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实验1总DNA提取
生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同,而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异,因此不同生物采用的提取方法也不同,一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]
学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]
植物叶片经液氮研磨,可使细胞壁破裂,加入去污剂(如CTAB),可使核蛋白体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀,DNA进入水相,再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法,其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂,能溶解膜蛋白与脂肪,也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下,结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物,此复合物在高盐(>0.7mM)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mMNaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8,纯的RNA样品A260/280≈2.0,并且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。
[实验器材]
1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶(50ml)9、滴管10、细玻棒11、小烧杯(50ml)12、离心管(50ml)13、植物材料
[实验试剂]
1、3×CTABbuffer(pH8.0)
100mMTris
25mMEDTA
1.5MNaCl
3%CTAB
2%β-巯基乙醇
2、TE缓冲液(pH8.0)
10mmol/LTris·HCl
1mmol/LEDTA
3、氯仿-异戊醇混合液(24:1,V/V)
4、95%乙醇
5、液氮
[实验步骤]
1、称取2g新鲜的植物叶片,用蒸馏水冲洗叶面,滤纸吸干水分。
2、将叶片剪成1cm长,置预冷的研钵中,倒入液氮,尽快研磨成粉末。
3、待液氮蒸发完后,加入15mL预热(60℃)的CTAB提取缓冲液,转入一磨口锥形瓶中,
置于65℃水浴保温0.5h,不时地轻轻摇动混匀。
4、加等体积的氯仿/异戊醇,盖上瓶塞,温和摇动,使成乳状液。
5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中,在4℃下8000rpm离心10min。
6、离心管中出现3层,用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中,弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。(根据需要,上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。)
7、收集上层清液,并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95%乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动,可看到纤维状的沉淀(主要为DNA)迅速缠绕在玻棒上。
8、小心取下这些纤维状沉淀,加1~2mL70%乙醇冲洗沉淀,轻摇几分钟,除去乙醇,即为DNA粗制品。
9、将粗制品溶于TE缓冲液。
10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。
[注意事项]
1、液氮研磨时,小心操作,以免冻伤。
2、所有操作均需温和,避免剧烈震荡。
[思考题]
CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么?
液氮研磨的原理是什么?
实验二质粒DNA的提取
质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质,是环状的`双链DNA分子。由于质粒比较小,并且能进行独立的自我复制,常常被改造为克隆和表达的载体分子。
[实验目的]
通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的基本原理,掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。
[实验原理]
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速
而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
[实验器材]
1、恒温培养箱
2、恒温摇床
3、台式离心机
4、高压灭菌锅
5、Tip头、Eppendorg管
6、含有目的质粒的E.coli菌株
[实验试剂]
1、溶液I
50mmol/L葡萄糖
5mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl
10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2、溶液II
0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合
3、溶液III
5mol/L乙酸钾60mL
冰乙酸11.5mL
水28.5mL
4、TE缓冲液
10mmol/LTris·HCl
1mmol/LEDTA(pH8.0)
5、70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
6、EcoRI及其缓冲液
7、HindIII及其缓冲液
[实验步骤]
1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中,12000r/min离心30sec。
3、吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。
5、加200μL溶液II(新鲜配制),盖紧管皿,快速颠倒5次,混匀内容物,将Eppendorf管放在冰上。
6、加入150μL溶液III(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置5min。7、12000r/min,离心5min,将上清液转至另一Eppendorf管中。
8、向上清液加入等体积的饱和酚,混匀。
9、12000r/min,离心5min,将上清液转至另一Eppendorf管中。
10、向上清液加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清液,把Eppendorf管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥。12、20μLTE缓冲液,使DNA完全溶解,-20℃保存。
[注意事项]
操作时,避免剧烈震荡。
[思考题]
1、实验操作中,饱和酚的作用是什么?
2、SDS和NaOH的作用是什么?
[参考文献]
《精编分子生物学实验指南》(第四版)
[美]FM奥斯伯,RE金斯顿等主编科学出版社2005
实验三总RNA提取
【目的和要求】
1.掌握样品中总RNA的提取的原理和方法。
2.熟悉RNA纯度及浓度检测方法。
3.了解RNA提取过程中的注意事项。
【实验原理】
RNA是基因表达的中间产物,存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的,如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在,所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂,迅速破坏细胞结构,使核蛋白与RNA分离,释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心,使RNA与其他细胞组分分离,得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性,保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂,如DEPC是RNase的强抑制剂,常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂,也能抑制RNase活性,并有助于除去非核酸成分。
【教学内容】
1.总RNA提取的基本原理和常用方法介绍
2.进行动物组织或血液样品总RNA提取。
3.对提取的RNA的进行纯度和浓度检测。
【实验器材和试剂】
超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管。
玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h;不耐高温的器皿(如塑料制品)应用0.1%DEPC浸泡2h,70~80℃烘烤干燥,120℃高压20min,再70~80℃烘烤干燥方可使用。
细胞裂解液:异硫氰酸胍4mol/L;柠檬酸钠(pH7.0)25mmol/L;十二烷基肌氨酸钠0.5%;β-巯基乙醇0.1mol/L(称取柠檬酸钠0.64g,十二烷基肌氨酸钠0.415g,吸取β-巯基乙醇0.7ml,用无Rnase的蒸馏水溶解,定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml,异硫氰酸胍25g,混合,完全溶解后4℃保存备用)
TRIzolRNA抽提试剂、2mol醋酸钠、0.1%DEPC、平衡酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75%乙醇(用RNase-free水配制)、RNase-free的水。
【实验方法】
(一)异硫氰酸胍法(PLT)
1.取新鲜动物组织0.1~0.2g置于组织匀浆器中,加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴
中迅速匀浆15~30s,以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。
2.加入2mol醋酸钠(pH4.0)120μl,充分混匀。
3.加入1.2ml酚:氯仿:异戊醇,充分混匀摇振10s,冰浴15min。
4.将混合物转移至1.5mlEp管中,4℃,离心10000r/min,20min.
5.移取上层水相至另一Ep管中,加入等体积的异丙醇,静置-20℃,30min沉淀RNA.
6.4℃,离心12000r/min,15min.
7.弃上清液,加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物;如果RNA沉淀物被悬浮,则4℃离心10000r/min,10min。
8.弃上清液,自然干燥,但应避免沉淀完全干燥,否则RNA难以溶解。
9.加入100μl无RNase水重悬RNA,或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠(pH4.0),-70℃保存。
(二)TrizolReagent/总RNA提取试剂
TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂,在样品裂解或匀浆过程中,TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相,用异丙醇可沉淀回收RNA。下面介绍由上海美季生物技术有限公司总RNA提取试剂推荐的操作步骤:
1.匀浆处理(Homogenization)
(1)组织中提取总RNA
①植物组织:植物叶片直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨成粉末,每50-100mg植物叶片加入1mlTRIzol。
②动物组织:按10-30mg组织加入1mlTRIzol,用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。
(2)培养细胞中提取总RNA
①贴壁细胞:无须胰酶消化,可直接用TRIzol进行裂解,每10平方厘米培养面积加1mlTRIzol。
②悬浮细胞:可直接离心收集、裂解,每1mlTRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞,或107细菌细胞。
(3)血液中提取总RNA
直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10分钟,10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清,收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTRIzol。
2.分层(PhaseSeparation)
(1)样品加入TRIzol后,室温放置5min,使样品充分裂解。
注:如不进行下一步操作,样品可放入-70℃长期保存。