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DNA片段应选择哪一种测序方式
测序有DNA测序和RNA测序,之前比较早的测序是以芯片为基础,现在常用的是二代测序,全基因组的测序以及RNA-seq,目前比较高级的还有单细胞测序。随之而来的是第三代测序技术, 第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术,这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本。
DNA测序的测序原理:
DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列,也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。
其原理是化学试剂处理末段DNA片段,造成碱基的特异性切割,产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物,经凝胶电泳分离。化学切割反应:包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。
另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
二代测序原理及应用
二代测序又称为高通量测序(High-throughput sequencing),是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。关于二代测序的临床应用:二代测序作为一种检测手段,主要应用于基因的生殖变异(遗传性)与体细胞变异(获得性)的检测。对于遗传病,主要的技术方案是靶向区域测序(targeted panel),全外显子测序(whole exome),全基因组测序(whole genome)和线粒体DNA测序。其中,靶向区域测序主要针对明确表型的疾病相关基因进行测序,常见的panel有:免疫缺陷panel,骨髓衰竭综合征panel,致盲或致聋缺陷panel,线粒体病panel,肾脏疾病panel,神经疾病panel,结缔组织疾病panel,心肌疾病panel和遗传性肿瘤易感panel等。靶向测序类方案有最大的特点是不同实验室由于方案制定与panel设计的年代局限,检测的基因范围都会有不一样。对于肿瘤类检测,由于针对的样本类型不一样,使用场景的设计不一样。更是大多区分为:1.针对每个基因的编码区域,或者加上UTR甚至外显子的边沿(exon padding,为了更好的发现剪切体变异--splicing mutation),2.针对某些临床证据或者药物作用靶点/耐药位点的特定热点(hotspot panel)。另外还有基于胎儿游离DNA的NIPT也是二代测序在转化医学中非常经典的应用例子。随着技术的成熟,二代测序也开始应用于肿瘤游离DNA的检测,HLA的分型,病原体检测,转录组测序,以及甲基化测序。但是这些领域的应用,特别是对ctDNA的二代测序应用于肿瘤早筛,学界仍存在担忧,作者主要是提出两点:1.在正常人的游离DNA中也能检测出假阳性的驱动变异,2.在某些早期阶段的肿瘤,ctDNA NGS的灵敏度可能存在不足(30%~60%)。这两点可能限制ctDNA用于肿瘤早期筛查的适用性。关于二代测序的技术方案:目前二代测序主要技术方案,是靶向区域测序(panel),从靶向区域获取的技术来区分主要分为液相捕获技术(采用RNA探针或者DNA探针),以及PCR目标区域捕获技术。通常的,液相捕获是先把DNA片段化为特定的长度(酶切或者超声),加入接头,然后用探针捕获。而PCR捕获不需要DNA片段化,直接先PCR把目标区域富集然后再加接头。而不论是哪种捕获技术,靶向区域测序一般都有以下环节:DNA提取,文库制备,目标区域富集,上机测序四大环节。DNA提取:常规DNA提取一般都能满足二代测序的样本要求。但是对于肿瘤的FFPE样本处理起来要特别小心,特别是对于陈旧的样本来源,DNA损伤与降解非常常见,而且FFPE样本一般要经过显微切割与脱腊等步骤,也可能造成DNA的得率的下降。DNA提取的一个很关键的质控步骤,一般选择Qubit来定量,因为低浓度DNA Qubit的测量值比NanoDrop相对更灵敏一点。2023-08-14 18:50:311
高通量测序技术及原理介绍
高通量测序技术及原理介绍如下:高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(“Next-generation” sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展,科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(de novo sequencing),获得该物种的参考序列,为后续研究和分子育种奠定基础。对有参考序列的物种,进行全基因组重测序(resequencing),在全基因组水平上扫描并检测突变位点,发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序,从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究。或者进行小分子RNA测序(small RNA sequencing),通过分离特定大小的RNA分子进行测序,从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上,与染色质免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术相结合,从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。2023-08-14 18:52:071
简述第一代测序技术,第二代测序技术,第三代测序技术的特点是什么?
第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外,其测序核心原理(除Solid是边连接边测序之外)都是基于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降,通量大大提升,但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率,并且具有系统偏向性,同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的,它的根本特点是单分子测序,不需要任何PCR的过程,这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误,同时提高读长,并要保持二代技术的高通量,低成本的优点。2023-08-14 18:53:152
简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围
这一方法的基本步骤为: (1)先将DNA的末端之一进行标记,通常为放射性同位素32P; (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰; (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链; (4)凝胶电泳将DNA链按长短分开; (5)根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列 化学降解较之链终止法具有明显优点:所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝 现在第二代带三代测序都出来了,还用化学降解法,是不是很老套?2023-08-14 18:53:481
新一代测序原理及意义是什么
新一代(第二代)测序技术的测序原理是“边合成边测序”。先把基因组打断成100kb左右的小片段,每个片段单独测序,测完以后依靠大型计算机进行拼接,所以新一代测序仪测序简单,难在拼接。测序时,以待测DNA片段为模板,进行互补链的合成,每延伸一个碱基就进行一次激光扫描,读出是哪种碱基(四种碱基事先进行不同标记,在激光下呈现不同颜色),很方便地就完成了测序。高通量体现在一次上机能测的样本数,第一代测序仪一次上机仅能测96个样本,第二代测序仪一次上机能测数万个样本。操作简单体现在机器自动化。新一代测序的意义,是实现了高通量、低成本、快速、操作简便,为开展大规模物种测序及人类基因组研究提供了可能。2023-08-14 18:54:001
二代测序和全外显子区别
技术不同,含义不同。1、技术不同:二代测序技术又称下一代测序技术,是对第一代测序技术的划时代变革的核心。即通过引物技术来定位核酸信息,技术平台有AppliedBiosystems/SOLiD?system。以上技术平台所运用的测序原理均为循环微阵列法。全外显子组测序,是指利用序列捕获技术将只占基因组1%的外显子进行高通量测序,从而检测出约85%的致病突变,测序深度更高,数据更有效,变异检测更准确。2、含义不同:二代测序又称为新一代测序或称为高通量测序,可以同时对多个基因的多个突变位点,进行后续突变衡量,以及后续突变状态的检测,指导后续的靶向治疗。全外显子组是指全部外显子区域的集合,在人类基因组中,该区域仅占1%,却包含合成蛋白质所需要的重要信息,涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异。2023-08-14 18:54:071
二代测序和宏基因组的区别
二代测序和宏基因组的区别在于:1、二代测序是宏基因组学研究的主要测序方法。以典型的二代测序平台Illumina为例,其测序原理是基于桥式聚合酶链式反应(PCR)的边合成边测序,特点是读长短、准确性高。和一代测序相比,具有测序速度快、准确性高以及成本低的优良特性。2、宏基因组测序的定义:宏基因组测序(MetagenomicsSequencing)是对环境样品中全部微生物的总DNA(也称宏基因组:Metagenomic)进行高通量测序,主要研究微生物种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协作关系以及微生物与环境之间的关系。宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯培养的限制,扩展了微生物资源的利用空间,为环境微生物群落的研究提供了有效工具。2023-08-14 18:54:171
二代测序文库构建-概述与挑战(1)
高通量测序又称NGS,重新定义了基因组学研究。近年来,NGS技术稳步发展,伴随着成本下降以及测序应用呈指数增加。本文,我们研究了影响测序文库质量的关键因素,以及,在DNA来源和RNA来源文库准备过程中存在的挑战。这些因素包括,DNA/RNA材料的定量和物理性质以及潜在应用(比如,基因组测序、靶向测序、RNA-seq、ChIP-seq、RIP-seq和甲基化),在制备高质量测序文库的内容中将提到。另外,我们也会讨论制备单细胞来源的文库的方法。 在过去的5年里,NGS技术在生命科学领域的研究人员中得到了广泛应用。与此同时,随着测序技术的发展和进步,衍生了一些核酸提取和文库制备的方法。比如,已经可以成功利用来自单细胞的RNA和DNA进行文库的制备. NGS文库制备的基础是将靶向的核酸、RNA或DNA 改造成测序仪可以使用的形式(Fig 1)。在这儿,我们对比了多个文库制备策略以及NGS应用,主要着眼于与illumina测序技术兼容的文库。但是,需要指出一点,本文讨论的几乎所有原则只要稍加修饰便可应用于其他NGS平台,比如,Life Technologies、Roche和Pacific Biosciences。 一般来说,文库制备的核心步骤包括:1)片段化及或选出特定长度的片段,2)将其转化为双链的形式,3)将寡核苷酸接头连接至片段末尾以及4)对文库进行定量;目标DNA片段的大小是NGS文库构建的关键因素。对核酸进行片段化的方法主要包括物理、酶切和化学的方法。物理方法包括声波剪切(代表:Covaris)和超声(代表:BioRuptor),酶切方法包括非特异性内切酶和转座酶片段化;我们实验室中,Covaris, Woburn, MA主要用于获得100-5000bp范围的DNA片段,而Covaris g-TUBEs主要用于mate-pair文库所必需的6-20kb范围的DNA片段。酶切的方法包括DNase I或片段化酶的消化,一个两种酶的混合(New England Biolabs, Ipswich MA)。两种方法都很有效。但是,片段化酶相比物理方法会产生更多的假indel。另一种酶切方法是Illumina的Nextera,利用转座酶进行随机片段化并把接头序列插入双链DNA中。 这种方法有几个优势,包括,减少样品处理和制备的时间。 文库大小是由插入片段(指的是接头序列之间的文库部分)大小决定的,因为接头序列的长度是不变的。反过来说,最佳插入片段长度是有NGS设备以及特定测序应用决定的。比如, illumina中,最佳片段大小是受簇生成过程影响的,这个过程包括,文库编写、稀释以及分布至芯片表面进行扩增。虽然,短片段扩增更加有效,长片段文库能够产生更大、更弥散的簇。我们用illumina测序的文库最大为1500bp。 最佳文库大小也是由测序应用决定的。对于外显子测序来说,80%以上的人类外显子长度小于200bp。我们测试PE100bp,外显子文库大小约为250bp,这样可以匹配大多数外显子的平均大小,结果中没有重叠的读对。 RNA-seq文库大小也是由应用决定的。对于基因表达分析我们采用SE100的测序。但是对于,可变剪切或转录起始终止位点的判定,我们选择PE100的方案。大多数应用中,RNA在片段化之前会逆转录成cDNA的形式。一般是利用二价金属离子(镁或锌)对RNA进行可控的热消化。文库片段大小可以通过调节消化反应的时间来控制,重复性很好。 在最近对7个RNA-seq文库制备方法的研究中,大多是先对RNA进行片段化然后进行加接头。有两种方法,不利用随机引物,或者说在SMARTer Ultra Low RNA试剂盒中, 合成具有固定3",5"序列的全长cDNA序列。 全长的cDNA文库(平均2kb)可以通过长距离PCR(LD-PCR)进行扩增。这种扩增的双链cDNA再通过声波剪切至合适的长度,用在标准的illumina文库准备过程中(包括,末端修复和补平,加A和接头连接,再通过PCR进行扩增。) 另一种文库构建后对文库大小处理步骤是片选以及去除接头二聚体或其他文库制备的副产物。接头二聚体是接头自连的结果。这些二聚体成簇效率非常高,而且会消耗掉珍贵的芯片空间,但不产出任何有效数据。因此,我们通常利用磁珠法或切胶回收。磁珠法适用于起始材料比较充足的情况。若样本投入有限,就会生成更多的接头二聚体。我们的经验是,磁珠为基础的方法在这种情况下不适用,需要结合磁珠和切胶回收的方法。 在microRNA/small RNA文库制备过程中,目的产物通常只比120bp的接头二聚体长20-30bp。因此,必须使用切胶回收的方法获得尽可能多的目的序列。这种分离精度对于磁珠来说就不适用。另外,我们经常需要建大插入片段(1kb)的文库,结合更长的读长PE300以及无PCR步骤,用于细菌基因组的从头组装。为了尽可能获得可用于组装的数据,就必须要小心地进行切胶回收以获得大小较为一致的插入片段。 在利用DNA样本进行文库构建过程中有几个考虑,包括起始材料的量以及该文库是用于重测序(有可用于比对的参考序列)还是从头测序(需要利用此次下机数据组装出新的参考序列)。