文库

创刊目标为少年向小说，有富野由悠季的“机动战士钢弹”系列，渡边由自的“重戦机エルガイム”以及富田祐弘的“超时空要塞”出版。后来，水野良的罗德斯岛战记开启了奇幻小说的时代。其中也有出版如乙一的“寂寞的频率”，瞄准一般读者的作品出版。在2002年2月，成立了“角川Sneaker文库《Sneaker Mystery》”出版只有少量插画的作品，如米泽穗信的“愚者のエンドロール”、稻生平太郎的“アクアリウムの夜”以及乙一、恩田陆等人的作品，却因为对轻小说及一般小说读者都缺乏吸引力而失败，但依然成为此种出版方式先驱，后来MediaWorks也依照此方式推出一系列的精装书籍。在2007年，“只有你听到（きみにしか闻こえない）”为Sneaker初次的电影化作品。

蓝白斑筛选的原理 分类:生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。还有一个是应用抗生素抗性原理。质粒载体一般都带有抗生素抗性基因，当其携带目的基因转化入宿主细菌时，使宿主也带有抗生素的抗性。置于含抗生素的培养基中培养，能够生长的就是含重组子的细菌。

网页链接Tn5转座酶建库原理

《宝诺集团 为你解答 ，希望能够帮到你》pooling 英["pu:lu026au014b] 美["pu:lu026au014b] v. 集中…共同使用，共用( pool的现在分词 ); [例句]Pooling of expertise and resources with partners.和伙伴共享和汇集技术专长和资源。[其他] 原型： pool

