营养缺陷型筛选步骤

营养缺陷型（auco troph）：因丧失合成某些生活必需物质的能力,不能在基本培养基上生长的,突变型菌株.营养缺陷型auxotroph 指微生物等不能在无机盐类和碳源组成的合成培养基中增殖,必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长.一如胸间氮苯缺陷型所表现的那样.另外对这样的性质则称为营养缺陷性（auxotrophy）.营养缺陷型是作为原养型的对应词来使用. 　　营养缺陷型式微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段,在发酵工业上有广泛用途.
营养缺陷型的鉴定
（1）营养缺陷型鉴定步骤
　A、缺陷型类别的测定
通常分别用以下物质来代表氨基酸、维生素、核酸碱基：
①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨,代表氨基酸类
②酵母浸出液,基中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均有
③维生素混合物,代表维生素类
④核酸碱基混合液,代表嘌呤、嘧啶类.
将待测微生物从斜面上用生理盐水或缓冲液乔洗下来,离心洗涤,制成浓度为106~108ml-1菌悬液,取0.1ml加入到基本培养基中,混匀倒入平皿,制成平板.凝固后,用加圆滤纸分别浸湿沾取以上四类代表物质,覆于平板标定的位置上.培养后,观察圆滤纸片周围菌株生长情况,如出现混浊的生长圈,就可初步确定缺陷型所需的生长因子属于哪一类别,进一步复证.
B、缺陷型所需生长因子的测定
在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况,称为生长谱法.
单一生长因子：鉴定氨基酸或维生素的营养缺陷型,较为简便的方法是分组测定法.将21种氨基酸,组合6组,每6种不同氨基酸归为一组.如果以15种维生素进行测定,则把5种维生素归为一组,共5个组合.
组别
氨基酸组合组
1
赖氨酸
精氨酸
蛋氨酸
胱氨酸
亮氨酸
异亮氨酸
2
缬氨酸
精氨酸
苯丙氨酸
酪氨酸
色氨酸
组氨酸
3
苏氨酸
蛋氨酸
苯丙氨酸
谷氨酸
脯氨酸
天冬氨酸
4
丙氨酸
胱氨酸
酪氨酸
谷氨酸
甘氨酸
丝氨酸
5
鸟氨酸
亮氨酸
色氨酸
脯氨酸
甘氨酸
谷氨酰胺
6
胍氨酸
异亮氨酸
组氨酸
天冬氨酸
丝氨酸
谷氨酰胺













组别
维生素组合组
1
维生素A
维生素B1
维生素B2
维生素B6
维生素B12
2
维生素C
维生素B1
维生素D2
维生素E
烟酰胺
3
叶酸
维生素B2
维生素D2
胆碱
泛酸钙
4
对氨基苯甲酸
维生素B6
维生素E
胆碱
肌醇
5
生物素
维生素B12
烟酰胺
泛酸钙
肌醇










测定方法：缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板,把5组或6组生长因子直接加于同一琼脂平板上,或用滤纸片沾取后覆于琼脂平板上,培养后,观察哪一组或哪两组区产生混浊生长圈,即可确定该菌株缺陷的生长因子.
如果要测定数十或上百个缺陷型菌株时,则可改成一个平皿中加入一种生长因子,制成平板,在翻转平皿底部,几十个方格子,把每株缺陷型按编号移接到琼脂平板格子中.培养后,根据混浊圈出现情况,则可确定哪些缺陷型菌株是缺这种生长因子的.

（二）、营养缺陷型菌株的应用
其在研究和实践中都有极其重要的意义.它可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等遗传规律所不可缺少的标记菌种；也可作为氨基酸、维生素、碱基等物质生物测定的实验菌种；在生产中,可直接用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；也可作为菌种杂交、重组育种和利用基因工程进行育种时所不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株.