文库制备容易存在bias,这是由于基因组存在高GC或低GC的区域,目前已经开发了解决这些问题的方法,包括仔细选择用于扩增的聚合酶、循环数、条件以及缓冲液等。 DNA样本的文库制备,不管是用于WGS、WES、ChIP-seq还是PCR扩增子,一般都遵循相同的流程。总的来说,对于任何应用,目标都是使文库尽可能的复杂。 DNA建库试剂盒目前有多个品牌。竞争也促使价格迅速下降以及质量的提升。这些试剂盒能够处理DNA起始量从ug到pg多个级别。但是,我们需要记住一点,起始量大可以降低扩增循环数,因此文库复杂度更高。除Nextera外,文库制备步骤通常包括:1)片段化,2)末端修复,3)5端磷酸化,4)3端加A,5)接头连接,6)几个cycle的PCR以富集加了接头的产物。Ion Torrent流程的主要不同在于平末端连接不同的接头序列。 起始DNA被片段化后,会使用3个酶的混合物( T4 多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶以及 Klenow大片段 )进行末端补平和5端磷酸化。3端加A尾利用Taq聚合酶或Klenow片段(exo-)。Taq在加A尾上更有效率,但Klenow在不能用加热方法时,比如mate-pair文库可以适用。在接头连接过程中,最适的接头:片段比例大约为10:1,以摩尔数为单位。接头太多会形成难以分离的二聚体,这些二聚体在随后的扩增中会占主导地位。末端修复和加A反应后,磁珠或胶回收的方法都适用,但连接反应后我们发现,磁珠的方法能够更有效地去除接头二聚体。 为了便于多样本混合,可以对不同样本使用不同barcode的接头。另外barcode也可以由PCR扩增过程经不同barcode的引物加入。可以从多个供货商购买高质量的带barcode的接头和PCR引物。 目前DNA文库构建的所有组分,从接头到酶,都有详细的文字说明,可以组装成自制的文库制备试剂盒。 另一种方法是Nextera方法,利用转座酶对DNA进行随机打断,并在一个单管中对其加标签(又称tagmentation)。这种工程化的酶有两个功能,对DNA进行片段化,并将特定的接头加到片段化DNA的两端。 这些接头序列在接下来的PCR过程中用于扩增插入片段。PCR反应会加入barcode。这个制备过程相对传统方法的优势在于,将片段化、末端修复和接头连接合并成一步。这种方法相对于机械片段化的方法来说,对DNA的起始量更加敏感。为了实现在合适的距离进行片段化,转座酶相对样本的比例非常关键。因为片段大小依赖于反应效率,所有反应的参数,比如,温度和反应时间,都非常关键,需要严格控制。 一些课题组发表了对单个细胞基因组进行测序的结果。现在的策略采用多重链置换(MDA)对整个基因组进行扩增。MDA主要是利用了随机引物和phi29,一种高度进行性的链置换聚合酶。虽然这个技术能够产生足够的量用于测序文库的构建 ,但它的一个问题在于非线性扩增造成的大量的bias。最近有研究认为通过加入一个半线性的预扩增步骤能够减少bias。Fluidgm基于单细胞分离和微流控技术用于单细胞文库制备,每次运行可获得最多96个单细胞。 对于RNA文库,我们需要根据测序目的来进行文库构建方案的筛选。如果目的是发现复杂全面的转录事件,文库需要覆盖整个转录组,包括,编码、非编码、反义以及基因间RNA,而且需要尽可能的完整。但是,很多场合,目的只是研究能够翻译成蛋白质的编码mRNA的转录本。另一种情况只涉及small RNA,大多miRNA,也包括snoRNA,piRNA,snRNA以及tRNA。虽然,我们想要详述RNA测序文库的原则,但无法一一列举。感兴趣的读者可以自行研究。 NGS应用到RNA-seq最初成功的例子之一是 miRNA 。制备miRNA测序文库非常简单,通常是一步反应。事实上,miRNA在5端有天然磷酸修饰,这允许连接酶选择性地靶向miRNA。 illumina步骤的第一步,3端阻断,5端腺苷化的DNA接头通过截断的T4 RNA连接酶2被连接至RNA样本。这个酶经过修饰,能够对3端接头底物进行腺苷化。结果是,其他RNA片段在这个反应中不会连接在一起。只有腺苷化的寡核苷酸可以连接到游离的RNA的3端末端。由于接头3端是阻断的,无法进行自连。下一步,在ATP和RNA连接酶1的作用下加入5端RNA接头。 只有5端磷酸化的RNA分子能够在连接反应中作为有效的底物。第二步连接反应后,逆转录引物杂交到3端接头,开始启动RT-PCR 扩增(一般是12个循环)。由于小且片段大小可预测(120bp 接头序列加上20-30bp miRNA插入片段),文库或多个barcode混合样本通常一起进行切胶回收。 由于存在接头二聚体以及非miRNA的连接(tRNA和snoRNA),切胶回收非常重要。这种文库制备方法导致文库的测序具有方向性,总是从原始RNA的5端到3端。Ion Torrent 的miRNA测序原则也是相似的。Ion Torrent利用两种不同的接头连接至miRNA 3端和5端,随后进行RT-PCR。一般,文库构建步骤可以将任何RNA材料构建成有方向性的RNA-seq文库。 miRNA文库的一大限制在于RNA的起始量低(<200ng 总RNA);短接头二聚体在RT-PCR反应中与目的产物、接头和miRNA进行竞争。 当存在太多二聚体时,他们会在片段筛选时充斥整个凝胶,污染产物条带。为了尽量避免这种情况,很多试剂盒采取了各种方式来避免二聚体的形成。 对于mRNA测序文库,方法主要包括利用随机引物或oligo-dT引物进行cDNA合成或在mRNA片段上加接头后进行某种形式的扩增。mRNA可以由随机引物或oligo-dT起始产生一链cDNA。如果使用随机引物,必须先将rRNA去除或减少。rRNA可以通过寡核苷酸探针为基础的试剂,比如,Ribo-Zero和RiboMinus,进行去除。另外,polyA RNA可以通过oligo-dT磁珠进行正向筛选。 通常希望文库能够留有原始目的RNA的链的 方向性 。比如,逆转录产生的反义RNA在调节基因表达中发挥作用。实际上,lncRNA分析依赖于定向RNA测序。制备定向RNA-seq文库的方法有几种。逻辑时,进行cDNA反应,将两条链中的1条有选择地移除,通过,在第二条cDNA链合成时加入dUTP。尿嘧啶包含的链可以被响应的酶消化掉或者扩增的时候用不识别尿嘧啶的聚合酶。 另外,加入actinomycin D可以减少一链cDNA合成过程中假义链的合成。 另一种杂交方法利用随机或锚定oligo-dT引物的接头序列起始第一链cDNA的合成。接下来,在模板转换步骤,3端接头序列添加到cDNA分子。这种方法的明显优势在于第一链cDNA分子可以利用3端的唯一序列标签无需进行第二链合成,直接通过PCR进行扩增。5端唯一序列标签在第一链合成过程中引入。 用于cDNA合成的引物设计对于RNA-seq文库非常重要。比如,rRNA序列可以通过设计靶向rRNA的引物(不用于进一步扩增)进行去除。 NuGEN Ovation RNA-seq结合SPIA( Single primer isothermal amplification )核酸扩增技术以及用于第一链cDNA合成的引物来抑制rRNA的扩增。另一种方法中利用4096种六聚体来抑制rRNA序列(识别并消除完美匹配)。749种六聚体保留并用于起始第一链cDNA合成反应。结果是,rRNA reads从78%降至13%。还有一种方法叫, DP-seq ,利用44个7聚体引物扩增了大部分的小鼠转录本。这种引物设计选择性地抑制了高表达转录本的扩增,包括rRNA,并提供了胚胎发育模型中低丰度转录本的估计。 最近发表了一些制备单细胞RNA文库的方法。一种方法利用第一链cDNA的多聚核苷酸尾巴,结合模板转换反应。结果是第一链cDNA产物可以通过通用PCR引物进行扩增。如图,Figure4B所示,且已并入是试剂盒中。另一种方法叫 CEL-Seq ,在cDNA 5端合成T7启动子序列,随后在体外转录过程中进行现象扩增。 单个细胞的总RNA一般为10pg,但polyA RNA只有0.1pg。因此,这些方法某种程度上需要全转录本扩增以产生足够的建库所需起始量。这样大量扩增的弊端就在于大量技术噪音的产生,这一问题目前尚未解决。 (?) 最后,核糖体印记能够反应翻译的任何节点上细胞mRNA转录本的混合。这种方法涉及到利用RNase对细胞进行裂解,只留下被核小体保护的30个核苷酸的区域。核小体经蔗糖梯度密度离心进行纯化,接着mRNA被从核小体中提取出来。另一种新的RNA测序的应用是 SHAPE-Seq,通过酰化试剂来偏向性地修饰未配对的碱基以探索RNA的二级结构。通过对修饰的RNA和未修饰的对照进行逆转录,对得到的cDNA片段进行测序,比较后能够揭示核苷酸水平的碱基配对信息。2023-08-14 18:54:381
BGISEQ-1000和BGISEQ-100在原理和应用上有什么差异
2014年7月2日,据国家食品药品监督管理总局官网消息,第二代基因测序诊断产品批准上市。华大基因成为首家CFDA批准无创产前基因检测上市机构。2014年6月30日,国家食品药品监督管理总局经审查,批准了BGISEQ-1000基因测序仪、BGISEQ-100基因测序仪和胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(联合探针锚定连接测序法)、胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法)医疗器械注册。这是国家食品药品监督管理总局首次批准注册的第二代基因测序诊断产品。 该批产品可通过对孕周12周以上的高危孕妇外周血血浆中的游离基因片段进行基因测序,对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征进行无创产前检查和辅助诊断。2023-08-14 18:54:451
基因测序的步骤是什么?
是测定人类遗传基因排序(以碱基排序为表现) 分四种碱基 A、T、G、C (以A-T 、 G-C组合再连成双螺旋链状) 母的遗传基因在受精过程中被随机得分开,而孩子能获得其中一部分(理论上一般占50%左右)。孩子和父母间的基因有许多相似点。人类基因测序目的之一就是对血缘程度进行检验========基因就是DNA大分子的一个片断。核酸分为DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)两类,它们共同执掌着细胞的新陈代谢,核酸作为生命的根源是遗传因子的本体,能完全控制细胞的分裂、成长与能量的产生。生命从诞生到死亡,均受核酸支配。与基因密切联系的真正在幕后操纵生命的,是一个崭新的概念———核酸。现代遗传学家认为,基因是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称,是具有遗传效应的DNA分子片段。基因位于染色体上,并在染色体上呈线性排列。基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代,还可以使遗传信息得到表达。不同人种之间头发、肤色、眼睛、鼻子等不同,是基因差异所致。2023-08-14 18:54:563
二代测序名词解释
二代测序(NGS),又称为高通量测序,是低成本、高准确度、一次可对多个样本的几十万甚至几百万条DNA分子同时进行快速测序分析的新一代测序技术,虽然已被广泛运用于临床,但尚无科学协会对其在肿瘤学实践中的应用提出建议。早在2018年,欧洲肿瘤内科学会(ESMO)发布了分子靶点临床可行性量表(ESCAT),根据对患者管理的影响将分子靶点分为6个等级,针对导致全球死亡最多的8种癌症中所发生的基因组改变,ESCAT量表评估了其证据等级和临床意义。2023-08-14 18:55:051
DNA测序基本原理及流程是什么?
PCR循环测序法是将PCR扩增和核酸序列分析技术相结合,从而形成的一种测定核苷酸序列的研究方法,也称作线性扩增测序.该方法采用PCR仪加热使DNA模板变性,在TaqDNA聚合酶作用下,以温度循环模式在模板上进行多轮的双脱氧核苷酸测序反应,线性扩增标记的DNA分子.PCR循环测序法与以往的测序方法相比,其优点在于:大大减少所需的模板量;能提高测序反应产生的信号,降低了操作的复杂性,且聚合酶的用量减少;可在小量制备的模板上进行筛选反应;高温下进行的测序反应使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域;双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用,不用作预先碱变性处理.由于PCR循环测序法能够简单、快速地检测特定序列,因此, PCR循环测序法在核酸序列分析研究中受到广泛的重视.2023-08-14 18:55:161
DNA测序有什么方法?要具体详细
第一代DNA测序:双脱氧终止法即sanger测序法。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得可见的DNA碱基序列。第二代DNA测序:边合成边测序在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。第三代DNA测序:单分子测序用一种聚合酶将DNA的复制限制在一个微小的间隙中,给各种碱基加上荧光示踪标记,当碱基合成DNA链时,这些荧光标记就会发出不同颜色的闪光,根据闪光颜色就可识别出不同的碱基。要具体理解测序原理,请自己查询更详细的资料,以上为大体框架,sanger测序法是最老的测序法,沿用了几十年,到目前依然没有过时。二代测序是目前市面上最流行的测序,与一代相比,具有高通量、廉价的特点。三代测序目前仍处于试验阶段,将比二代测序更高通量,更廉价。2023-08-14 18:55:251
DNA测序的测序原理是什么?
这位是搞分子生物学的吗?DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT.所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段: GA, GATCCGA,同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC,在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT, 电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为 8 7 6 5 4 3 2 1A | |C | |G | |T | |我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成(上面这个图在百度知道中显示不正常, 因为百度知道的网页用的是比例字体, 你如果想看它, 拷贝到记事本中, 用等宽的字体来看).不知你有什么不清楚的没有? 我是搞分子生物学的, 欢迎讨论2023-08-14 18:55:353
二代测序原理
第二代测序(Next-generation sequencing,NGS)又称为高通量测序(High-throughput sequencing),是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。我们都知道一代测序为合成终止测序,而二代测序开创性的引入了可逆终止末端,从而实现边合成边测序(Sequencing by Synthesis)。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记(一般为荧光分子标记)来确定DNA的序列,现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。2023-08-14 18:56:031
什么是二代测序技术?