高通量测序又称NGS，重新定义了基因组学研究。近年来，NGS技术稳步发展，伴随着成本下降以及测序应用呈指数增加。本文，我们研究了影响测序文库质量的关键因素，以及，在DNA来源和RNA来源文库准备过程中存在的挑战。这些因素包括，DNA/RNA材料的定量和物理性质以及潜在应用（比如，基因组测序、靶向测序、RNA-seq、ChIP-seq、RIP-seq和甲基化），在制备高质量测序文库的内容中将提到。另外，我们也会讨论制备单细胞来源的文库的方法。 在过去的5年里，NGS技术在生命科学领域的研究人员中得到了广泛应用。与此同时，随着测序技术的发展和进步，衍生了一些核酸提取和文库制备的方法。比如，已经可以成功利用来自单细胞的RNA和DNA进行文库的制备. NGS文库制备的基础是将靶向的核酸、RNA或DNA 改造成测序仪可以使用的形式（Fig 1）。在这儿，我们对比了多个文库制备策略以及NGS应用，主要着眼于与illumina测序技术兼容的文库。但是，需要指出一点，本文讨论的几乎所有原则只要稍加修饰便可应用于其他NGS平台，比如，Life Technologies、Roche和Pacific Biosciences。 一般来说，文库制备的核心步骤包括：1）片段化及或选出特定长度的片段，2）将其转化为双链的形式，3）将寡核苷酸接头连接至片段末尾以及4）对文库进行定量；目标DNA片段的大小是NGS文库构建的关键因素。对核酸进行片段化的方法主要包括物理、酶切和化学的方法。物理方法包括声波剪切（代表：Covaris）和超声（代表：BioRuptor），酶切方法包括非特异性内切酶和转座酶片段化；我们实验室中，Covaris, Woburn, MA主要用于获得100-5000bp范围的DNA片段，而Covaris g-TUBEs主要用于mate-pair文库所必需的6-20kb范围的DNA片段。酶切的方法包括DNase I或片段化酶的消化，一个两种酶的混合（New England Biolabs, Ipswich MA）。两种方法都很有效。但是，片段化酶相比物理方法会产生更多的假indel。另一种酶切方法是Illumina的Nextera，利用转座酶进行随机片段化并把接头序列插入双链DNA中。 这种方法有几个优势，包括，减少样品处理和制备的时间。 文库大小是由插入片段（指的是接头序列之间的文库部分）大小决定的，因为接头序列的长度是不变的。反过来说，最佳插入片段长度是有NGS设备以及特定测序应用决定的。比如， illumina中，最佳片段大小是受簇生成过程影响的，这个过程包括，文库编写、稀释以及分布至芯片表面进行扩增。虽然，短片段扩增更加有效，长片段文库能够产生更大、更弥散的簇。我们用illumina测序的文库最大为1500bp。 最佳文库大小也是由测序应用决定的。对于外显子测序来说，80%以上的人类外显子长度小于200bp。我们测试PE100bp，外显子文库大小约为250bp，这样可以匹配大多数外显子的平均大小，结果中没有重叠的读对。 RNA-seq文库大小也是由应用决定的。对于基因表达分析我们采用SE100的测序。但是对于，可变剪切或转录起始终止位点的判定，我们选择PE100的方案。大多数应用中，RNA在片段化之前会逆转录成cDNA的形式。一般是利用二价金属离子（镁或锌）对RNA进行可控的热消化。文库片段大小可以通过调节消化反应的时间来控制，重复性很好。 在最近对7个RNA-seq文库制备方法的研究中，大多是先对RNA进行片段化然后进行加接头。有两种方法，不利用随机引物，或者说在SMARTer Ultra Low RNA试剂盒中， 合成具有固定3"，5"序列的全长cDNA序列。 全长的cDNA文库（平均2kb）可以通过长距离PCR（LD-PCR）进行扩增。这种扩增的双链cDNA再通过声波剪切至合适的长度，用在标准的illumina文库准备过程中（包括，末端修复和补平，加A和接头连接，再通过PCR进行扩增。） 另一种文库构建后对文库大小处理步骤是片选以及去除接头二聚体或其他文库制备的副产物。接头二聚体是接头自连的结果。这些二聚体成簇效率非常高，而且会消耗掉珍贵的芯片空间，但不产出任何有效数据。因此，我们通常利用磁珠法或切胶回收。磁珠法适用于起始材料比较充足的情况。若样本投入有限，就会生成更多的接头二聚体。我们的经验是，磁珠为基础的方法在这种情况下不适用，需要结合磁珠和切胶回收的方法。 在microRNA/small RNA文库制备过程中，目的产物通常只比120bp的接头二聚体长20-30bp。因此，必须使用切胶回收的方法获得尽可能多的目的序列。这种分离精度对于磁珠来说就不适用。另外，我们经常需要建大插入片段（1kb）的文库，结合更长的读长PE300以及无PCR步骤，用于细菌基因组的从头组装。为了尽可能获得可用于组装的数据，就必须要小心地进行切胶回收以获得大小较为一致的插入片段。 在利用DNA样本进行文库构建过程中有几个考虑，包括起始材料的量以及该文库是用于重测序（有可用于比对的参考序列）还是从头测序（需要利用此次下机数据组装出新的参考序列）。文库制备容易存在bias，这是由于基因组存在高GC或低GC的区域，目前已经开发了解决这些问题的方法，包括仔细选择用于扩增的聚合酶、循环数、条件以及缓冲液等。 DNA样本的文库制备，不管是用于WGS、WES、ChIP-seq还是PCR扩增子，一般都遵循相同的流程。总的来说，对于任何应用，目标都是使文库尽可能的复杂。 DNA建库试剂盒目前有多个品牌。竞争也促使价格迅速下降以及质量的提升。这些试剂盒能够处理DNA起始量从ug到pg多个级别。但是，我们需要记住一点，起始量大可以降低扩增循环数，因此文库复杂度更高。除Nextera外，文库制备步骤通常包括：1）片段化，2）末端修复，3）5端磷酸化，4）3端加A，5）接头连接，6）几个cycle的PCR以富集加了接头的产物。Ion Torrent流程的主要不同在于平末端连接不同的接头序列。 起始DNA被片段化后，会使用3个酶的混合物（ T4 多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶以及 Klenow大片段 ）进行末端补平和5端磷酸化。3端加A尾利用Taq聚合酶或Klenow片段（exo-）。Taq在加A尾上更有效率，但Klenow在不能用加热方法时，比如mate-pair文库可以适用。在接头连接过程中，最适的接头：片段比例大约为10：1，以摩尔数为单位。接头太多会形成难以分离的二聚体，这些二聚体在随后的扩增中会占主导地位。末端修复和加A反应后，磁珠或胶回收的方法都适用，但连接反应后我们发现，磁珠的方法能够更有效地去除接头二聚体。 为了便于多样本混合，可以对不同样本使用不同barcode的接头。另外barcode也可以由PCR扩增过程经不同barcode的引物加入。可以从多个供货商购买高质量的带barcode的接头和PCR引物。 