一.筛选营养缺陷型菌株的一般步骤和方法
①诱变 常用紫外线等物理方法和化学诱变剂等诱变形成大量营养缺陷型菌株.用15W或20W紫外灯管,距离15cm～30cm,照射10sec～20min.在照射受试菌前,灯管须预热20min,使灯光稳定.菌悬液要磁力搅拌,使所有单细胞或单孢子均匀受到照射.特别要注意,应在黑暗或红外光下操作,接种后器皿用黑布包严,防止发生可见光的修复作用.
②淘汰野生型
a）抗生素法 某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物,而对处于休止状态的微生物无杀伤作用.如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成,制霉菌素可损伤真菌细胞膜,二者可分别杀死生长繁殖着的细菌、真菌.
b）菌丝过滤法 适用于放线菌、霉菌等丝状微生物.在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体,而营养缺陷型孢子则不生长.将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中,振荡培养10h～12h,使原养型萌发（以肉眼刚能看见菌丝为度）,然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤,菌丝被滤除,未萌发的缺陷型孢子能顺利通过,从而达到富集营养缺陷型的目的.
③检出缺陷型的常用方法
a）逐个测定法（点种法）把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离,将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上,凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落,表明其为营养缺陷型.
b）夹层培养法经诱变处理后的菌液,稀释后与基本培养基混匀并倾入平皿中,待凝固后,再加上一薄层不含菌的基本培养基.培养后在皿底将长出的菌落做上标记.然后加上一层完全培养基,再经培养后,新出现的菌落多数是营养缺陷型（图3－31）.此法适用于兼性厌氧的细菌.
C）影印法 将丝绒包在直径小于平皿的圆柱台上,固定,作为影印接种工具,灭菌备用.将经诱变处理并淘汰野生型的菌液涂布于完全培养基表面上,培养,待长出菌落后,用影印接种工具在此平板上轻按一下,然后在另一基本培养基平板上按一下.经培养后在基本培养基上不长而在完全培养基的相应部位上生长的菌落,为营养缺陷型.
④鉴定营养缺陷型——生长谱法 将检出的缺陷型菌株接种在完全培养基上培养,把生长的菌体或孢子洗下,离心清洗后制成浓度为107个／ml～108个／ml的菌悬液.取0.1ml该悬液与基本培养基混匀倒皿,冷凝并稍干燥后,分区加沾有各种营养物的圆滤纸片,培养,观察生长反应.
在筛选营养缺陷型的过程中必须注意表型延迟现象.由于诱变剂一般仅作用于DNA的某一单链,故突变无法反映在当代的表型上,需经DNA复制和细胞分裂后,才使表型发生变异,此即表型延迟现象.
二.富集和分离抗生素敏感菌的营养缺陷型突变株的抗生素法 将抗生素加入原养型培养基（即培养基中缺少营养缺陷型所需的养分）中,能杀死生长中的野生型细胞,而不能生长的突变株得以幸免.
抗生素敏感菌营养缺陷型菌株的筛选过程①菌悬液诱变处理.②死的和活的野生型细胞及一些活的前突变细胞的混合液在C．M．中培养,使已发生营养缺陷突变的细胞的缺陷表型得以充分表现.若无这一阶段的培养,则许多细胞的基因型虽已改变,但表型仍和野生型一样,这些突变细胞在以后接触抗生素时也将被杀死.③在无氮培养液中培养,使营养缺陷型菌株细胞内所含养料尽量消耗,以便停止其生长繁殖.④在含抗生素的M．M．中培养,杀死能生长的野生型菌株.⑤检出缺陷型.⑥鉴定缺陷型.
三.营养缺陷型在科研和生产实践中的应用在科学研究中,营养缺陷型既可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体融合等遗传规律所必不可少的标记菌种,也可作为氨基酸、维生素或碱基等生物测定的试验菌种.在生产实践中,营养缺陷型可作为菌种杂交、重组育种和构建工程菌时所不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株,它们还常被用作生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株.由于营养缺陷型在代谢途径中某一步骤发生缺陷,致使终产物不能积累,从而遗传性地解除反馈抑制,使中间代谢产物或另一分支途径的末端产物得以积累.
例如,用高丝氨酸营养缺陷型作为赖氨酸的生产菌株,由于该突变株的遗传性,解除了赖氨酸与苏氨酸的协同反馈抑制,因此,在培养系统中限量补充苏氨酸,就可使天冬氨酸半醛全部向赖氨酸方向转化,赖氨酸产量大大提高.

营养缺陷型是指某菌株经突变后,丧失了合成某营养素的功能,若在培养基上培养必须添加相应的营养素才能生长.