第二代测序(Next-generation sequencing,NGS)又称为高通量测序(High-throughput sequencing),是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。我们都知道一代测序为合成终止测序,而二代测序开创性的引入了可逆终止末端,从而实现边合成边测序(Sequencing by Synthesis)。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记(一般为荧光分子标记)来确定DNA的序列,现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代测序中,单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇,然后进行同步复制,来增强荧光信号强度从而读出DNA序列;而随着读长增长,基因簇复制的协同性降低,导致碱基测序质量下降,这严格限制了二代测序的读长(不超过500bp),因此,二代测序具有通量高、读长短的特点。二代测序适合扩增子测序(例如16S、18S、ITS的可变区),而基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法(Shotgun method)打断成小片段,测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。二代测序技术相对一代测序大大降低了测序成本并大幅提高了测序速度,应用非常广泛,如突变体的定位,寻找SNP位点,全基因组甲基化测序等。二代测序技术在此次新型冠状病毒疫情防控中发挥了很大的作用,直接通过测序掌握了该“不明原因肺炎”的基因组序列,从而进一步研发出相关检测试剂,以助于我们快速地搜索和排除病例,对于我国快速有效地控制疫情有重大的意义。2023-08-14 18:56:242
简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围
这一方法的基本步骤为:(1)先将DNA的末端之一进行标记,通常为放射性同位素32P;(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰;(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链;(4)凝胶电泳将DNA链按长短分开;(5)根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列化学降解较之链终止法具有明显优点:所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝现在第二代带三代测序都出来了,还用化学降解法,是不是很老套?2023-08-14 18:57:411
DNA测序法
目前普遍应用还是Sanger的方法。下代基因测序主要用于对已知序列的再测,或者较短序列的测序。下代测序主要的三个平台是454,Illumina,SOLiD。具体技术去搜百度知道~~~第三代测序虽然现在网上出来了,但是可应用读还需要时间考量。2023-08-14 18:57:522
二代测序和pcr检测哪个简单
二代测序。二代测序是对第一代测序技术的划时代变革的核心。即通过引物来定位核酸信息,技术平台有AppliedBiosystems/SOLiDsystem。以上技术平台所运用的测序原理均为循环微阵列法。2023-08-14 18:58:021
高通量测序的技术应用
测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展,科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(de novo sequencing),获得该物种的参考序列,为后续研究和分子育种奠定基础;对有参考序列的物种,进行全基因组重测序(resequencing),在全基因组水平上扫描并检测突变位点,发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序(whole transcriptome resequencing),从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究;或者进行小分子RNA测序(small RNA sequencing),通过分离特定大小的RNA分子进行测序,从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上,与染色质免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术相结合,从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术(Targeted Resequencing)。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针,这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合,从而富集到特定区段,然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ,应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势,不仅仅是费用较低,更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小,与生物学表型结合更为直接。目前,高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion 综合征中的致病突变,Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。他们使用Agilent SureSelect序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序,平均覆盖度为43倍,读长为50 nt,每个个体产生了2.7-3 GB可作图的序列数据。他们聚焦于全部四位患者都携带变异体的12个基因,最终将候选基因缩小至1个。而贝勒医学院基因组测序中心也计划对15种以Science杂志年度十大科学突破上疾病进行研究,包括脑癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、心脏病、糖尿病、自闭症以及其他遗传疾病,以更好地理解致病突变以及突变对疾病的影响。前不久刚刚结束的评选中,外显子组测序名列其中。以上我们盘点了2010年第二代测序技术的最新进展和相关应用。但是除了第二代测序之外,还有另外一种以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术也正在如火如荼的发展中,只是还没有正式发布。所以目前科学界所说的高通量测序还指的是第二代测序。2023-08-14 18:58:101
基因测序原理是什么?
DNA测序的方法有很多种.目前最常见的是双脱氧终止法了.在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶.测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸(称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后进行聚合反应.在第一个反应物中,ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链,由于其3位的羟基变成了氢,所以不能继续延伸.所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了;同理第二个反应产生的都是以C结尾的;第三个反应的都以G结尾,第四个反应的都以T结尾,电泳后就可以读出序列了.也许这样说你不一定明白.举一个例子,假如有一个DNA,互补序列是GATCCGAT,我们试着做一下:在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三个碱基时没什么问题,但遇到A时,掺入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一个如果参与反应的是ddATP则终止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:GA,否则继续延伸,可以产生序列GATCCG,又到了下一个A了.同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段:GA,GATCCGA,同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段:GATC,GATCC,在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段:G,GATCCG在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段:GAT,GATCCGAT,电泳时按分子量大小排列,A反应的片段长度为2,7;C反应的为4,5;G反应的为1,6;T反应的为3,8,四个反应的产物分别电泳,结果为87654321A||C||G||T||我们可以从右向左读,为GATCCGAT,至此,测序完成(上面这个图在百度知道中显示不正常,因为百度知道的网页用的是比例字体,你如果想看它,拷贝到记事本中,用等宽的字体来看).2023-08-14 18:58:312
第二代DNA测序法的原理能解释一下么?主要想问:1.双脱氧核苷酸终止子是什么,标记荧光的部分是片段尾部?
这个要讲的话比较多,你可以找一本基因工程原理的书看一下2023-08-14 18:58:392
用k-mer分析进行基因组调查:(一)基本原理
(全文5058字) 【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后,用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查,用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。 基因组调查(genome survey)指基因组特征评估,一般指通过k-mer分析二代测序数据,获得基因组大小(genome size),杂合度(heterozygosity),重复序列比例,GC含量等基因组信息的手段。 基因组复杂程序的判断标准包括:基因组大小,倍性,杂合度,重复序列比例,GC含量等。 一般而言,基因组越大,重复序列比例越高; GC含量异常低或异常高,重复序列比例也会很高;多倍体基因组的杂合度高于二倍体。 判断基因组复杂程度可以参考以下经验性标准: k-mer分析可以用在生物信息学许多方面,这篇博客的k-mer分析特指用于基因组调查的k-mer分析方法。 Figure 1. k-mer示例。图片来源: https://cloud.tencent.com/developer/article/1613847 k-mer分析应用的前提假设是测序的reads是随机分布在基因组上的。 首先定义几个变量,方便解释原理: 在不考虑测序错误、序列重复性和杂合序列的条件下,k-mer的深度分布遵循泊松分布。但实际情况是三者都存在,所以需要计算错误率,重复序列占比和杂合度,并根据计算结果修正对基因组大小的估计。 在实际应用过程中,估计了基因组的错误率、杂合度和重复序列比例后,重新修正基因组大小的估计,从而得到基因组调查的结果。 Figure 2. k-mer分析(软件GenomeScope)结果示例 许多分析都会用到k-mer的处理方法,把测序得到的reads通过截取k-mer后用于分析。 比如评估基因组特征,组装基因组,物种样品污染评估等。评估基因组特征(genome survey)包括评估基因组大小(size),杂合度,重复序列比例等。 k-mer分析分为 k-mer频数统计 和 基因组特征评估 两步。此外,Smudgeplot还可以用k-mer分析评估物种的倍性。2023-08-14 18:58:471
为什么要做二代测序
进入21世纪后,生命科学领域的进展可谓是一日千里。2005年,商用的二代测序技术诞生,成为推动科学家寻找癌症相关基因的发动机。仅仅在两三年之后,肿瘤科学家就取得了重大突破。2007年,在11家顶级研究机构的通力合作下,肠癌和乳腺癌的全外显子测序数据发布。2008年,首份肿瘤全基因组测序数据也重磅发布了。随着测序技术的不断进步,测序成本的不断下跌,癌症全基因组测序研究成果得以不断积累。目前,研究人员已经累计发现了1000多个与癌症相关的基因。其中很多靶点已经有对应的靶向治疗药物。据初步统计,目前获得FDA批准上市的靶向抗癌药就有100多个。可以这么说,靶向药物给癌症治疗带来的变革,功劳簿上有测序技术的一席之地。不过,测序技术对癌症患者的意义,可远远不止寻找新靶点这么简单。接下来,我就从三个方面说一说,二代测序技术对癌症诊断和治疗的价值。图片第一重价值,就是帮助患者寻找合适的靶向治疗药物。对靶向治疗稍有了解的朋友应该知道,检测患者体内是否存在特定基因突变的方法有很多。这些检测方式有优势也有劣势。优点是,这些方法只关注已知突变热点,不会过度诊断,而且价格也相对便宜。但是劣势也有很多,比如首先,这些方法只关注已知突变热点,有可能存在漏检。2023-08-14 18:59:111
chipsep测序原理
原理:染色质免疫共沉淀 + 二代测序从细胞裂解液分离基因组DNA,通过超声打断DNA为一定长度的小片段添加与目标蛋白质特异的抗体,该抗体会与目标蛋白形成免疫结合复合体沉淀,收集这些沉淀,去交联,分开蛋白与DNA,纯化DNA即可得到染色质免疫沉淀的DNA样本2023-08-14 18:59:181
DNA测序法
DNA测序(DNAsequencing,或译DNA定序)是指分析特定DNA片段的碱基序列,也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后,反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。目前应用最广泛的是由FrederickSanger发明的Sanger双脱氧链终止法(ChainTerminationMethod)。新的测序方法,例如454生物科学的方法和焦磷酸测序法。Sanger测序法Sanger(桑格)双脱氧链终止法是FrederickSanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应(PCR)。PCR过程中,双脱氧核糖核酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核酸多脱了一个氧原子,一旦它被加入到DNA链上,这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法,是将双脱氧核糖核酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离,跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP(4种双脱氧核糖核酸)荧光标记不同,计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A,T,G,C中的哪一个[2]。454生物科学和焦磷酸测序法454测序法由454生物科学发明,是一个类似焦磷酸测序法的新方法。2003年向GenBank提交了一个腺病毒全序列[3],使得他们的技术成为Sanger测序法后第一个被用来测生物基因组全序列的新方法。454使用类似于焦磷酸测序的方法,有着相当高的读取速度,大约为5小时可以测两千万碱基对[4]。2023-08-14 18:59:301