目前DNA文库构建的所有组分，从接头到酶，都有详细的文字说明，可以组装成自制的文库制备试剂盒。 另一种方法是Nextera方法，利用转座酶对DNA进行随机打断，并在一个单管中对其加标签（又称tagmentation）。这种工程化的酶有两个功能，对DNA进行片段化，并将特定的接头加到片段化DNA的两端。 这些接头序列在接下来的PCR过程中用于扩增插入片段。PCR反应会加入barcode。这个制备过程相对传统方法的优势在于，将片段化、末端修复和接头连接合并成一步。这种方法相对于机械片段化的方法来说，对DNA的起始量更加敏感。为了实现在合适的距离进行片段化，转座酶相对样本的比例非常关键。因为片段大小依赖于反应效率，所有反应的参数，比如，温度和反应时间，都非常关键，需要严格控制。 一些课题组发表了对单个细胞基因组进行测序的结果。现在的策略采用多重链置换（MDA）对整个基因组进行扩增。MDA主要是利用了随机引物和phi29，一种高度进行性的链置换聚合酶。虽然这个技术能够产生足够的量用于测序文库的构建 ，但它的一个问题在于非线性扩增造成的大量的bias。最近有研究认为通过加入一个半线性的预扩增步骤能够减少bias。Fluidgm基于单细胞分离和微流控技术用于单细胞文库制备，每次运行可获得最多96个单细胞。 对于RNA文库，我们需要根据测序目的来进行文库构建方案的筛选。如果目的是发现复杂全面的转录事件，文库需要覆盖整个转录组，包括，编码、非编码、反义以及基因间RNA，而且需要尽可能的完整。但是，很多场合，目的只是研究能够翻译成蛋白质的编码mRNA的转录本。另一种情况只涉及small RNA，大多miRNA，也包括snoRNA，piRNA，snRNA以及tRNA。虽然，我们想要详述RNA测序文库的原则，但无法一一列举。感兴趣的读者可以自行研究。 NGS应用到RNA-seq最初成功的例子之一是 miRNA 。制备miRNA测序文库非常简单，通常是一步反应。事实上，miRNA在5端有天然磷酸修饰，这允许连接酶选择性地靶向miRNA。 illumina步骤的第一步，3端阻断，5端腺苷化的DNA接头通过截断的T4 RNA连接酶2被连接至RNA样本。这个酶经过修饰，能够对3端接头底物进行腺苷化。结果是，其他RNA片段在这个反应中不会连接在一起。只有腺苷化的寡核苷酸可以连接到游离的RNA的3端末端。由于接头3端是阻断的，无法进行自连。下一步，在ATP和RNA连接酶1的作用下加入5端RNA接头。 只有5端磷酸化的RNA分子能够在连接反应中作为有效的底物。第二步连接反应后，逆转录引物杂交到3端接头，开始启动RT-PCR 扩增（一般是12个循环）。由于小且片段大小可预测（120bp 接头序列加上20-30bp miRNA插入片段），文库或多个barcode混合样本通常一起进行切胶回收。 由于存在接头二聚体以及非miRNA的连接（tRNA和snoRNA），切胶回收非常重要。这种文库制备方法导致文库的测序具有方向性，总是从原始RNA的5端到3端。Ion Torrent 的miRNA测序原则也是相似的。Ion Torrent利用两种不同的接头连接至miRNA 3端和5端，随后进行RT-PCR。一般，文库构建步骤可以将任何RNA材料构建成有方向性的RNA-seq文库。 miRNA文库的一大限制在于RNA的起始量低（<200ng 总RNA）；短接头二聚体在RT-PCR反应中与目的产物、接头和miRNA进行竞争。 当存在太多二聚体时，他们会在片段筛选时充斥整个凝胶，污染产物条带。为了尽量避免这种情况，很多试剂盒采取了各种方式来避免二聚体的形成。 对于mRNA测序文库，方法主要包括利用随机引物或oligo-dT引物进行cDNA合成或在mRNA片段上加接头后进行某种形式的扩增。mRNA可以由随机引物或oligo-dT起始产生一链cDNA。如果使用随机引物，必须先将rRNA去除或减少。rRNA可以通过寡核苷酸探针为基础的试剂，比如，Ribo-Zero和RiboMinus，进行去除。另外，polyA RNA可以通过oligo-dT磁珠进行正向筛选。 通常希望文库能够留有原始目的RNA的链的 方向性 。比如，逆转录产生的反义RNA在调节基因表达中发挥作用。实际上，lncRNA分析依赖于定向RNA测序。制备定向RNA-seq文库的方法有几种。逻辑时，进行cDNA反应，将两条链中的1条有选择地移除，通过，在第二条cDNA链合成时加入dUTP。尿嘧啶包含的链可以被响应的酶消化掉或者扩增的时候用不识别尿嘧啶的聚合酶。 另外，加入actinomycin D可以减少一链cDNA合成过程中假义链的合成。 另一种杂交方法利用随机或锚定oligo-dT引物的接头序列起始第一链cDNA的合成。接下来，在模板转换步骤，3端接头序列添加到cDNA分子。这种方法的明显优势在于第一链cDNA分子可以利用3端的唯一序列标签无需进行第二链合成，直接通过PCR进行扩增。5端唯一序列标签在第一链合成过程中引入。 用于cDNA合成的引物设计对于RNA-seq文库非常重要。比如，rRNA序列可以通过设计靶向rRNA的引物（不用于进一步扩增）进行去除。 NuGEN Ovation RNA-seq结合SPIA（ Single primer isothermal amplification ）核酸扩增技术以及用于第一链cDNA合成的引物来抑制rRNA的扩增。另一种方法中利用4096种六聚体来抑制rRNA序列（识别并消除完美匹配）。749种六聚体保留并用于起始第一链cDNA合成反应。结果是，rRNA reads从78%降至13%。还有一种方法叫， DP-seq ，利用44个7聚体引物扩增了大部分的小鼠转录本。这种引物设计选择性地抑制了高表达转录本的扩增，包括rRNA，并提供了胚胎发育模型中低丰度转录本的估计。 最近发表了一些制备单细胞RNA文库的方法。一种方法利用第一链cDNA的多聚核苷酸尾巴，结合模板转换反应。结果是第一链cDNA产物可以通过通用PCR引物进行扩增。如图，Figure4B所示，且已并入是试剂盒中。另一种方法叫 CEL-Seq ，在cDNA 5端合成T7启动子序列，随后在体外转录过程中进行现象扩增。 单个细胞的总RNA一般为10pg，但polyA RNA只有0.1pg。因此，这些方法某种程度上需要全转录本扩增以产生足够的建库所需起始量。这样大量扩增的弊端就在于大量技术噪音的产生，这一问题目前尚未解决。 （？） 最后，核糖体印记能够反应翻译的任何节点上细胞mRNA转录本的混合。这种方法涉及到利用RNase对细胞进行裂解，只留下被核小体保护的30个核苷酸的区域。核小体经蔗糖梯度密度离心进行纯化，接着mRNA被从核小体中提取出来。另一种新的RNA测序的应用是 SHAPE-Seq，通过酰化试剂来偏向性地修饰未配对的碱基以探索RNA的二级结构。通过对修饰的RNA和未修饰的对照进行逆转录，对得到的cDNA片段进行测序，比较后能够揭示核苷酸水平的碱基配对信息。

Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸）,由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成.SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默.RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解,从而导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象.RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性.siRNA在RNA沉默通路中起中心作用,是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素.siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必需的因子.siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成.由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候,Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶,具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域,III型RNA酶活性区域,dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合,形成酶-dsRNA复合体.Dicer 切割后形成siRNA,然后,在ATP的参与下,细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白.siRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA.其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制.siRNA识别靶序列是有高度特异性的,因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生,所以这些中央的碱基位点就显得极为重要,一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应.RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性,所以是基因功能研究的重要工具.大多数药物属于标靶基因（或疾病基因）的抑制剂,因此RNAi 模拟了药物的作用,这功能丢失（LOF)的研究方法比传统的功能获得（GOF)方法更具优势.因此, RNAi 在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具.同时,那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物.在药物标靶发现和确认方面,RNAi技术已获得了广泛的应用.生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞,然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因.如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因.一旦所发现的基因属于可用药的靶标（如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外）,就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选.此外,被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认.在疾病治疗方面,双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗,如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等.在抗病毒治疗方面,帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法.肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果.

见附件

机械原理第八版课后练习答案(西工大版).doc搞定望及时采纳：点击我的回答右边的"采纳答案"按钮仍有问题再追问

九年级上语文所有古诗及翻译.txt百度文库文档已经下载上传在附件，望及时采纳：点击我的回答内容右侧的"采纳答案"按钮

（ F ）1、会计的职能只有两个，即核算职能和监督职能。（ T ）2、会计要素中既有反映财务状况的要素，也有反映经营成果的要素。（ T ）3、一项经济业务的发生引起负债的增加和所有者权益的减少，会计基本等式的平衡关系不受其影响。（ F ）4、在借贷记账法下，账户的借方登记增加数，贷方登记减少数。（ F ）5、所有账户都是根据会计科目开设的，包括总账账户和明细账户。（ T ）6、企业生产用固定资产计提折旧时应直接记入“制造费用”账户。（ T ）7、对于资产负债结算账户，可以根据其余额的方向来判断其性质。（ F ）8、属于所有者权益类的所有账户，它们的用途和结构都是相同的。（ T）9、收款凭证和付款凭证不仅是记账的依据，而且也是出纳员办理收款、付款业务的根据。（ T ）10、除结账和更正错误的记账凭证可以不附原始凭证外，其他记账凭证必须附有原始凭证，并注明所附原始 凭证的张数。（ T ）11、“生产成本”账户按用途和结构分类，应属于盘存或成本计算账户。（ F ）12、会计人员在填制记账凭证时，误将 9 800 写为 8 900，并已登记入账。月终结账前发现错误，更正时应采 用划线更正法。（ T ）13、无论采用永续盘存制还是实地盘存制，都需要对财产物资进行清查，都可以采用实地盘点的方法。（ F ）14、在任何情况下，应收账款项目都是根据应收账款总账的期末余额填制。（ F ）15、采用科目汇总表账务处理程序，总分类账、明细分类账和日记账都应根据科目汇总表登记。二、单项选择题（共 15 分，每小题 1 分）（ b ）1、下列项目中，引起负债有增有减的经济业务是 。 A、以银行存款偿还银行借款 B、用银行借款抵付应付账款 C、以银行存款上交税金 D、收到外商捐赠的设备（ A ）2、收到某单位预付货款存入银行，所引起的变动为 。 A、一项资产增加，一项负债增加 B、一项资产减少，一项负债减少 C、一项资产增加，一项所有者权益增加 D、一项资产减少，一项所有者权益减少（ B ）3、某企业销售产品一批，部分货款收存银行，部分货款对方暂欠，该企业应填制 。 A、收款凭证和付款凭证 B、收款凭证和转账凭证 C、付款凭证和转账凭证 D、两张转账凭证（ c ）4、下列不能作为会计核算依据的是 。 A、领料单 B、发货票 C、经济合同 D、入库单（ d ）5、如果发现记账凭证所用的科目正确，只是所填金额大于应填金额，并已登记入账，应采用 更正。 A、划线更正法 B、红字更正法 C、平行登记法 D、补充登记法（ B ）6、在下列账簿中，需要进行日清月结的账簿是 。 A、备查账簿 B、现金日记账 C、总分类账 D、明细分类账（ c ）7、财产清查中，如财产的盘亏是由于保管人员失职所造成的，则应计入 。 A、管理费用 B、生产成本 C、其他应收款 D、营业外支出（ b ）8、在记账无误的情况下，银行对账单与企业银行存款日记账账面余额不一致是因 造成的。 A、应付账款 B、未达账项 C、坏账损失 D、应收账款（ B ）9、下列 属于外来原始凭证。 2 A、领料单 B、购货发票 C、收料单 D、工资结算汇总表（ D ）10、活页式账簿和卡片式账簿主要适用于 。 A、特种日记账 B、普通日记账 C、总分类账簿 D、明细分类账簿（ B “固定资产”为 100 万元， ）11、如果企业月末资产负债表中， “累计折旧”为 40 万元，则企业“固定资产净值 数”应填列 。 A、100 万元 B、60 万元 C、140 万元 D、160 万元（ c ）12、编制利润表主要是依据 。 A、资产、负债及所有者类各账户的本期发生额 B、损益类各账户的期末余额 C、损益类各账户的本期发生额 D、资产、负债及所有者权益类各账户的期末余额（ A ）13、 是一种最基本的账务处理程序，也是其他账务处理程序的基础。 A、记账凭证账务处理程序 C、科目汇总表账务处理程序 B、汇总记账凭证账务处理程序 D、日记总账账务处理程序（ c ）14、为了反映和监督企业销售商品和提供劳务所实现的收入以及因销售商品而与购买单位之间发生的货款结 算业务，应设置的账户是 。 “主营业务收入”账户 A、 “应收账款”账户 B、 C、“营业外收入”账户 “应收票据”账户 D、（ c）15、一个企业的资产总额与权益总额 。 A、可能相等 B、有时相等 C、必然相等 D、只有在期末时相等三、多项选择题（共 15 分，每小题 1 分）（ ABD）1、会计的方法实际上是 。 A、会计核算的方法 B、会计分析的方法 C、会计算账的方法 D、会计检查的方法（ ACD ）2、下列项目中，属于企业流动资产的有 。 A、银行存款 B、预收账款 C、应收账款 D、库存商品（ ABC ）3、在进行试算平衡时，下列哪些错误不会影响借贷双方的平衡关系 。 A、漏记某项经济业务 B、某项经济业务记错有关账户 C、重记某项经济业务 D、某个账户颠倒了记账方向（ABC ）4、总分类账户和明细分类账户的平行登记是指 。 A、登记会计期间一致 B、登记方向相同 C、登记金额相等 D、登记数量相等（ABCD）5、下列账户可能会与“本年利润”账户借方发生对应关系的是 。 A、主营业务成本 B、销售费用 C、管理费用 D、营业税金与附加（ ABC ）6、作为原始凭证应具备的基本内容是 。 