搜集材料，晚上在灰暗的台灯下孤独伏案。 幸好在他最有才华的时代，凝结出这本书，让读者有机会一瞅这个宏大的时代，总归不负吴晓波先生40余年的努力和付出。 当然，这本书如此好看，最根本的是改革开放开启的这个时代，惊心动魄，精彩万分，而我们，都是当事人。 《一年6万美元，普通学渣如何拿到美国博士全奖》 《江歌案-别让民意越过了法律》 《我为什么反对减负和素质教育》 《战争与股市，人性贪婪最直观的展现》 《我喜欢的那个姑娘，像武藤兰》

超滤净水器是使用超滤技术对水进行净化处理的设备，其主要的特点就是在净水器当中安装了超滤膜。超滤膜的平均孔径大概为10-100埃，能够分离大分子溶质。超滤膜大多由醋酯纤维或与其性能类似的高分子材料制得。最适于处理溶液中溶质的分离和增浓，也常用于其他分离技术难以完成的胶状悬浮液的分离。目前市场中的超滤净水器多数为3级或者5级过滤系统。下面以三级过滤为例：第一级为0.01微米超滤膜：拦截病菌、泥沙铁锈等杂质、保留矿物质、无废水、寿命大于3年，抗污染、耐腐蚀PES膜，无需另加活性碳等前置二级保护。第二级为颗粒活性炭：吸附水中异味、异色、余氯、有机物、部分重金属等。第三级为泰克物理防垢：不用盐、保留矿物质、不改变弱碱性、不再结坚硬水垢、健康环保、滤芯寿命大于5年。不论是三级还是五级过滤主要还是要看过滤膜的精度如何，如果滤芯不够好的话即使是五级过滤也不会比三级过滤效果好。

4线是两组电磁线圈。

没有。这个名字近年来很受家长的欢迎，它有着温柔、有韵律感的读音，名字含义也很积极，非常独特有魅力。名字的起源，拿俄米的前半生是很苦，当她的丈夫和两个儿子相继离世后，只剩下媳妇路得陪伴她。她为路得献计，促成她与财主波阿斯的婚姻。拿俄米不自私的对待路得，而且与路得的情谊深厚，彼此间没有年龄的隔膜。后来路得生了第一个儿子，在抱去给祖母拿俄米看时，拿俄米内心真是欢喜快乐，本来失去儿媳，现在却一并获得儿媳与孙儿。

forgetforgotforgotten

该种灭火方式从热力环流方面分析。燃烧处（山火）气温高，气流上升，四周气流汇入，点"倒火”之后被着火点吸引，从而烧掉大火前进路上的易燃物，进而熄灭山火。总而言之，以火灭火不是为了消耗氧气，是为了提前把可燃物烧掉。

你好，一年之约，三年之痛，五年之离，七年之痒，十年之守，二十年之亲，三十年之珍。大概是这样。

认输

中国市场上的净水设备大致可分为净水器和纯水机两大类。所谓净水器就是去除水中的悬浮物以及对人体有害的有机化合物，无机化合物，重金属，细菌，又能保留人体所需要的向量元素和矿物质的产品；所谓纯水机就是滤除水中所有的杂质，只剩下完全纯净的水分子。长期饮用纯净水是不利于人体健康的，纯水失去了人体所需的微量元素，长期饮用对身体不利。所有，我们可以选择超滤膜净水器，但是超滤膜净水器过滤原理及过滤方式如何？　　超滤膜过滤原理　　超滤是一种与膜孔径大小相关的筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。　　超滤膜过滤方式　　一个中空纤维超滤膜组件主要是由成百到上千根中空纤维丝和膜壳两部分组成，一般将中空纤维内径在0.6-6mm之间的超滤膜称为毛细管式超滤膜，毛细管式超滤膜因内径较大，因此不易被大颗粒物质堵塞，更适用于过滤原液浓度较大的场合。　　1.内压式过滤：　　原液先从膜丝内孔进，经压力差驱动，沿径向由内向外渗透过中空纤维成透过液为内压式过滤，内压式过滤可以使用高压大流量的顺冲洗，使冲洗水流与膜孔成切向方向快速流过，从而可以将吸附在膜内孔表面上的污染物冲去，恢复膜的水通量。　　2.外压式过滤：　　原液经压力差驱动沿径向由外向内渗透过中空纤维膜丝成为透过液，而截留的物质汇集在中空丝的外部时为外压式过滤。：外压式超滤膜密封在膜壳内，水流的死角多，无法使用快速直冲的方法清除膜表面附着的污染物，因而不能完全去污。

英文名：Lily Loveless中文译名：莉莉·拉芙莱斯 　　出生日期：1990年4月16日 　　出 生 地：英国 伦敦 　　身 高： 1.67m 　　星 座： 白羊座 　　特长：钢琴 　　喜欢:地下摇滚乐，Lily Allen，Arctic Monkeys ，Red Hot Chili Peppers，Florence and the Machine 　　最为人熟知的：英国4频道剧集/喜剧《皮囊》（Skins）中扮演Naomi Campbell(内奥米·坎贝尔) 支持的球队：阿森纳/Arsenal主要作品2009 《皮囊》（skins S03）Naomi Campbell 2010 《皮囊》（skins S04）Naomi Campbell 　　2011《Bedlam》S01E03 饰 Sadie 　　2011电影《sket》Hannah 　　2011 《灵界》（The Fades 另译：亡灵）第一季 饰 Anna