DNA测序原理及方法
给个比较容易理解的也比较专业的网站开开眼界吧2023-08-14 18:59:413
基因测序有什么用
摘要:基因测序是什么?基因测序只是基因检测的方法之一,又称基因谱测序,是国际上公认的一种基因检测方式。基因测序有什么用?基因测序原理技术是什么?【基因测序是什么】基因测序有什么用基因测序原理技术随着基因测序技术的发展和费用的降低,现在普通人也可以在可承受的经济范围内进行个体测序分析,测序技术成为精准医学发展和个体化治疗中一个非常重要的工具,我们即将迎来一个全民测序的时代。而这样一种强大的工具在科学家们的手中又可以发挥出更大价值,挖掘出更有深度的信息。基因测序技术在精准医学中得到了哪些应用呢?小编从以下几个方面结合已发表文章进行了总结。基因测序助力癌症研究寻找治疗靶点在2016年4月8日那期Science期刊上,美国布罗德研究所AvivRegev的领导的癌症研究团队通过与麻省理工学院副教授、单细胞分析先锋AlexShalek合作,利用单细胞RNA-seq方法每次一个细胞地研究整个肿瘤以便确定哪些类型的细胞存在于肿瘤中。他们不仅分析了恶性肿瘤细胞,而且也分析了肿瘤内所有不同类型的细胞。这是首次开展这样的研究。如今,他们知道每种肿瘤的细胞组成,也知道每种类型的细胞的基因表达模式,这样就能够回个头去重新分析一些大体积肿瘤测序数据(比如,癌症基因组图谱)以便从现存的数据中找出细胞如何相互作用和一定程度上利用细胞重建大块肿瘤样品的整体行为。在一篇发表在国际学术期刊NatureCommunication上的文章中,来自美国的科学家们对109名胰腺导管腺癌(PDA)病人进行了全外显子测序,发现了PDA中的基因突变多样性,并且为发现PDA治疗靶点提供了重要信息。在该项研究中,研究人员为方便检测基因突变,同时移除非肿瘤性组织的污染,他们利用显微切割的方法将癌症患者的肿瘤组织进行了异种移植并建立了细胞系。随后对109例进行过显微切割的PDA病例进行了全外显子测序,经过显微切割操作后,肿瘤细胞得到富集并增强了对基因突变的检测。研究人员通过分析发现导致PDA发生的病因事件与肿瘤突变谱具有明显相关性。基因测序帮助寻找生物标记物助力疾病诊断在欧洲泌尿外科协会的研究者公布的一项最新研究成果中,研究者对64份前列腺组织样本进行研究,对每一种样本中的2亿个序列进行阅读分析,结果研究者发现在肿瘤和控制样本中有超过2000个基因都表现出了明显的差异性,其中有些相比已知的前列腺癌标志物而言表现出了较高的特异性和敏感性;其中一种名为TAPIR的非编码RNAs则可以有效抑制癌细胞的生长,尽管其可以转化为临床有用的治疗靶点还为时尚早。研究者在前列腺癌患者的尿液中发现了这些生物标志物,检测结果显示其可以帮助进行准确的前列腺癌检测,基于相关研究结果,研究人员决定开发一种进行前列腺癌早期诊断的高特异性及敏感性的,且基于尿液的检测手段;这种检测方法基于对多个生物标志物的组合,相比单一标志物而言将表现出较高的特异性。基因测序帮助监测全球性疾病暴发在一篇发表于Nature杂志上的报道中,来自伯明翰大学的研究人员解释了如何利用基因组测序的技术来快速实现对疾病暴发的有效监测;文章中他们开发了一种手提箱式的基因组测序“实验室”,其中包含有一种新型的DNA测序仪,最初该设备用于2015年4月在几内亚对埃博拉病人的样本进行检测。这项研究中,研究人员利用这种便携式的DNA测序仪在整个基因组库中鉴别出了新型的单核苷酸多态性(SNPs),目前当测序工作局限于实验室的时候,这种便携式机器的开发对于有效进行疾病暴发的监测而言非常重要,研究者们还希望可以将这种便携式的机器应用于别的领域的研究中,比如癌症研究等。在另外一项研究中,来自英国牛津大学和巴西EvandroChagas研究所等机构的研究人员对巴西的寨卡病毒暴发进行首个基因组分析,从而提供关于这种病毒如何和何时可能进入美洲方面的新信息。研究人员对7株巴西寨卡病毒毒株的基因组进行测序,包括一株毒株来自一例致命的成年人病例和另一株毒株来自一名头小畸型新生儿。1、第一代测序1.1Sanger测序采用的是直接测序法。1977年,FrederickSanger等发明了双脱氧链末端终止法,这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001年,AllanMaxam和WalterGibert发明了Sanger测序法,并在此后的10年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3"-OH,因此每当DNA链加入分子ddNTP,延伸便终止。每一次DNA测序是由4个独立的反应组成,将模板、引物和4种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP分别与DNA聚合酶混合形成长短不一的片段,大量起始点相同、终止点不同的DNA片段存在于反应体系中,具有单个碱基差别的DNA序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来,得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前,依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如,临床上采用Sanger直接测序FGFR2基因证实单基因Apert综合征和直接测序TCOF1基因可以检出多达90%的与TreacherCollins综合征相关的突变。值得注意的是,Sanger测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物,进行PCR直接扩增测序。单个突变点的扩增包括该位点在内的外显子片段即可,不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。因此,应明确定位要扩增的位点所在的基因外显子和该点的具体位置,设计包括该点在内的上下游150~200bp的外显子片段引物。此外,尽管有NGS的出现,但Sanger测序对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测是非常经济和高效的。到目前为止,Sanger测序仍然是作为基因检测的金标准,也是NGS基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。值得注意的是,Sanger测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的,此类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的NGS。虽然Sanger测序具有高度的分析准确性,但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定。另外,Sanger测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型,因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。1.2连锁分析采用的是间接测序法。在NGS出现之前,国际通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大规模全基因扫描和连锁分析基础上的位置候选基因克隆。人类的染色体成对出现,一条来自父亲,一条来自母亲,每一对染色体在同样的位置上拥有相同的基因,但是其序列并不完全相同,被称为父系和母系等位基因。遗传标记是指在人群中表现出多态现象的DNA序列,可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它存在于每一个人,但大小和序列有差别,具有可遗传性和可识别性。目前采用第二代遗传标记,即重复序列多态性,特别是短串联重复序列,又称微卫星标记。连锁分析是以连锁这种遗传现象为基础,研究致病基因与遗传性标记之间关系的方法。如果控制某一表型性状的基因附近存在遗传标记,那么利用某个遗传标记与某个拟定位的基因之间是否存在连锁关系,以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体某一位置上。1986年Morton等提出优势对数记分法(ogoddsscoremethod,LOD),主要检测两基因以某一重组率连锁时的似然性。LOD值为正,支持连锁;LOD值为负,则否定连锁。通过计算家系中的微卫星标记与致病位点之间的LOD值,可以初步估算二者间的遗传距离及连锁程度,从而确定该基因在染色体上的粗略位置。然后利用该区域的染色体基因图谱,分析定位区域内所有基因的功能与表达,选择合适的候选基因进行突变检测,最终将致病基因定位或克隆。然而,采用连锁分析进行基因检测存在很大的局限性。不但所需遗传样本量较大,一般要求提供三代及以上遗传家系患者血样,而且数据量大、处理复杂、产出速度较慢、定位不够精确(一般只能定位在染色体某一区间),这就使得研究工作繁重和定位基因的时间周期特别长。目前,连锁分析采用的单核苷酸多肽性和短串联重复序列还在使用,但经典的间接测序方法,如单链构象多肽性、变性梯度凝胶电泳和异源双链分析在美国已被淘汰,而在发展中国家作为研究手段还在有限使用。2、新一代测序(NGS)主要包括全基因组重测序(whole-genomesequencing,WGS)、全外显子组测序(whole-exomesequencing,WES)和目标区域测序(Targetedregionssequencing,TRS),它们同属于新一代测序技术。总体而言,NGS技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点,使得遗传学者可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。但这些不同的测序技术在测序范围、数据分析量以及测序费用和时间等方面又有很大差别,如果选择适合的方法,对于临床诊断和科学研究将起到事半功倍的作用。2.1目标区域测序目前常用的是基因芯片技术。其测序原理是基于DNA杂交原理,利用目标基因组区域定制的探针与基因组DNA进行芯片杂交或溶液杂交,将目标基因区域DNA富集,再通过NGS技术进行测序。其测序过程是通过把数以万计的cDNA或寡聚核苷酸置于芯片上制成列阵,将芯片上固定好的已知序列的核苷酸探针与溶液中含有荧光标记的相应核酸序列进行互补配对,根据测序仪所显示强荧光的位置和强度,获取每组点阵列信息,再利用生物信息学算法确定目的靶核苷酸的序列组成。测序所选定的目标区域可以是连续的DNA序列,也可以是分布在同一个染色体不同区域或不同染色体上的片段。目标区域测序技术,对于以往通过连锁分析将基因突变锁定在染色体某一片段区域内,但无法找出突变是一个非常好的进一步检测手段。2010年,Nicholas等使用基因分型芯片联合连锁分析技术,成功发现头小畸形的新基因WDR62,文章发表在《NatGenet》杂志。类似的研究在家族性胰腺癌中确定8个候选变异位点和在家族性渗出性玻璃体视网膜病变发现易感基因TSPAN12。基因芯片测序技术可以将经过连锁分析锁定了目标范围或经过全基因组筛选的特定基因或区域进行更深一层的研究,是解决连锁分析无法发现致病基因的有效手段。基因芯片技术对于已知基因突变的筛查具有明显优势,可以快速、全面地检测出目标基因突变。同时,由于目标区域受到了限制,测序范围大幅度减少,测序时间和费用相应降低。但基因芯片检测所需要的DNA的量要大,由于已提取的DNA存在降解的风险,用于基因芯片研究的血标本最好是冰冻的全血,这样可以使用于检测DNA的量有充分保证。2.2全外显子组测序(WES)外显子组是单个个体的基因组DNA上所有蛋白质编码序列的总合。人类外显子组序列约占人类全部基因组序列的1%,但大约包含85%的致病突变。WES是利用序列捕获技术将全外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因分析方法。采用的技术平台主要是罗氏公司的SeqCapEZ全外显子捕获系统,Illumina公司的Solexa技术和Agilent公司的SureSelect外显子靶向序列富集系统。其捕获的目标区在34~62M之间,不仅包括编码区同时也加入了部分非编码区。NGS的测序过程主要包括DNA测序文库的制备、锚定桥接、PCR扩增、单碱基延伸测序和数据分析。研究者根据测序仪捕获到在测序过程中掺入有不同荧光标记碱基片段,经计算机将荧光信号转化成不同颜色的测序峰图和碱基序列。基因测序结果与NCBI的SNP数据库、千人基因组数据库等国际权威数据库比对,最终确定是否为突变基因。自NGS技术问世以来,利用WES在临床疾病致病基因的鉴定研究中取得前所未有的成果。这些成果不仅集中在单基因遗传疾病,还在多基因影响的复杂疾病中获得大量相关基因的发现。在单基因遗传性疾病中,如视网膜色素变性、终端骨发育不良等发现新基因或已知基因新突变。在一些罕见的疾病中,如Kabuki综合征、家族性混合型低脂血症和脊髓小脑共济失调症等疾病中发现新的致病基因。同时,在小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病等肿瘤研究和诸如肥胖症、脑皮质发育不良等复杂疾病的研究中也取得丰硕成果。WES技术在筛查范围和检出率等方面较其他测序技术具有明显的优势。例如,对于采用Sanger测序和基因芯片测序不能筛查出基因的样本,可以采用WES来进一步基因筛查鉴定。应用WES技术能够获得较传统Sanger等方法对编码区测序更深的覆盖度和更准确的数据。由于信息量的大幅度增加,WES可以获得更多个体的编码区信息,因此成为检测致病基因和易感基因位点的有效手段。与连锁分析定位方法比较,WES对家系的要求并不十分严格,在单基因遗传病同一家系中有2~3个患者和1个正常人即可进行致病基因的鉴定研究,而不需要连续三代的遗传家系。由于不需要严格的三代以上的遗传家系,WES使以前不能进行研究的家系成为可能。不仅对于单基因遗传病是一个很好的研究手段,对于许多常见病,如肿瘤、糖尿病等疾病也可进行大规模比较研究。2.3全基因组重测序(WGS)WGS是对已知基因组序列的物种进行不同个体的全基因组的测序,经过数据分析后对序列进行拼接、组装并获得基因组图谱,或是对不同组织进行测序并分析体细胞突变的一种研究方法。尽管WES可以快速全面地找出个体基因组上的所有突变,从而找到个体间的差异,但对于外显子以外的区域则不能有效地进行基因检测。对于此种情况,目前还要借助WGS进行全基因组检测。但由于人类基因组过于庞大,一次单端全基因组测序很难达到所需要的测序深度。因此,需要重复测序或双端测序,由此带来测序成本的大幅度提高和由于不能达到足够的测序深度所导致的结果准确性的降低。而对于临床疾病诊断和普通科研工作,其高昂的检测费用也是难以承受的。尽管如此,对于部分临床研究和WES不能解决的科研课题还需要借助WGS进行更加全面的基因检测。基因检测方法有哪些》》2023-08-14 18:59:491
DNA测序的测序原理是什么?