A、经济业务内容 B、凭证的名称、填制日期及有关责任人的签章 1、ABD 2、ACD 3、ABC 4、ABC 5、ABCD 6、ABC 8、AC 9、BD 10、ABC 11、ABCD 12、ABD 13、BCD 14、AB 15、ABC C、接受凭证单位的名称 D、会计分录（ ）8、日记账与总账的核对，主要包括 。 A、现金日记账与库存现金总账之间的核对 3 B、现金日记账与其他总账之间的核对 C、银行存款日记账与银行存款总账之间的核对 D、银行存款日记账与其他总账之间的核对（ ）9、下列能作为编制财务报表的直接来源的是 。 A、原始凭证 B、总账 C、记账凭证 D、明细账（ ）10、外购材料取得的成本包括 。 A、买价 B、定额内的途中损耗 C、运杂费 D、非正常损耗（ ）11、企业在组织会计核算时，应遵循的会计假设包括 。 A、会计主体假设 B、持续经营假设 C、会计分期假设 D、货币计量假设（ ）12、制造企业是产品的生产单位，其完整的生产经营过程由 所构成。 A、供应过程 B、生产过程 C、买卖过程 D、销售过程（ ）13、下列会计分录中属于复合会计分录的是 。 A、一借一贷的会计分录 B、一借多贷的会计分录 C、一贷多借的会计分录 D、多借多贷的会计分录（ ）14、科目汇总表能够 。 A、起到试算平衡的作用 B、反映各科目的借、贷方本期发生额 C、反映各科目的期末余额 D、反映各科目之间的对应关系（ ）15、产品生产费用包括 。 A、人工费用 B、间接费用 C、材料费用 D、成本费用四、实务题（55 分） （共 40 分，每小题（一）某公司某年 12 月份发生经济业务如下。要求编制会计分录，如有计算，要求写出计算过程。 2 分）1、5 日，向阳光公司购入 A 材料 38 000 元，增值税额为 6 460 元，款已预付。材料验收入库。1、借：原材料—A 材料 38 000 应交税费－应交增值税（进项税额） 6 460 贷：预付账款 44 4602、10 日，公司销售甲产品价税款合计 292 500 元，已收款。2、借：银行存款 292 500 贷：主营业务收入－甲产品 250 000 应交税费—应交增值税（销项税额） 42 5003、10 日，从银行提取现金 30 000 元直接发放工资。 （1）借：库存现金3、 30 000 贷：银行存款 30 000 （2）借：应付职工薪酬 30 000 贷：库存现金 30 0004、11 日，开出现金支票购买厂部办公用品 780 元。4、借：管理费用 780 贷：银行存款 7805、16 日，提取本月固定资产折旧，其中车间 8 100 元，厂部 3 200 元。5、借：制造费用 8 100 管理费用 3 200 4 贷：累计折旧 11 3006、18 日，公司购买一台车床，买价 240 000 元，增值税 40 800 元，运杂费 1 000 元，款项暂未支付，设备交付使用。6、借：固定资产－车床 281 800 贷：应付账款 281 8007、30 日，分配工资费用，其中甲产品工人工资 12 000 元，乙产品工人工资 8 000 元，车间管理人员工资 6 000 元，行 政管理人员工资 4 000 元。7、借：生产成本—甲产品 12 000 —乙产品 8 000 制造费用 6 000 管理费用 4 000 贷：应付职工薪酬 30 0008、30 日，按 14的比例计提本月职工福利费。8、借：生产成本－甲产品 1 680 －乙产品 1 120 制造费用 840 管理费用 560 贷：应付职工薪酬 4 2009、30 日，经批准将资本公积金 60 000 元转增资本。9、借：资本公积 60 000 贷：实收资本 60 00010、31 日，汇总本月材料发出情况如下（A 材料 7 600 元，B 材料 12 300 元） 甲产品生产领用 6 000 元 乙产品生产领用 5 000 元 车间一般耗用 5 900 元 行政管理部门耗用 3 000 元 合计：19 900 元10、借：生产成本－甲产品 6 000 －乙产品 5 000 制造费用 5 900 管理费用 3 000 贷：原材料－A 材料 7 600 －B 材料 12 300 （甲产品 6 000 工时，乙产品 4 000 工时）11、31 日，按本月生产工时比例，将发生的制造费用分配给甲、乙产品。11、制造费用 8 100 ＋ 6 000 5 900 20 840（元） 分配率 20 840 ÷（6 000 ＋ 4 000） 2.084 （元/工时） 甲产品：6 000 × 2.084 12 504（元） 乙产品：4 000 × 2.084 8 336 （元） 借：生产成本－甲产品 12 504 －乙产品 8 336 贷：制造费用 20 84012、31 日，甲、乙产品均全部完工入库，结转其实际生产成本。12、借：库存商品－甲产品 32 184 －乙产品 22 456 贷：生产成本－甲产品 32 184 －乙产品 22 45613、31 日，结转本月已销甲产品的销售成本 138 000 元。 513、借：主营业务成本－甲产品 138 000 贷：库存商品－甲产品 138 00014、该企业该月的库存现金清查中，发现盘亏 300 元。经查明属于出纳员的保管责任。14、（1） 借: 待处理财产损溢 300 贷:库存现金 300 （2） 借: 其他应收款 300 贷: 待处理财产损溢 30015、结转本月损益类账户。其中“主营业务收入”为 300 000 元， “主营业务成本”为 138 000 “投资收益”为 2 000 元， “管理费用”为 11 540 元， 元， “销售费用”为 1 000 元， “营业外支出”为 5 400 元。 “财务费用”为 2 500 元，15、（1）借：主营业务收入 300 000 投资收益 2 000 贷：本年利润 302 000 （2）借：本年利润 158 440 贷：主营业务成本 138 000 管理费用 11 540 销售费用 1 000 财务费用 2 500 营业外支出 5 40016、假设“本年利润”12 月的期初余额为 12 000 元，按全年利润总额的 33计算应交的所得税并做相应的账务处理。16、全年利润 12 000 ＋（302 000－158 440） 155 560（元） 所得税 155 560 × 33 51 334.80（元） 借：所得税费用 51 334.80 贷：应交税费－应交所得税 51 334.8017、结转所得税入“本年利润”账户。17、借：本年利润 51 334.80 贷：所得税费用 51 334.8018、将“本年利润”账户余额转入“利润分配”账户中。8、净利润 155 560 － 51 334.80 104 225.20（元） 借：本年利润 104 225.20 贷：利润分配—未分配利润 104 225.2019、按全年实现净利润的 10计算提取盈余公积金并做相应的账务处理。19、借：利润分配－提取盈余公积金 10 422.52 贷：盈余公积 10 422.5220、将“利润分配”其它明细账户转入“未分配利润”明细账户，并计算分配后的未分配利润。20、借：利润分配—未分配利润 10 422.52 贷：利润分配—提取盈余公积 10 422.52 分配后的未分配利润 104 225.20 - 10 422.52 93 802.68（二）某企业由于编制记账凭证或过账过程中存在某些错误，月底试算平衡表未能平衡。经核查有关记录，发现有下 列错误：1、收回货款 7 600 元存入银行，记账凭证科目正确，但金额误记为 6 700 元。2、以存款偿付前欠购货款 5 200 元。过账时，应付账款误记为贷方 5 000 元记账凭证正确。 6 （共 6 分，每小题 3 分） 要求：用恰当的错账更正法改正上述错误。（三）某企业采用实际成本进行材料日常核算。期末盘点存货时，查出价值 30 000 元的甲材料发生毁损，其进项税额 为 5 100 元。经调查后，认定该批材料的毁损与材料性能、仓库条件及保管员责任均有关系，按规定由保管员赔 （共 9 分，每笔会计分录 偿 3 000 元，价值 500 元的残料已入库。要求：请编制相应的会计分录。答案及评分标准一、判断题（共 15 分，每小题 1 分） 1、F 2、T 3、T 4、F 5、F 6、T 7、T 8、F 9、T 10、T 11、T 12、F 13、T 14、F 15、F ）三、多项选择题（共 15 分，每小题 1 分。其中，如答对每小题一半以上的答案，则得 0.5 分。 1、ABD 2、ACD 3、ABC 4、ABC 5、ABCD 6、ABC 7、ABCD 8、AC 9、BD 10、ABC 11、ABCD 12、ABD 13、BCD 14、AB 15、ABC四、实务题（55 分，评分标准详见试题） （共 40 分，每小题 2 分）（一）1、借：原材料—A 材料 38 000 应交税费－应交增值税（进项税额） 6 460 贷：预付账款 44 4602、借：银行存款 292 500 贷：主营业务收入－甲产品 250 000 应交税费—应交增值税（销项税额） 42 500 （1）借：库存现金3、 30 000 贷：银行存款 30 000 （2）借：应付职工薪酬 30 000 贷：库存现金 30 0004、借：管理费用 780 贷：银行存款 7805、借：制造费用 8 100 管理费用 3 200 贷：累计折旧 11 3006、借：固定资产－车床 281 800 贷：应付账款 281 8007、借：生产成本—甲产品 12 000 —乙产品 8 000 制造费用 6 000 管理费用 4 000 7 贷：应付职工薪酬 30 0008、借：生产成本－甲产品 1 680 －乙产品 1 120 制造费用 840 管理费用 560 贷：应付职工薪酬 4 2009、借：资本公积 60 000 贷：实收资本 60 00010、借：生产成本－甲产品 6 000 －乙产品 5 000 制造费用 5 900 管理费用 3 000 贷：原材料－A 材料 7 600 －B 材料 12 30011、制造费用 8 100 ＋ 6 000 5 900 20 840（元） 分配率 20 840 ÷（6 000 ＋ 4 000） 2.084 （元/工时） 甲产品：6 000 × 2.084 12 504（元） 乙产品：4 000 × 2.084 8 336 （元） 借：生产成本－甲产品 12 504 －乙产品 8 336 贷：制造费用 20 84012、借：库存商品－甲产品 32 184 －乙产品 22 456 贷：生产成本－甲产品.