在这一方法中提到的所谓“浓缩”营养缺陷型突变株,裨是淘汰野生型,剩下营养缺陷型,因而,在一个群体的营养缺陷型突变株的比例明显提高.在培养环境中加抗生素为何能“浓缩”营养缺陷型突变株?这是因为一般抗生素的作用机制是抑制正在生长的生物细胞的某一或几步生物合成反应,致使细胞生长繁殖必需的细胞组成成分与相应功能缺失,最终导致细胞死亡或丧损生长繁殖能力.只有野生型菌株才能在基本培养基上生长,一旦生长,即被加入培养基中的抗生素“击中”,而营养缺陷型突变株由于在基本培养基中不能生长,因而,抗生素对这不起作用.最终通过终止法或稀释法消除抗生素的作用后,把有限的幸存的营养缺陷型突变株置于完全培养基中培养扩增,从而达到“浓缩”的目的.

营养缺陷型auxotroph,指微生物等不能在无机盐类和碳源组成的合成培养基中增殖,必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长.一如胸间氮苯缺陷型所表现的那样.另外对这样的性质则称为营养缺陷性（auxotrophy）.营养缺陷型是作为原养型的对应词来使用.
我们可以用它来研究基因的作用
并且,在微生物筛选中它也有巨大的作用

微生物由于基因及结构比较简单,变异性很强,所以不能排除有这种变异的可能

微生物中筛选营养缺陷型一般有两个意义：
1、营养缺陷型有可能是突变体,要筛选基因突变体第一步一般都会从营养缺陷开始.
2、主要应用于筛选转基因受体.

1.在配置营养缺陷型培养基时,会有大量的气泡产生,这是为什么?
培养基温度太低,SD不要从冰箱中取出就用.
用枪时小心打出液体,枪头中留一点点液体.最好冲向容器壁,而不是直接冲向液体.
2.进行了两次质粒转化酵母均不成功,在30度温浴时震荡了,与这有关吗?
震荡?上下颠倒就可以.DMSO对细胞壁有破坏作用.剧烈振荡的话,酵母会死掉的,另外 要选用进口的 carrier DNA,质粒可以多加些.

第一步,诱变剂处理,与一般诱变处理相同 第二步,淘汰野生型：通过抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株,从而达到浓缩极少数营养缺陷型的目的 第三步,检出缺陷型：有夹层培养法,限量补充培养法,逐个检出法,影印平版法 第四步,鉴定缺陷型,可借生长谱法进行

两者都是营养缺陷型.营养缺陷型是因丧失合成某些生活必需物 质的能力,不能在基本培养基上生长的,必须补充一种或一种以上的 营养物质才能生长的突变型菌株.E.coli(his-)和 E.coli(lac-)都是大肠 埃希菌营养缺陷性.用前三个英语小写斜字体表示用所缺营养物,减 号表示缺陷型.E.coli(his-),组氨酸缺陷型.E.coli(lac-),乳糖发酵 缺陷型.

只解释D么?因为牛肉膏中含有核苷酸也就含有腺苷酸,所以可以长出这中营养缺陷型菌种

我的见解如下：
1.先要获得野生型大肠杆菌的纯培养物
2.诱变：可以选择各种诱变法,如紫外线诱变法,将一定浓度的菌液（可分成好几等分分别做实验）放在一定强度的紫外灯下照射,那分成的几等分可以分别照射10S,20S,30S,40S,50S,60S,注意,菌液不可太稀太浓,这个操作应该在黑暗的条件下进行,只允许有紫外光,以免光修复造成突变失败.
3.培养：将上述菌种分别涂抹在配好的完全培养基上（牛肉膏-蛋白胨培养基）,倒置培养过夜
4,筛选：配置好基本培养基,再往上面添加一定浓度的氨基酸营养液,除了不要添加你说要得到的营养缺陷的那种氨基酸,必需氨基酸都要添加,再用影印法将3中的菌落印到这些培养基上,倒置培养过夜.
5.挑取：直接挑取4中培养基上的菌落,就是你要找的氨基酸营养缺陷突变菌株
在2中,之所以要分成好几份做,再以不同时间长短去照射,是为了加大筛选的效率时间过短,可能得不到想要的突变菌种,而时间过长,菌株全死,也得不到想要的菌株,所以这样做也可以算是一个试验性的步骤!