DNA测序的测序原理: DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列,也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。 其原理是化学试剂处理末段DNA片段,造成碱基的特异性切割,产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物,经凝胶电泳分离。化学切割反应:包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。 另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。2023-08-14 18:59:581
第二代测序技术最主要的技术特征是
高通量和并行PCR测序。根据查询微考网显示,第二代测序技术最主要的技术特征是高通量和并行PCR测序,二代测序技术的特点是通量较大,各个测序反应平行进行,可以实现规模化测序。2023-08-14 19:00:061
人类基因组的测序是怎么进行的?求测序的方法及步骤
那时还是12年前,用的sanger法,6国合作的。成本极高。现在基本用hiseq,454了。sanger只是辅助和验证。组装软件也非常的多。杂体的组需要建文库辅助WGS建议看这方面文章。2023-08-14 19:00:162
什么是高能量测序?并说明它的应用
高能量测序,它是通过一种能量的高低顺序来进行排序2023-08-14 19:00:393
全基因组测序技术
问题一:全基因组测序的技术路线 提取基因组DNA,然后随机打断,电泳回收所需长度的DNA片段(0.2~5Kb),加上接头, 进行基因簇cluster制备或电子扩增E-PCR,最后利用Paired-End(Solexa)或者Mate-Pair(SOLiD)的方法对插入片段进行测序。然后对测得的序列组装成Contig,通过Paired-End的距离可进一步组装成Scaffold,进而可组装成染色体等。组装效果与测序深度与覆盖度、测序质量等有关。常用的组装有:SOAPdenovo、Trimity、Abyss等。 问题二:全基因组重测序的技术路线 提取基因组DNA,利用Covaris进行随机打断,电泳回收所需长度的DNA片段(0.2~5Kb),加上接头, 进行cluster制备 (Solexa)或E-PCR (SOLiD),最后利用Paired-End(Solexa)或者Mate-Pair(SOLiD)的方法对插入片段进行重测序。图1-1,以SOLiD为例,说明整个实验方案。双末端(Paired-End)测序原理测序深度(Sequencing Depth):测序得到的碱基总量(bp)与基因组大小(Genome)的比值,它是评价测序量的指标之一。测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系,测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。重测序的个体,如果采用的是Paired-End或Mate-Pair方案,当测序深度在10~15X以上时,基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保证。测序深度对基因组覆盖度和测序错误率的影响(HOM:纯合体 HET:杂合体) 问题三:什么是基因组测序技术 自1998年美国塞莱拉遗传公司组建以来,人类基因组研究开始由两部分科学家同时展开,分别是由公共经费支持的人类基因组工程和美国塞莱拉遗传公司。在研究过程中,他们也分别采用了两种不同的测序和分析的方法。塞莱拉公司的核心分析方法被称为霰弹法,人类基因组工程则采用了克隆法。 所谓霰弹法,其实是一种高度计算机化的方法,它先把基因组随机分成已知长度(2000个碱基对、1万个碱基对、5万个碱基对)的片段,然后用数学算法将这些片段组装成毗邻的大段并确定它们在基因组上的正确位置。 塞莱拉公司的科学家先用霰弹法测序DNA,并将整个基因组覆盖8次,然后用两个数学公式将人类基因组序列多次组装起来,确定出基因中的转录单元,预测出60%的已识别基因的分子功能。最后研究人员将人类基因组信息与此前已完成的果蝇和线虫的基因组序列进行比较,从而找出了三者共有的核心功能。 而人类基因组工程采用的克隆法则通过先复制更大段的人类基因序列,然后将它们绘制到基因组的适当区域进行研究。这种方法需要研究人员在早期把较多的时间和精力放到克隆和绘制草图上。 两个研究组将所得数据进行对比,经人类基因组工程的科学家、《科学》和《自然》杂志高级指导编辑评估,表明塞莱拉公司的基因组分析与人类基因组工程的分析结果虽然存在一些差异,但大部分地方都有极高的吻合度。 塞莱拉公司测定的序列覆盖了95%以上的人类基因组,其中约85%的人类基因组存在于按照正确顺序排列、至少包含50万个碱基对的片段中。这一序列为人类至少拥有2.6383万个控制合成蛋白质的基因提供了有力的证据,也为另外1.2731万个假设基因的存在提供了较弱的证据 问题四:全基因组和全外显子组测序的区别 基于第二代高通量测序技术,对于有参考序列的物种,针对不同的真菌菌株,可通过全基因组重测序的方法获得全基因组范围内完整的变异信息,讨论群体的遗传结构、影响群体遗传平衡的因素以及物种形成的机制,定位重要性状位点,为后续分子育种打下坚实基础。同时,通过全基因组大样本重测序对真菌重要菌株进行全基因组的基因型鉴定,并与关注的表型数据进行全基因组关联分析(GWAS),找出与关注表型相关的SNP位点,定位性状相关基因。随着测序成本降低和拥有参考基因组序列的物种增多,基因组重测序也成为育种研究中迅速有效的方法之一,在全基因组水平扫描并检测出与重要性状相关的变异位点,具有重大的科研价值和产业价值。 近日,Nature Genetics发表的一篇文章就充分利用了微生物基因组测序与以全基因组重测序为基础的全基因组关联分析结合的方法,揭示了裂殖酵母遗传与表型多样性之间的联系。研究者选取裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe作为研究对象,在全球20个国家范围内收集了时间跨度为100年的161个野生株系的S.Pombe,进行了全基因组测序,推测裂殖酵母在公元前340年开始广泛大量出现,祖先种到达美洲的时间为公园1623年。后续研究者又选取223个菌种进行全基因组关联分析,发现至少89个性状表现出一个关联。每个性状最显著的检测到的变异可以解释平均22%的表型差异,且indel的影响比SNP更大。 问题五:全基因组测序的研究结果 ①NCI-H209细胞系基因组中,共检测到22,910个碱基替换、65个插入缺失(Indels)、58个结构变异;在基因组的编码区,除了发现RB1 和TP53基因发生点突变和MLL2基因由于发生了G>T的颠换,从而产生了pre-stop codon外,有94个点突变直接改变了氨基酸序列,有36个属同义突变。②特定的碱基及其周围序列易被烟气中的多环芳烃和丙烯醛诱变。在NCI-H209细胞系基因组中,G>T/C>A是最为普遍的颠换现象,发生频率为34%;其次是G>A/C>T(21%)和A>G/T>C(19%);CpG岛外的CpG二核苷酸多发生G>T颠换,而CpG岛内的CpG二核苷酸多发生G>C颠换,说明烟气中的致癌物偏好引起甲基化的CpG二核苷酸发生颠换。③检测到转录偶联修复(Transcription-coupled repair)和表达相关的修复(Expression-linked repair)在起作用。转录偶联修复作用机制:鸟嘌呤和腺嘌呤上大的加合物是吸烟过程中所释放的致癌化学物质引起DNA损伤的主要形式,这些大的加合物阻止了转录链上RNA聚合酶的转录过程,而转录受阻的RNA聚合酶招募核苷酸剪切修复相关因子对受损的核苷酸进行修复以避免突变发生。在TP53基因突变的肺癌细胞中,G>T颠换常出现在非转录链,表明在转录链上相同的损伤已被识别和修复。在本研究中,转录链上G和A碱基替换频率比非转录链上少,由此看来嘌呤是烟气致癌物质主要诱变靶标。另外,在NCI-H209细胞系中,转录链和非转录链上发生不同类型的突变(G>T、A>G、A>T)两条链基因表达水平也有差异,这就意味着转录偶联修复机制识别、修复不同加合物损伤的能力不同。表达相关的修复(Expression-linked repair)作用机制:这是一种新的、更为普遍的修复机制,即,高表达的基因中,转录链及非转录链的突变频率都较低。在NCI-H209细胞系中,转录链和非转录链上发生G>A的突变,两条链上基因表达水平都很高,这就说明表达相关的修复作用比转录偶联修复作用更为重要。④在SCLC细胞系中,CHD7基因发生了重排。在NCI-H209细胞系中,CHD7基因3~8外显子发生连续重复,而另外2个LU-135、NCI-H2171细胞系则携带PVT1-CHD7融合基因,说明在肺癌中CHD7基因发生了周期性重排。以上结果表明,第二代测序技术已成为研究与癌症相关的基因突变过程、细胞损伤修复路径、基因调控网络的强有力工具。 问题六:第二代测序技术能测基因组全长吗 第二代测序技术能测基因组全长 测序文库的构建(Library Construction) 首先准备基因组(虽然测序公司要求样品量要达到200ng,但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中),然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段,并在两头加上特定的接头(Adaptor)。如果是转录组测序,则文库的构建要相对麻烦些,RNA片段化之后需反转成cDNA,然后加上接头,或者先将RNA反转成cDNA,然后再片段化并加上接头。片段的大小(Insert size)对于后面的数据分析有影响,可根据需要来选择。对于基因组测序来说,通常会选择几种不同的insert size,以便在组装(Assembly)的时候获得更多的信息。2023-08-14 19:01:011
全基因组测序的前世今生
基因组代表了遗传研究的起点。自从发现DNA结构以来,科学家们一直致力于以精确的方式确定碱基的排列顺序。从1965年开始第一个酵母的片段测序到现在,测序的读长依然不足以覆盖大多数物种整个基因组的大小,因此基因组组装技术也一直是不断研发改进的关键技术。本文系统的回顾了整个基因组测序相关的重要技术、主要里程碑以及当前三代测序技术的优势和挑战。 下图展示了基因组组装的各个重要的里程碑。不同的颜色背景分别展示了从最早基于核苷酸的早期测序到基于Sanger的鸟枪法测序,到大规模的二代NGS测序,再到现在的三代TGS测序的主要组装成就。历时13年(1990-2003)耗资30亿美元的人类基因组计划(HGP)毫无疑问加速了基因组组装的进程,NGS衍生了一系列新颖的应用,包括全外显子组测序、RNA-seq、ChIp-seq、WGBS-seq等等,极大的促进了基因组测序的应用。2010年之后,全新的技术开启了第三代测序TGS—长读长测序的时代,长读长测序极大的增加了基因组组装的优势,基因组组装的连续性大大提高。 TGS的定义可能会有所不同,通常是指无需扩增直接对单个DNA分子进行测序的技术。这些技术产生比NGS更长的reads,每个reads可以跨越几到几百kbps的长度。10X Genomics linked reads 以及Hi-C等NGS的技术可以使得基因组组装连续度有一定的提升,但是TGS的出现,使得组装连续度的提升变得更加容易。 目前应用比较多的三代测序技术,一种是Pacific Biosciences(PaciBio)公司完善和商业化的单分子实时测序技术(SMRT),另一种是Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司商业化的纳米孔测序技术(Nanopore)。SMRT测序技术应用了边合成边测序的原理,以SMRT芯片为测序载体,载体上分布上百万个纳米级的零模波导孔(ZMW),每个ZMW中聚合酶捕获文库DNA序列,通过荧光激发dNTP,从而根据捕获荧光信号的长短,进行边合成边测序。目前SMRT测序有两种模式,一种是Continuous Long Read(CLR)模式,一种是Circular Consensus Sequences(CCS)模式。CLR的读长更长,但是碱基测序的错误率较高(准确率90%远低于NGS的99.9%),但是测序错误是完全随机的,CCS模式即利用这种特性,通过自我校正的方法将测序的错误率降低到了NGS的水平,与此同时相比CLR牺牲了测序读长。 纳米孔测序使用插入人工脂质双层的转基因细菌纳米孔,放置在几十微米宽的单个微孔中并排列在传感器芯片上, 当每条单链 DNA 穿过一个通道时,它会扰乱流过孔的电流,并由半导体传感器测量变化。不同的碱基以略微不同的方式破坏电场,记录的电流变化可以转化为 DNA 序列。ONT可以读取的长度更长,取决于制备的DNA文库的大小,但是其碱基的准确率难以校正,测序的错误率也较高。 三代测序技术,由于其超长的读长,可以有效的跨越基因组中复杂的区域,从而显著提高基因组组装的质量。此外,在二倍体(多倍体)基因组中,TGS可以更容易的生成单倍型的长定相块,区分来源于父母本的遗传信息,避免嵌合的基因组,有助于准确的进行包括高度重复区域的长变异、大型的插入缺失、重复、倒位和易位等结构变异(SV)检测。同时三代测序还可以通过PacBio的酶动力学反应或Nanopore中的离子电流信号来实现表观遗传的测序。 FALCON是PacBio直接开发并于2013年发布的基于三代数据的De novo组装软件,它继承于分级基因组装配(HGAP)流程,首先进行序列自身的比对,以校正三代测序的reads准确度,然后使用de Brujin图(DBG)构建重叠群,如下图所示。FALCON可以识别二倍体序列,可以输出包含位点变异信息的等位基因序列(alternative contigs / a-contigs)和主要的基因组序列(primary contig / p-contig)。FALCON-Unzip是FALCON的升级版,可以利用初始组装中鉴定的杂合SNP来获得高度定相的单倍型,再利用Hi-C数据映射到组装中,利用haplotigs和共有序列,将两个单倍体完全组装出来。 Canu是起源于Celera Assember的三代组装软件,可以用于PacBio和Nanopore两家公司得到的测序结果,其采用Overlap-Layout-Consensus(OLC)的方式进行组装,即利用长序列与序列之间的交叠进行组装,主要分为纠错、修剪和组装三大步。对于FALCON来说,虽然经过组装之前的纠错,相比短读长有比较大的改进,但其组装出来的单倍型仍然是嵌合的,重复序列经常被折叠到一个序列中,为了解决这个问题,2018年发布的新版本的软件TrioCanu可以利用亲本信息来完全定相单倍型,其利用父母本的二代illumina数据在组装之前根据不同的SNP对组装样本的序列进行分类,然后进行独立组装出两套来源于亲本的单倍型,因此TrioCanu尤其适合于高杂合的基因组组装。 Canu的计算是比较慢的,HiFiasm是近两年开发的一个用于PacBio HiFi reads的快速单倍型解析从头组装软件,它可以在单个机器上多线程运行,在较少的资源消耗下快速完成基因组的组装,同时也可以在给定亲本数据的情况下,实现子代来自不同亲本的单倍体组装。但是其单倍型分型的准确性略差于TrioCanu。 组装结果的准确性,计算工作的优化都是组装需要考虑的方面,目前已开发出多种从头组装的软件,除以上介绍的软件外,还有Wtdbg2、Flye、Peregrine、Shasta等等,这几个软件的速度都比较快,但是其组装质量可能没那么准确。所有的基因组组装方法和软件都有优点和缺点,实际应用中可以考虑实际组装物种的情况,以及测序策略、组装目标,综合考量选取准确优秀的组装软件。 对于大基因组来说,即便长读长的reads也不能跨越整条染色体序列,需要其它连锁信息来定位和排序组装的重叠群,以将基因组组装提升到支架(Scanfold)水平。Bionano光学图谱是一种单分子DNA技术,该方法基于DNA标记,生成遗传光学图谱,然后结合初始组装的重叠群,可以进一步对重叠群进行定相和排序,产生更长的支架。除此之外,Bionano光学图谱还可以用于SV和甲基化的分析。 另外一种定向和排序重叠群的技术是基于染色体构象捕获(3C)的技术(Hi-C)。Hi-C技术首先使用甲醛将染色体空间构象固定之后,再利用限制性内切酶处理DNA,并重新连接空间上临近的DNA分子,该技术利用基因组的空间信息,组合重叠群以及支架将其分配到染色体水平。Hi-C目前是在大基因组中实现染色体水平支架的唯一方法,但往往不如Bionano支架那么保守,染色质不可预测的折叠导致染色体远处区域的相互作用,可能导致组装错误,例如人工倒位、同一染色体内的支架错位或不同染色体的支架错配。综合利用不同的技术可以更好地纠正这些错误,甚至可以获得整个染色体的端粒到端粒组装 。 基因组组装的方式一直在不断创新、优化。通过不断改进现有技术并引入全新的 DNA 测序方法和生物信息学工具,组装的质量一直在提升。NGS 引入的高通量能力和 TGS 提供的更高质量序列,最终使复杂的基因组也可用于全基因组研究。人类遗传学研究,包括人口基因组学、遗传疾病定位和诊断、个性化医疗计划、癌症研究和产前检测,已经受益于过去十年基因组测序和组装的进步。同样,这些方法越来越多地用于非模式生物以了解生态和进化过程。对参考基因组测序和组装的承诺现已从单一物种项目扩大到多物种协调工作,旨在使用 NGS 和 TGS 方法组合为大多数生物体产生高质量基因组的项目目前正在进行中。 Giani AM, Gallo GR, Gianfranceschi L, Formenti G. Long walk to genomics: History and current approaches to genome sequencing and assembly. Comput Struct Biotechnol J. 2019 Nov 17;18:9-19. doi: 10.1016/j.csbj.2019.11.002. PMID: 31890139; PMCID: PMC6926122.2023-08-14 19:01:161
宏基因组测序原理?