urely, when but to be alive was in itself a boon;

7407 驱动门 　　1N914 二极管 　　74Ls00 与非门 　　74LS04 非门 　　74LS08 与门 　　74LS390 TTL 双十进制计数器 　　7SEG 4针BCD-LED 输出从0-9 对应于4根线的BCD码 　　7SEG 3-8译码器电路　　BCD-7SEG转换电路 　　ALTERNATOR 交流发电机 　　AMMETER-MILLI mA安培计 　　AND 与门 　　BATTERY 电池/电池组 　　BUS 总线 　　CAP 电容 　　CAPACITOR 电容器 　　CLOCK 时钟信号源 　　CRYSTAL 晶振 　　D-FLIPFLOP D触发器 　　FUSE 保险丝 　　GROUND 地 　　LAMP 灯 　　LED-RED 红色发光二极管 　　LM016L 2行16列液晶 可显示2行16列英文字符，有8位数据总线D0-D7，RS，R/W，EN三个控制端口（共14线），工作电压为5V。没背光，和常用的1602B功能和引脚一样（除了调背光的二个线脚） 　　LOGIC ANALYSER 逻辑分析器 　　LOGICPROBE 逻辑探针 　　LOGICPROBE[BIG] 逻辑探针 用来显示连接位置的逻辑状态 　　LOGICSTATE 逻辑状态 用鼠标点击,可改变该方框连接位置的逻辑状态 　　LOGICTOGGLE 逻辑触发 　　MASTERSWITCH 按钮 手动闭合,立即自动打开 　　MOTOR 马达 　　OR 或门 　　POT-LIN 三引线可变电阻器 　　POWER 电源 　　RES 电阻 　　RESISTOR 电阻器 　　SWITCH 按钮 手动按一下一个状态 　　SWITCH-SPDT 二选通一按钮 　　VOLTMETER 伏特计 　　VOLTMETER-MILLI mV伏特计 　　VTERM 串行口终端 　　Electromechanical 电机 　　Inductors 变压器 　　Laplace Primitives 拉普拉斯变换 　　Memory Ics 　　Microprocessor Ics 　　Miscellaneous 各种器件 AERIAL-天线；ATAHDD；ATMEGA64；BATTERY；CELL；CRYSTAL-晶振；FUSE；METER-仪表； 　　Modelling Primitives 各种仿真器件 是典型的基本元器模拟，不表示具体型号，只用于仿真，没有PCB 　　Optoelectronics 各种发光器件 发光二极管，LED，液晶等等 　　PLDs & FPGAs 　　Resistors 各种电阻 　　Simulator Primitives 常用的器件 　　Speakers & Sounders 　　Switches & Relays 开关，继电器，键盘 　　Switching Devices 晶阊管 　　Transistors 晶体管（三极管，场效应管） 　　TTL 74 series　　TTL 74ALS series 　　TTL 74AS series 　　TTL 74F series 　　TTL 74HC series 　　TTL 74HCT series 　　TTL 74LS series 　　TTL 74S series 　　Analog Ics 模拟电路集成芯片 　　Capacitors 电容集合 　　CMOS 4000 series 　　Connectors 排座，排插 　　Data Converters ADC,DAC 　　Debugging Tools 调试工具 　　ECL 10000 Series 各种常用集成电路 　　protues常用器件2007-08-08 14:18分分立元件库元件名称及中英对照 　　AND 与门 　　ANTENNA 天线 　　BATTERY 直流电源 　　BELL 铃,钟 　　BVC 同轴电缆接插件 　　BRIDEG 1 整流桥(二极管) 　　BRIDEG 2 整流桥(集成块) 　　BUFFER 缓冲器 　　BUZZER 蜂鸣器 　　CAP 电容 　　CAPACITOR 电容 　　CAPACITOR POL 有极性电容 　　CAPVAR 可调电容 　　CIRCUIT BREAKER 熔断丝 　　COAX 同轴电缆 　　CON 插口 　　CRYSTAL 晶体整荡器 　　DB 并行插口 　　DIODE 二极管 　　DIODE SCHOTTKY 稳压二极管 　　DIODE VARACTOR 变容二极管 　　DPY_3-SEG 3段LED 　　DPY_7-SEG 7段LED 　　DPY_7-SEG_DP 7段LED(带小数点) 　　ELECTRO 电解电容 　　FUSE 熔断器 　　INDUCTOR 电感 　　INDUCTOR IRON 带铁芯电感 　　INDUCTOR3 可调电感 　　JFET N N沟道场效应管 　　JFET P P沟道场效应管 　　LAMP 灯泡 　　LAMP NEDN 起辉器 　　LED 发光二极管 　　METER 仪表 　　MICROPHONE 麦克风 　　MOSFET MOS管 　　MOTOR AC 交流电机 　　MOTOR SERVO 伺服电机 　　NAND 与非门 　　NOR 或非门 　　NOT 非门 　　NPN NPN三极管 　　NPN-PHOTO 感光三极管 　　OPAMP 运放 　　OR 或门 　　PHOTO 感光二极管 　　PNP 三极管 　　NPN DAR NPN三极管 　　PNP DAR PNP三极管 　　POT 滑线变阻器 　　PELAY-DPDT 双刀双掷继电器 　　RES1.2 电阻 　　RES3.4 可变电阻 　　RESISTOR BRIDGE ? 桥式电阻 　　RESPACK ? 电阻 　　SCR 晶闸管 　　PLUG ? 插头 　　PLUG AC FEMALE 三相交流插头 　　SOCKET ? 插座 　　SOURCE CURRENT 电流源 　　SOURCE VOLTAGE 电压源　　SPEAKER 扬声器 　　SW ? 开关 　　SW-DPDY ? 双刀双掷开关 　　SW-SPST ? 单刀单掷开关 　　SW-PB 按钮 　　THERMISTOR 电热调节器 　　TRANS1 变压器 　　TRANS2 可调变压器 　　TRIAC ? 三端双向可控硅 　　TRIODE ? 三极真空管 　　VARISTOR 变阻器 　　ZENER ? 齐纳二极管 　　DPY_7-SEG_DP 数码管 　　SW-PB 开关