问题一:如何用宏基因组测序? 10分 宏基因组即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段, 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的。宏基因组学技术第一次使人类得以研究占环境中99%的不可培养的微生物种群,从而成为微生物研究的最前沿领域 对环境样本进行DNA提取后进行16S或18S等区域扩增,再对扩增产物进行建库、测序,然后对所得的数据进行生物信息学分析。生物信息分析主要包括OTU的生成及rank-abundance分析、取样充足性分析、丰度和多样性分析、菌群间差异分析、假设验证分析、进化树分析等。 问题二:宏基因组测序都能得到那些结果?可以用于什么研究? 宏基因组测序,是对特定环境(或者特定生境)样品中的微生物群体基因组进行序列的测定,以分析微生物群体基因组成及功能,解读微生物群体的多样性与丰度,探求微生物与环境,微生物与宿主之间的关系,发掘和研究新的、具有特定功能的基因。宏基因组测序研究避开了微生物分离培养的过程,扩展了微生物资源的利用空间,为研究微生物相互作用提供了有效工具。阅微基因采用第二代高通量测序技术进行宏基因组学研究,无需构建克隆文库,可以直接对环境样品中的基因组片段进行测序,这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差,简化了宏基因组研究的基本操作,提高了测序效率,从而极大地促进了宏基因组学的发展。通过大量测序,可以获得样品的群落结构信息,如微生物物种在该环境下的分布情况及成员间协作关系等,通过还可以确定一些特殊的主要基于或者DNA片段。对于多个样品,还可做相应的比较分析,发掘样品间的相同点与不同点。 宏基因组测序,可以用于疾病研究,微生物种群分析,环境多样性分析,遗传多样性分析,只要有微生物的地方,就可以用到宏基因组测序 问题三:宏基因组分析和16srna的区别 功能基因芯和宏基因组测序的区别 基因组,Genome,一般的定义是单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组,或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。因此,基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。说的更确切些,核基因组是单倍体细胞核内的全部 DNA分子;线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子;叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子 转录组(transcriptome)广义上指某一生理条件下,细胞内所有转录产物的 *** ,包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA;狭义上指所有mRNA的 *** 。 从定义上看,很明显,基因组一般指的是DNA(某些只含有RNA的生物除外),而转录组则指的是RNA。 问题四:宏基因组测序和焦磷酸测序什么区别 焦磷酸测序是454高通量测序平台的测序原理,宏基因组测序是高通量测序的服务项目中的一种,就是对环境样本中提取的总DNA直接进行测序,可以采用454或者Hiseq 2000 测序平台进行测序。454读长长,拼接效果比较好,但是费用比较高;Hiseq2000 读长较短,但是通量非常高,费用比较低。你可以根据自己的科研目的和经费进行选择。 问题五:16S测序和宏基因组测序有什么区别 一、16S测序原理 16S rDNA基因存在于所有细菌的基因组中,具有高度保守性。然而该基因序列还包括9个高变区(V1-V9),通过特异性引物对某一段高变区(如V3区)或某几段高变区(如V3-V4区)进行扩增测序,然后与数据库比对,可特异性识别细菌种类。 二、宏基因组测序原理 将基因组DNA随机打断成若干条500bp的小片段(类似于拼图中的单个形状不一的模块),然后连接接头(双端120bp),在片段两端加通用引物进行PCR扩增测序。将reads进行组装拼接(类似于将众多模块拼成一副完整图片),得到基因序列,众多基因构成完整的基因集。同时将获得的reads片段或组装好的基因序列与NCBI数据库进行比对,得到物种注释结果。 对于16S测序而言,任何一个高变区或几个高变区,尽管变异性再高,对于某些物种来说,这些高变区也可能十分相近,而能够区分它们的特异性序列片段有可能不在我们的扩增区域内。换言之,非全长的可变区序列覆盖范围不够导致无法鉴定到种。 宏基因组在建库之前会先将基因组DNA随机打断成若干小片段,而这些小片段中总有一些能够包含区分2个物种的基因差异序列。由于测序深度足够深,相当于覆盖了整个基因组的信息,因此在与NCBI数据库比对时,就能够注释到相应的种水平的物种。 问题六:请问有谁做过微生物宏基因组测序,公司反馈回来的数据都包含哪些,通常一个样得多少钱? 数据内容: 1,原始的fastq文件。 2,数据分析报告:1,数据的质控 2,序列的拼接及拼接效果评估 3,对拼接contig序列的注释 4,基因的丰度分析,门纲科目属种的丰度分析 5,样本之间差异gene的分析 6,差异基因的功能分析(GO,pathway等) 7,样本间差异显著的物种分析 8,如果样本比较多可以组微生物类群结构分析。 价格方面可以私信我留个邮箱,我可以发你一些资料和价格。 问题七:为什么微生物宏基因组 是否需要定量分析 小木虫 为什么微生物宏基因组 是否需要定量分析 小木虫 宏基因组是指特定环境中全部生物(微生物)遗传物质的总和。宏基因组测序是利用高通量测序技术对环境样品中全部微生物的基因组进行测定,以获得单个样品的饱和数据量,可进行微生物群体的基因组成及功能注释,微生物群体的物种分类,多样性分析,群落结构分析,样品间的物种或基因差异以及物种间的代谢网络研究,探索微生物与环境及宿主之间的关系,发掘和研究新的具有特定功能的基因等。与传统方法相比,基于高通量测序的宏基因组研究无需构建克隆文库,这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差,简化了实验操作,提高了测序效率。此外,宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯培养的限制,扩展了微生物资源的利用空间,为环境微生物群落的研究提供了有效工具。通过宏基因组深度测序可以揭示或估计环境中真实的物种多样性和遗传多样性,挖掘具有应用价值的基因资源,应用于开发新的微生物活性物质,为研究和开发新的微生物活性物质提供有力支持。2023-08-14 19:01:251
基因检测有哪些方法
基因检测的方法不胜枚举,基本的步骤是样本的获取(包括血液、唾液、组织样本等)——处理(如DNA的提取与纯化、文库构建等)——序列测定——序列分析——结果解读——报告撰写。广泛应用的核酸序列测定方法是直接测序法,目前最先进而且被广泛使用的方法和仪器有第一代的Sanger测序法,第二代的高通量测序法(如美国Illumina公司的Hiseq测序仪和华大基因子公司CompleteGenomics开发的测序方法)等。目前也已出现被称为第三代测序技术的方法,如单分子实时DNA测序法。第一代:sanger测序第一代的Sanger测序技术的优点是,测序读长长,能达到800-1K bp,且测序用时短,只需要几十分钟即可完成一次测序,测序准确度高,目前仍是测序的金标准;缺点是通量低、成本高。第二代:高通量测序(NGS)第二代测序技术的优点是测序通量和效率高,成本低廉;缺点是测序读长普遍较短,且用时较长。以目前应用最为广泛的测序仪之一的illumina公司Hiseq2000测序仪为例,其一次测序的数据产出量可达500Gb,但读长为100 bp,且需要耗时14天左右。而Life technology公司的IonProton测序仪是边合成边通过反应体系电位的微小差别来测定碱基序列。第三代:单分子/纳米孔测序由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷,人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷,所以第三代测序技术在长读长和短耗时出发,目前尚未完全成熟,市场应用面还不算广,而且各种测序仪之间差异较大,测序原理也是各出奇招。如Pacific Bioscience公司则是通过在PCR合成DNA的过程中,用显微镜检测由荧光基团标记的dNTP反应后释放出的荧光来测序。而一直未投产的牛津大学研发的测序仪,则是通过检测由核酸外切酶剪切DNA时,“掉落”到检测微孔的核苷酸来测序。2023-08-14 19:01:351
第二代高通量测序都有哪些平台
华大基因公司测序平台2023-08-14 19:01:453
基因检测有哪些方法
口腔黏膜采样检测方法很多公司采用口腔粘膜脱落细胞样本采集方式唾液采样检测方法唾液采样目前出现全新的基因样本采集方法——唾液采样检测法,此方法更加方便快捷,并且实现无创采集,检测效果和提取口腔黏膜检测效果一样。2023-08-14 19:01:562
Sanger 双脱氧法测序原理,简述测序技术发展趋势
DNA链中的核苷酸是以3`,5`-磷酸二酯键相连接,合成DNA所用的底物是2`-脱氧核苷三磷酸(dNTP),在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了2`,3`-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3`- OH,不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯键,DNA合成便在此处终止,如果此处掺入的是一个ddATP,则新生链的末端就是A,依次类推可以通过掺入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ,则新生链的末端为T、C或G,根据这个原理,Sanger与1977年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得了诺贝尔奖。以单链或双链DNA为模板,采用DNA引物引导新生DNA的合成,因此又称为引物合成法,或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性:①以DNA为模板,根据碱基配对的原则逐个将dNTP加到与模板结合的寡核苷酸引物的3′-OH末端,形成正确的模板DNA互补链;②能以dNTP作为底物,也能利用ddNTP作底物,将其掺入寡核苷酸链的3 ′末端而终止新生互补链的延伸。如果在DNA的合成反应中,除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸(dNTP)外,再加入一种少量的2ˊ,3ˊ ddNTP,那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争,所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。 在4组独立的DNA合成反应中,分别加入4种不同的ddNTP,结果将生成4组核苷酸链,它们将分别(随机)终止于每一个A,每一个G,每一个C,每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,就可读出序列。测序现在是第二代技术为主,454,solexa,solid等等,以后将基于纳米技术,进行单分子测序比如隧道探针法等2023-08-14 19:02:171
基因测序仪的原理
基因测序仪是一种在医学领域使用的仪器。原理:abi prism 310型基因分析仪采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物法),因此通过单引物pcr测序反应,DNA测序仪生成的pcr产物则是相差1个碱基的3""""末端为4种不同荧光染料的单链dna混合物,使得四种荧光染料的测序 pcr产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的ccd(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在ccd摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为dna序列,从而达到dna测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。2023-08-14 19:02:461
什么是脱氧核糖核酸测序
这个就是DNA测序咯。目前有一代测序和二代测序,还有三代测序(高通量测序)。如果只是测一段的话,用一代和二代测序就足够了。如果要测基因组或者转录组,就需要三代测序了。2023-08-14 19:02:574
关于基因测序的几个问题!
DNA测序原理和方法 DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。【原理】 ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3"末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器,使DNA测序缩短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析为10~40min。由于该仪器具有DNA测序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】1.BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix,内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反应缓冲液等。2.pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2g/L,试剂盒配套试剂。3.M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2μmol/L,即3.2pmol/μl,试剂盒配套试剂。4.DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2g/L,即200ng/μl。5.引物 需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2μmol/L,即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。6.灭菌去离子水或三蒸水。7.0.2ml或和0.5ml的PCR管 盖体分离,PE公司产品。8.3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100ml,高压灭菌后分装。9.70%乙醇和无水乙醇。10.NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀,室温可保存1年。11.POP 6测序胶 ABI产品。12.模板抑制试剂(TSR) ABI产品2023-08-14 19:03:141
基因检测方法有哪些
摘要:基因检测方法有哪些?本文介绍了几种DNA水平基因检测常见的方法,比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用,对指导研究生和临床医生课外学习,推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。【基因检测方法比较】基因检测方法有哪些基因检测技术原理1、第一代测序1.1Sanger测序采用的是直接测序法1977年,FrederickSanger等发明了双脱氧链末端终止法,这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001年,AllanMaxam和WalterGibert发明了Sanger测序法,并在此后的10年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3"-OH,因此每当DNA链加入分子ddNTP,延伸便终止。每一次DNA测序是由4个独立的反应组成,将模板、引物和4种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP分别与DNA聚合酶混合形成长短不一的片段,大量起始点相同、终止点不同的DNA片段存在于反应体系中,具有单个碱基差别的DNA序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来,得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前,依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如,临床上采用Sanger直接测序FGFR2基因证实单基因Apert综合征和直接测序TCOF1基因可以检出多达90%的与TreacherCollins综合征相关的突变。值得注意的是,Sanger测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物,进行PCR直接扩增测序。单个突变点的扩增包括该位点在内的外显子片段即可,不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。因此,应明确定位要扩增的位点所在的基因外显子和该点的具体位置,设计包括该点在内的上下游150~200bp的外显子片段引物。此外,尽管有NGS的出现,但Sanger测序对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测是非常经济和高效的。到目前为止,Sanger测序仍然是作为基因检测的金标准,也是NGS基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。值得注意的是,Sanger测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的,此类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的NGS。虽然Sanger测序具有高度的分析准确性,但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定。另外,Sanger测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型,因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。1.2连锁分析采用的是间接测序法在NGS出现之前,国际通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大规模全基因扫描和连锁分析基础上的位置候选基因克隆。人类的染色体成对出现,一条来自父亲,一条来自母亲,每一对染色体在同样的位置上拥有相同的基因,但是其序列并不完全相同,被称为父系和母系等位基因。遗传标记是指在人群中表现出多态现象的DNA序列,可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它存在于每一个人,但大小和序列有差别,具有可遗传性和可识别性。目前采用第二代遗传标记,即重复序列多态性,特别是短串联重复序列,又称微卫星标记。连锁分析是以连锁这种遗传现象为基础,研究致病基因与遗传性标记之间关系的方法。如果控制某一表型性状的基因附近存在遗传标记,那么利用某个遗传标记与某个拟定位的基因之间是否存在连锁关系,以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体某一位置上。1986年Morton等提出优势对数记分法(logoddsscoremethod,LOD),主要检测两基因以某一重组率连锁时的似然性。LOD值为正,支持连锁;LOD值为负,则否定连锁。通过计算家系中的微卫星标记与致病位点之间的LOD值,可以初步估算二者间的遗传距离及连锁程度,从而确定该基因在染色体上的粗略位置。然后利用该区域的染色体基因图谱,分析定位区域内所有基因的功能与表达,选择合适的候选基因进行突变检测,最终将致病基因定位或克隆。然而,采用连锁分析进行基因检测存在很大的局限性。不但所需遗传样本量较大,一般要求提供三代及以上遗传家系患者血样,而且数据量大、处理复杂、产出速度较慢、定位不够精确(一般只能定位在染色体某一区间),这就使得研究工作繁重和定位基因的时间周期特别长。目前,连锁分析采用的单核苷酸多肽性和短串联重复序列还在使用,但经典的间接测序方法,如单链构象多肽性、变性梯度凝胶电泳和异源双链分析在美国已被淘汰,而在发展中国家作为研究手段还在有限使用。2、新一代测序(NGS)主要包括全基因组重测序(whole-genomesequencing,WGS)、全外显子组测序(whole-exomesequencing,WES)和目标区域测序(Targetedregionssequencing,TRS),它们同属于新一代测序技术。总体而言,NGS技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点,使得遗传学者可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。但这些不同的测序技术在测序范围、数据分析量以及测序费用和时间等方面又有很大差别,如果选择适合的方法,对于临床诊断和科学研究将起到事半功倍的作用。2.1目标区域测序目前常用的是基因芯片技术其测序原理是基于DNA杂交原理,利用目标基因组区域定制的探针与基因组DNA进行芯片杂交或溶液杂交,将目标基因区域DNA富集,再通过NGS技术进行测序。其测序过程是通过把数以万计的cDNA或寡聚核苷酸置于芯片上制成列阵,将芯片上固定好的已知序列的核苷酸探针与溶液中含有荧光标记的相应核酸序列进行互补配对,根据测序仪所显示强荧光的位置和强度,获取每组点阵列信息,再利用生物信息学算法确定目的靶核苷酸的序列组成。测序所选定的目标区域可以是连续的DNA序列,也可以是分布在同一个染色体不同区域或不同染色体上的片段。目标区域测序技术,对于以往通过连锁分析将基因突变锁定在染色体某一片段区域内,但无法找出突变是一个非常好的进一步检测手段。2010年,Nicholas等使用基因分型芯片联合连锁分析技术,成功发现头小畸形的新基因WDR62,文章发表在《NatGenet》杂志。类似的研究在家族性胰腺癌中确定8个候选变异位点和在家族性渗出性玻璃体视网膜病变发现易感基因TSPAN12。基因芯片测序技术可以将经过连锁分析锁定了目标范围或经过全基因组筛选的特定基因或区域进行更深一层的研究,是解决连锁分析无法发现致病基因的有效手段。基因芯片技术对于已知基因突变的筛查具有明显优势,可以快速、全面地检测出目标基因突变。同时,由于目标区域受到了限制,测序范围大幅度减少,测序时间和费用相应降低。但基因芯片检测所需要的DNA的量要大,由于已提取的DNA存在降解的风险,用于基因芯片研究的血标本最好是冰冻的全血,这样可以使用于检测DNA的量有充分保证。2.2全外显子组测序(WES)外显子组是单个个体的基因组DNA上所有蛋白质编码序列的总合。人类外显子组序列约占人类全部基因组序列的1%,但大约包含85%的致病突变。WES是利用序列捕获技术将全外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因分析方法。采用的技术平台主要是罗氏公司的SeqCapEZ全外显子捕获系统,Illumina公司的Solexa技术和Agilent公司的SureSelect外显子靶向序列富集系统。其捕获的目标区在34~62M之间,不仅包括编码区同时也加入了部分非编码区。NGS的测序过程主要包括DNA测序文库的制备、锚定桥接、PCR扩增、单碱基延伸测序和数据分析。研究者根据测序仪捕获到在测序过程中掺入有不同荧光标记碱基片段,经计算机将荧光信号转化成不同颜色的测序峰图和碱基序列。基因测序结果与NCBI的SNP数据库、千人基因组数据库等国际权威数据库比对,最终确定是否为突变基因。自NGS技术问世以来,利用WES在临床疾病致病基因的鉴定研究中取得前所未有的成果。这些成果不仅集中在单基因遗传疾病,还在多基因影响的复杂疾病中获得大量相关基因的发现。在单基因遗传性疾病中,如视网膜色素变性、终端骨发育不良等发现新基因或已知基因新突变。在一些罕见的疾病中,如Kabuki综合征、家族性混合型低脂血症和脊髓小脑共济失调症等疾病中发现新的致病基因。同时,在小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病等肿瘤研究和诸如肥胖症、脑皮质发育不良等复杂疾病的研究中也取得丰硕成果。WES技术在筛查范围和检出率等方面较其他测序技术具有明显的优势。例如,对于采用Sanger测序和基因芯片测序不能筛查出基因的样本,可以采用WES来进一步基因筛查鉴定。应用WES技术能够获得较传统Sanger等方法对编码区测序更深的覆盖度和更准确的数据。由于信息量的大幅度增加,WES可以获得更多个体的编码区信息,因此成为检测致病基因和易感基因位点的有效手段。与连锁分析定位方法比较,WES对家系的要求并不十分严格,在单基因遗传病同一家系中有2~3个患者和1个正常人即可进行致病基因的鉴定研究,而不需要连续三代的遗传家系。由于不需要严格的三代以上的遗传家系,WES使以前不能进行研究的家系成为可能。不仅对于单基因遗传病是一个很好的研究手段,对于许多常见病,如肿瘤、糖尿病等疾病也可进行大规模比较研究。2.3全基因组重测序(WGS)WGS是对已知基因组序列的物种进行不同个体的全基因组的测序,经过数据分析后对序列进行拼接、组装并获得基因组图谱,或是对不同组织进行测序并分析体细胞突变的一种研究方法。尽管WES可以快速全面地找出个体基因组上的所有突变,从而找到个体间的差异,但对于外显子以外的区域则不能有效地进行基因检测。对于此种情况,目前还要借助WGS进行全基因组检测。但由于人类基因组过于庞大,一次单端全基因组测序很难达到所需要的测序深度。因此,需要重复测序或双端测序,由此带来测序成本的大幅度提高和由于不能达到足够的测序深度所导致的结果准确性的降低。而对于临床疾病诊断和普通科研工作,其高昂的检测费用也是难以承受的。尽管如此,对于部分临床研究和WES不能解决的科研课题还需要借助WGS进行更加全面的基因检测。3、展望NGS的出现为新兴的基因组技术增添了无限的活力和想象空间。特别是基因芯片的问世和已在临床上应用于大样本的疾病筛查和基因诊断中所展现出的活力,以及其商业化发展的模式都令人鼓舞。在眼科是单基因病最常见的学科,利用芯片技术进行Laber病的筛查已使很多病因不清楚的视神经萎缩得到明确诊断。而原发性开角型青光眼是眼科最具隐蔽性和危险性的致盲性眼病,其致病基因或突变的鉴定研究对疾病筛查将有着非常重要的临床价值和巨大的商业价值。在新生儿糖尿病的筛查中采用基因芯片技术可以更加快速、全面经济,避免第一代测序过于繁琐和漏检。基因芯片技术在产前诊断中更加具有发展前景。只要对孕妇进行DNA血液检查即可进行遗传疾病的筛查,避免以往通过羊膜穿刺抽取羊水进行有创检查的局限性和危险性。目前,基因检测技术水平的提升和检测费用的不断降低,发展大规模个体化基因检测在不久的将来成为可能。同时,药物易感性基因和疾病发生的易感基因的检测的深入开展,个体化医疗将在基因检测的基础上得以实现。有理由相信,随着人们生活水平的不断提高和健康意识不断增强,基因检测在未来医学发展中应用前景将十分可观。2023-08-14 19:04:101
二代基因测序的一链和二链什么意思
测序中测序DNA的数量。1、一链DNA是由两条互补的链组成的,每条链上的碱基都能与另一条链上的碱基配对,在一链测序中,只测序DNA的一条链,即只测量一条链上的碱基序列。2、二链与一链测序相反,在二链测序中,同时测序DNA的两条互补链,即同时测量双链上的碱基序列。2023-08-14 19:04:181
基因芯片与基因测序的差异?