不需要这么麻烦，sf的用户认证主要是通过.SFCommunity这个cookie来实现的，可以用浏览器登陆后把cookie加到请求头里.或者下载一个现成的

大型的也就你刚才说的那些了，还有就是爱问共享资料（新浪的）

付费内容限时免费查看一、筑龙网这是目前最好的文库类网站，但主要建筑施工设计、建材为主，非常强大，专业性非常高，质量也好。要是您从事建筑施工和建筑设计行业，都可以到这里找到图纸和相关技术资料。给力!二、百度文库文库文章数量庞大，原来是一个找资料不错的选择，最近一两年，发现不对头了。要想找到一篇自己想要的文章，既使花钱的也行，基本上找不着了，比登天还难。一是别看数量巨大，文章质量参差不齐，鱼目混珠;二是，搜索也不能精准，根本搜索不到什么?每屏前几个篇基本上都是推广和广告，非常烦人。现在百度也不知怎么了?三是打开百度文库，页面太乱，基本都被广告框了，眼睛很不舒服!三、豆丁网做的也非常好，内容综合。是一个专注于学生教育、人文、公文写作、创业指导和商业工具的文库类的网络。在这里可以看到很需求的文档。四、道客巴巴网道客巴巴内容比较精，最近新开通一个找文档的功能，非常给力，如果在网站内找不到自己所需要的文档，可以发布需求，让有这方面资料的人给你提供。就是好!这是一个专注经济、管理类的论坛类文档网站，如果你是一个搞学术研究的，可以到这里淘到非常有深度、质量高的文章。这是一个以科研论文为主题的专业文库网站，所有文均收费，但文档质量非常高，所有文档基本上机构发布的，质量和专业在国内最高。这是高校老师和科研机构工作者常去的地方，[开心]亲，希望能帮助到您哟提问[赞同]亲，咨询结束记得给个赞哟[微笑]_

当然是侵权，连文章和帖子都写着未经作者允许是不能转发的，何况你是转发人家的书到公众平台上。不过目前好像这两家都不管的，没人管就会有人发。

还有一个360doc图书馆 基本也就百度文库还行，其他的都照抄文库的资料

其实 偷偷的告诉你 新浪爱问 最好用 ╮(╯▽╰)╭

百度文库的内容要多一些，虽然这两个软件都有非常丰富的知识储备，但是百度文库的受众面更广泛一些。

百度文库是百度发布的供网友在线分享文档的平台。于2009年11月12日推出，百度文库的文档由百度用户上传，需要经过百度的审核才能发布，百度自身不编辑或修改用户上传的文档内容。网友可以在线阅读和下载这些文档。百度文库的文档包括教学资料、考试题库、专业资料、公文写作、法律文件等多个领域的资料。是目前搜索资料最全的文库。爱学术旨在构建一个专业的学术文献交流分享平台。我们将精心挑选有影响力,有特色的机构和学者,为广大用户提高有价值的可利用的学术文献.同时,我们也会帮助认证机构展示擅长领域给广大用户,提升机构的影响力,活跃用户.我们也会竭力提供一个良好学术生态圈,让用户分享和交流自己的学术成果,发现更有价值的学术科研信息,获得分享和交流的乐趣和满足感。道客巴巴 是一个专注于电子文档的在线分享平台，用户在此平台上不但可以自由交换文档，还可以分享最新的行业资讯。道客巴巴制定了严格的文档审核策略，以保证文档来源的合法性，对有可能引起知识产权纠纷的文档，网站不予收录。同时，道客巴巴采用了行业领先的文档加密及保护技术，最大程度上保证用户上传的文档的版权不被非法侵犯。豆丁网 创立于2007年，是全球最大的中文社会化阅读平台，为用户提供一切有价值的可阅读之物。截至2010年，豆丁网已经成功跻身互联网全球500强，成为提供垂直服务的优秀网站之一。网站拥有分类广泛的实用文档、出版物、行业研究报告、以及数千位行业名人贡献的专业文件，各类读物总数超过四亿。