1.检测原理 基因芯片的测序原理是杂交测序方法,即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。由于探针序列是根据目标序列进行设计,是确定的,因此,芯片是个相对封闭的系统。换句话说,芯片只能对已知的序列进行检测。 第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外,其测序核心原理(除Solid是边连接边测序之外)都是基于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降,通量大大提升,但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率,并且具有系统偏向性,同时读长也比较短。 第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的,与前两代相比,它的根本特点是单分子测序,不需要任何PCR的过程,这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误,同时提高读长,并要保持二代技术的高通量,低成本的优点。 在测序未普及前,芯片是最常使用的大规模筛查工具,如人基因表达谱芯片,一次实验就可以对人类已知的2~3万个基因进行筛查,找出关键差异基因。我们知道,芯片是基于探针与目标序列杂交结合的原理进行检测。由于探针序列是根据目标序列进行设计,是确定的,因此,芯片是个相对封闭的系统。换句话说,芯片只能对已知的序列进行检测。 2.检测场景 基因测序有相同也有不同的检测场景。比如研究参考序列较丰富物种的表达谱,虽然用芯片和测序都可以,但是用芯片进行定量会更为准确。又比如参考序列较少的物种,要做定量分析,选择测序就更为合适,既能测定序列又能做定量分析。如果想发现新的转录本,或者研究基因表达的可变剪接等,选择测序准没错。也有一些研究,会将两者结合,先用测序获得序列信息,再用芯片进行定量分析,发挥两种手段各自的优势。 基因芯片技术对于已知基因突变的筛查具有明显优势,可以快速、全面地检测出目标基因突变。测序能有效检测致病基因、易感基因位点以及含量极低的突变基因,不仅对于单基因遗传病是一个很好的研究手段,对于许多常见病,如肿瘤、糖尿病等疾病也可进行大规模比较研究。测序对已发生疾病(临床)检出率方面略优于基因芯片。 3.实验周期 相比于测序,无论是实验过程还是数据分析过程,芯片都更为成熟和简单。因而芯片的实验周期通常约为测序的一半时间或者更短。 4.价格 与基因测序相比,基因芯片性价比高,一张基因芯片可以实现mRNA,lncRNA,circRNA不同种类的RNA全基因组检测。 总结重点: 基因芯片只能检测已知基因 高通量测序可以检测到未知基因 参考学习链接: 1.https://mp.weixin.qq.com/s/tWHWA-f1RnP_XWY66p12pg2.https://www.biowolf.cn/GEOchip/seq_chip.html 3.http://blog.sina.com.cn/s/blog_40d4ae110101fjzy.html 4.https://www.sohu.com/a/109938085_1150012023-08-14 19:04:251
如何对基因组测序进行双端测序过滤
一、16S测序原理16SrDNA基因存在于所有细菌的基因组中,具有高度保守性。然而该基因序列还包括9个高变区(V1-V9),通过特异性引物对某一段高变区(如V3区)或某几段高变区(如V3-V4区)进行扩增测序,然后与数据库比对,可特异性识别细菌种类。二、宏基因组测序原理将基因组DNA随机打断成若干条500bp的小片段(类似于拼图中的单个形状不一的模块),然后连接接头(双端120bp),在片段两端加通用引物进行PCR扩增测序。将reads进行组装拼接(类似于将众多模块拼成一副完整图片),得到基因序列,众多基因构成完整的基因集。同时将获得的reads片段或组装好的基因序列与NCBI数据库进行比对,得到物种注释结果。对于16S测序而言,任何一个高变区或几个高变区,尽管变异性再高,对于某些物种来说,这些高变区也可能十分相近,而能够区分它们的特异性序列片段有可能不在我们的扩增区域内。换言之,非全长的可变区序列覆盖范围不够导致无法鉴定到种。宏基因组在建库之前会先将基因组DNA随机打断成若干小片段,而这些小片段中总有一些能够包含区分2个物种的基因差异序列。由于测序深度足够深,相当于覆盖了整个基因组的信息,因此在与NCBI数据库比对时,就能够注释到相应的种水平的物种。2023-08-14 19:04:361
基因测序是什么市场结构类型
EN国产正崛起!中国基因测序产业链图谱与市场分析产业资讯火石创造2022.07.131180基因测序技术是基因检测关键技术之一,在科学研究、临床应用及其他领域得到广泛应用。经过近50年的发展,基因测序技术从第一代的Sanger技术已经发展到第四代纳米孔测序技术,其中第二代的NGS技术是市场上应用最广泛的基因测序技术,三、四代测序技术还处于发展初期。基因测序仪市场基本被跨国巨头垄断,我国基因测序生产企业主要布局测序仪配套试剂。随着国内企业不断研发与创新,一批基因测序仪自主研发产品逐渐获批上市。在市场应用方面,我国无创产前基因检测(NIPT)市场发展稳定;而随着国家政策的推动和技术的进步,肿瘤基因诊断和肿瘤早筛有望成为基因测序最有发展前景的应用市场之一。一、基因测序定义与技术(一) 基因测序定义基因测序是一种新型基因检测技术,能够从血液或唾液中分析测定基因全序列,预测罹患多种疾病的可能性,个体的行为特征及行为合理。基因测序技术能锁定个人病变基因,提前预防和治疗。基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床使用,可以说基因测序技术是下一个改变世界的技术。(二) 基因测序技术自1975年桑格(Sanger)和考尔森(Coulson)发明链终止法和1976-1977年马克西姆(Maxam)和吉尔伯特(Gilbert)发明化学降解法,到1986年ABI公司首次成功实现第一代基因测序技术的商业化,再到2014年Oxford Nanopore发布纳米孔单分子测序平台,基因测序技术已经发展至第四代测序技术。1、第一代基因测序技术(Sanger)核心原理:由于双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)的3′位置不含羟基,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断DNA的合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分别为:ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP),产生A、T、C和G4组不同长度的一系列核苷酸,然后利用凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。传统第一代基因测序技术具有准确性较高、简单和快捷等优点,但在一些方面存在限制:1)测序通量低,仅适用于小样本遗传疾病基因的鉴定,难以完成没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查;2)测序成本高、耗时长。据估算,用该法完成人类全基因组的测序,至少需用时3年,花费30亿美元。因此第一代基因检测技术大多数用于科学研究。随着科学技术的发展,高通量、低成本、自动化程度高的第二代测序技术出现。2、第二代基因测序技术(NGS)第二代基因测序技术,是利用一系列高通量测序技术(High-Throughput Sequencing)进行大规模的基因组DNA或RNA测序,能快速准确地获得基因组编码序列,满足极短时间内对基因组进行高分辨率检测的要求。高通量测序技术是对传统测序技术的一次革命性的改变,它又被称为下一代基因测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)。核心原理:在荧光或者化学发光物质的协助下,通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上的过程中释放出的光学信号而间接确定DNA或RNA的序列。NGS测序技术边合成边测序的原理,对比第一代基因测序技术,大大降低了测序所需时间和成本,解决了第一代技术通量低、成本高的痛点,使得基因测序实现了大规模商业化应用,是目前全球及全国市场发展主流技术。目前,单人类基因组测序成本已降至1000美元以下。虽然NGS测序技术具有高通量、低成本和高低丰度DNA检测能力的优点,同时也存在以下缺点:1)读长短。第二代测序技术每个DNA片段的最大测序读长在400-700bp 左右,远低于第一代测序的 900-1000bp。2)测序结果处理难度大。由于第二代测序读长大幅缩短,拼接两个 DNA 片段间所需的重叠的区域也相应减小,导致测序结果的拼接难度大幅增加。另外,第二代测序由于通量高产生了大量的数据,因此给处理测序结果增加了难度。为解决这些难题,以单分子测序为标志的第三代测序技术和以纳米孔测序为代表的第四代测序技术应运而生。3、第三代基因测序技术(单分子测序)第三代基因测序技术(Third-generation sequencing,TGS)是指在单个细胞、单分子水平上对基因组进行测序,测序过程中不需要涉及PCR扩增,实现对每一条DNA分子的单独测序。主要包括Helico Bioscience公司的单分子测序技术和Pacific Bioscience公司的单分子实时(Singlemolecule real time,SMRT)测序技术,并以后者为代表。区别于NGS测序技术,单分子测序技术可以通过直接读取反转录全长cDNA,有效获取高质量的单个RNA分子全部序列,进而深入研究可变剪接转录本。而且测序过程相对连续,不会因为洗去试剂或检测等步骤而暂停测序,也不用进行DNA扩增,操作便捷,测序时间短。因此单分子测序技术具有长读长、测序时间短、操作便捷等优势。目前该技术还处于科学研究阶段,随着技术的成熟,未来将广泛应用于临床。4、第四代基因测序技术(纳米孔测序)第四代基因测序技术,也叫做纳米孔测序技术,是基于电信号测序的技术,原理是通过电场力驱动单链核酸分子穿过纳米尺寸的蛋白孔道,由于不同的碱基通过纳米孔道时产生了不同阻断程度和阻断时间的电流信号,由此可根据电流信号识别每条核酸分子上的碱基信息,从而实现对单链核酸分子的测序。相对于单分子测序技术,纳米孔测序技术真正实现单分子检测和电子传导检测相结合的测序方法,完全摆脱了洗脱过程、PCR扩增过程,具有超长读长、高通量、更少的测序时间、更为简单的数据分析的优点。而相对于第一代、第二代测序技术,错误率高是目前纳米孔测序的主要缺点。目前市场上的纳米孔测序平台主要是以Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司的MinION纳米孔测序仪为主,该测序仪测序读长超过150kb,测序速度快,实时数据监测,便捷携带。纳米孔测序技术目前还处于初期发展阶段,应用场景发展相对成熟的是感染病病原体检测。表1:四代基因测序技术对比来源:火石创造根据公开资料整理二、基因测序产业链基因测序产业链主要包括上游基因测序仪等基因测序设备和配套试剂生产制造商、中游基因测序服务商和下游应有商。图1:基因测序产业链来源:火石创造根据公开资料绘制(一) 上游:基因测序仪等基因测序设备和配套试剂生产制造商基因测序仪属于基因测序产业链最核心的环节之一,技术壁垒高,其装机量基本被跨国巨头垄断。目前,全球基因测序仪装机量达到2万台,其中Illumina公司的市场份额占比达80%,Thermo Fisher公司的市场份额占比达9-10%左右,Illumina公司和Thermo Fisher公司的基因测序仪装机量市场份额占比几乎接近90%。我国已上市基因测序仪主要分为三种模式:自主研发、贴牌和与国际巨头合作研发。截至2022年3月,我国已通过NMPA有效获批上市的基因测序仪产品有15款;其中自主研发产品有9款,主要是以二代测序仪为主,华大基因与华大制造获批数量最多,合计4款。齐碳科技、真迈生物、孔确基因、迪谱诊断、今是科技等国内企业积极探索布局三代、四代测序仪和相关配套试剂。由于基因测序仪技术壁垒高,因此国内企业大多数布局检测试剂盒等测序仪配套试剂。我国已通过NMPA有效获批上市的检测试剂盒有近300款,其中基于NGS技术的试剂盒有200多款,是目前基因测序市场高速成长的细分赛道;三代、四代配套试剂自主研发产品还处于发展初期,尚未有任何三代、四代测序器械获得医疗器械注册证件。2023-08-14 19:04:441
双脱氧法DNA测序的基本原理是什么
Sanger法测序是酶法测序2023-08-14 19:04:533
14.捕获测序
现在常用的目标区域捕获测序技术主要分为三类: hybridcapture(杂交捕获),molecular inversion probes(分子倒置探针,MIP)和 多重PCR。通常适用于检测几十到几千个位点,或几十kb以下的区域。 杂交捕获的原理是通过人为设计探针与目标区段部分或者全部互补将目标区段捕获,未设计探针区段的片段则会被洗脱丢弃,之后通过变性将探针和被捕获的片段分开进行二代测序文库构建。 根据探针的状态不同,杂交捕获又分为固态杂交和液态杂交。固态杂交就是在芯片上布满了探针,通过探针将目标区段捕获。液态杂交是将探针放在液相中,探针携带生物素,当杂交完成后,通过磁珠可以将探针吸附(此时探针有携带目标区段的和空探针),随后将未被捕获的片段丢弃,再通过变性将探针和目标片段分开,然后利用磁珠将所有空探针吸附丢弃,捕获完成。 杂交捕获最大的优点是捕获区段大,可以达到几百MB;同时根据探针的原理其均一性很好(均一性是评价捕获技术很关键的参数,均一性好后续测序成本就会下降)。杂交捕获的缺点是特异性较差,容易捕获非目标区段,因为杂交前样本会被随机打断(一般认为500bp是比较合适的长度),探针捕获时可能和目的片段部分杂交,导致一些含有部分目标区段的片段被捕获,导致特异性下降。MIP的优势是特异性好而且捕获完成后的片段能够直接进行建库,其缺点则是捕获效率不高,有些区段难以设计探针进行捕获。 多重PCR靶向捕获测序技术则是利用多重PCR反应,同时扩增多个目标区域序列,得到扩增子产物;然后通过PCR反应或者酶连接反应,将二代测序所需的接头序列(adapter)引入到扩增子产物的两侧,得到扩增子文库;最后进行二代测序。 由于引物的设计还是体系的价格都是最简单的,而且设计门槛低,不需要特殊的实验设计,因此PCR-目标区段捕获也是商业化应用最广泛的方式。 ————最近投稿在返修,白天还要上班,存稿也没有了,还想看看能不能报个博士,不知道哪里有博士读,尽量保证完成日更吧!2023-08-14 19:05:021
一代测序原理
一代测序原理,详细介绍如下:一、原理:1、一代测序原理是使用Sanger测序技术,通过对DNA链延伸过程中释放的逐个核苷酸残基进行检测,获得DNA序列信息。2、Sanger测序技术是一种经典的DNA测序方法,也被称为dideoxy链终止法,这种方法首先利用DNA聚合酶和单链DNA模板,以及一些特殊的dNTP副产物进行DNA的延伸,会在连接后停止链的生长,ddNTP比普通的dNTP缺少一个基团,使得下一个核苷酸无法与其成链,从而停止了DNA的延伸。3、将不同长度的DNA片段分别进行PCR扩增并分离,最后在含有荧光基团的聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离,并通过荧光检测来确定各个位点上所含的碱基种类。二、技术特点:1、高质量:由于Sanger测序技术可以生成相对较长的读段,因此可以获得高质量的测序结果,质量得以保障。2、高精度:Sanger测序技术的误差极小,同时也具有低重复率的优点,因此可以为生物学研究提供极为精确的数据支持。3、适用性广:Sanger测序技术可以应用于各种类型的DNA,包括基因组DNA、RNA和表达序列标签等。三、构建反应体系:1、构建Sanger测序反应的关键是要拥有一个完整的DNA模板,材料被加入到一起,并在适当的pH和离子强度下用于扩增DNA数量。2、一代测序原理是使用Sanger测序技术进行DNA的测序,通过逐个检测链延伸过程中释放的dNTP残基来获得DNA序列信息。该技术具有高质量,高精度和适用性广等特点,已被广泛应用于生物学研究领域。2023-08-14 19:05:101