这要什么抗衡，有人愿意到百度文库下载文档，自然也有人愿意到豆丁、道客巴巴、爱学术这类平台下载文档。

皖西学院生物与制药工程学院（制药设备与工程设计）课程设计班 姓 学级 名 号制药0801 胡先敏 2008010573 谷仿丽指导教师二○一一 年六月十五日皖西学院生物与制药工程学院 皖西学院生物与制药工程学院1制药设备与工程设计课程设计任务书设计题目 班 级 年产 1 亿支抗病毒口服液的工厂设计 制药 0801 学 生 指导教师 胡先敏 谷仿丽1、生产能力： 年产 1 亿支/年 设 计 的 目 2、工艺要求： 选择最佳工艺流程 的和要求 3、质量要求： 符合 GMP1、工艺流程的设计和说明 设 计 的 2、分别绘出主体设备图/带控制点的工艺流程图/车间平面图/车 任务 间立面图/工厂平面图设计工作 计划与进 度安排1、星期一：收集查阅相关文献资料 2、星期二：初步确定工艺方案 3、星期三：物料衡算、主要设备选型 4、星期四：最终确定工艺方案 5、星期五：分别绘出主体设备图/带控制点的工艺流程图/车间平 面图/车间立面图/工厂平面图主要参考 文献资料朱宏吉,张明贤．制药设备与工程设计．化学工业出版社 张珩.制药工程工艺设计．化学工业出版社 万方数据库 国家知识产权局网站 中国化工机械网 中国机械设备网 中国制药装备协会 中华制药机械网2皖西学院生物与制药工程学院 皖西学院生物与制药工程学院课 程 设 计 说 明 书题 课目： 程：年产 1 亿支抗病毒口服液的工厂设计制药设备与工程设计 生物与制药工程系 制药工程 0801 胡先敏 2008010573 谷仿丽 2011.06.30系 （部） ： 专 班 业： 级：学生姓名： 学 号：指导教师： 完成日期：3课 程 设 计 简 介由中药制剂制成的抗病毒口服液具有清热解毒、凉血之功能，保 护细胞器，拮抗和减轻内毒素作用，有助于治疗感染性疾病，并能诱 发机体的免疫功能及抗病能力，具有显著的抗病毒、抗菌作用，作用 迅速。 临床试验证明， 该口服液的功效是可信的， 因其投用经济简便， 给药途径为口服，无创伤性，且无明显副作用，及早使用该口服液有 利于缩短治疗时间，减少病情变化，所以，该口服液是一种值得推广 的治疗呼吸道感染的良药， 同时也是一种很有开发前景的中药复方制 剂口服液。据调查显示，现仍有广阔的市场空间。且原材料属于常见 药材，取材方便，价格便宜。 据以上所述，决定。在六安市裕安区月亮岛西区建立年产 1 亿支抗病毒口服液的工厂。4课 程 设 计 说 明 书 目 录一、设计资料1. 设计产品简介 …………………………………………… 7 2. 建设规模与处理目标 …………………………………… 9二、工艺设计和说明1.工艺流程图 ………………………………………………… 9 2.生产原料 …………………………………………………… 10 3.工艺流程设计原则 ………………………………………… 10 4.生产工艺的简介 …………………………………………… 10 5.工艺方案的分析 …………………………………………… 10 6.生产工艺的确定 …………………………………………… 11三、物料衡算1.主料总物料衡算 …………………………………………… 12 2.辅料物料衡算 ……………………………………………… 12四、设备的选型1.设备的选型 ………………………………………………… 13五、能量横算1.浸取设备的能量衡算 ……………………………………… 1352.其他主要设备的能量衡算 ………………………………… 14六、工厂总体设计及选图1.厂址的选择 ………………………………………………… 14 2.厂房总体布置 ……………………………………………… 15 3.工厂的总体平面设计 ……………………………………… 15 4.生产车间设计及布置原则 ………………………………… 16七、废液的处理及其防治1.废液的处理方法 …………………………………………… 17八、参考文献 ……………………………………………… 186制药设备与工程设计设计说明书 一、设计资料1. 设计产品的简介抗病毒口服液简介 抗病毒口服液 简介以西汉名医张仲景所著《伤寒论》为基础，选自东汉名医张仲景所著 《伤寒论》，精选明方,采用地道药材，10 万级净化，低温萃取工艺，有效 成分倍增，口感好。清热祛湿，凉血解毒。主治流感、感冒，内含多种抗 病毒成份，有效抑制病毒，快速吸收，快速起效，是治疗和预防流感，感 冒，手足口病，上呼吸道感染，腮腺炎等各种病毒感染的一线用药！ 研究表明，超过 90%的感冒是由病毒引起的。辅仁抗病毒口服液内含多 种抗病毒成份，有效抑制病毒，快速吸收，快速起效！疗效优于其他同类 产品。 本品以板蓝根、石膏、芦根、生地黄、郁金、知母、石菖蒲、广藿香、 连翘。 辅料为蜂蜜、蔗糖、羟莘甲酯、羟苯乙脂。亳州有大量的药材种植， 取材简单。抗病毒口服液的优越性 西药治疗流感、 西药治疗流感 、 感冒的弊端和危害A 治标不治本——西药对于流感、感冒只能缓解症状，不能从根本上 治疗感冒。 B 抗生素滥用——西医对流感、感冒的治疗，存在严重的抗生素滥用 现象，造成“超级病毒”等耐药菌的出现，且容易造成人体菌体失调。 C 毒副作用大——西药对人体的肝肾功能均有不同程度的损害，毒副 作用大。 D 易反弹——西药治疗流感、感冒，症状易反复。7中药防治流感、 中药防治流感 、 感冒的优越性A 经典方剂，疗效显著——辅仁抗病毒口服液组方选自东汉名医张仲 景所著《伤寒论》，有着 1000 多年的成功经验，是经典方剂与现代医药创 新科技的完美结合，治疗感冒疗效显著。 B 扶正祛邪，标本兼治——中医治疗原则遵循扶正祛邪，标本兼治， 既可增强机体抵抗力，又可使身体恢复健康。 C 提高免疫力——抗病毒口服液假入含有特效免疫成分的中药，填补 西药感冒成分上的空白。 D 安全无毒副——中药选材均源自天然，植物药不含刺激、有害成分。 E 无反弹——中药治疗感冒高烧，效果较安稳持久，无反弹现象。治疗流感流感病毒是一种非细胞形态微生物，病毒进入人体后，寄生在人体靶 细胞内，利用细胞代谢进行复制扩散，破坏人体机能。此时只有人体自身 的免疫细胞和免疫球蛋白可以识别健康细胞和被病毒感染的细胞，从而清 除病毒。如果人的免疫能力低下，抗体不足，流感难治就不言而喻了。辅 仁抗病毒口服液的抗病毒机理在于人体服药后，能增强人体免疫功能，通 过激活抗体，是免疫细胞和免疫球蛋白吞噬、杀死病毒，从而清除病毒， 使人体恢复健康。这就是抗病毒口服液治疗、预防感冒尤其是流感特别有 效的原因。临床有凭1、感冒初期——防：喷嚏拉响警报，提醒您病毒侵入体内。及早服用 抗病毒口服液，防止病毒蔓延。 2、感冒中期——治：在病毒高发期，传染性强。按时服用抗病毒口服 液，抗病毒，才是感冒治疗之本。 3、感冒初愈——清：此时体内仍残留病毒。坚持服用抗病毒口服液， 彻底清理病毒，防止病情反复。8疗效保证目前，在国际上，图谱作为中成药、草药提取物等含有混合物质群的 质量控制方法，已经成为医药界共识。美国 FDA（美国食品药物管理局）对 植物药的质量检测要求必须制订指纹图谱的检测标准，欧共体对草药的质 量控制也采用了指纹图谱技术。抗病毒口服液的功效抗病毒口服液内含多种抗病毒成分，药效地道强劲，能有效抑制病毒， 快速吸收，快速起效！抑制病毒的传播和蔓延。2. 建设规模与处理目标生产任务：年产 1 亿支抗病毒口服液 每年按 300 天计算，每天按 24 小时不间断生产，每两个月对设备进行一次 全面系统检修，进而保证生产的顺利进行。采用轮换班制。 日产：100 000 000 支/300≈333334 支 时产：100 000 000 支/(300*24) ≈13889 支二、工艺设计和说明 工艺设计和说明1. 工艺流程简图 工艺流程简仓库 清洗、烘 干、粉碎 提取 浓缩外包内包灌装、 灭 菌配滤入库包合物 配制92. 生产原料主料为板蓝根、石膏、芦根、生地黄、郁金、知母、石菖蒲、广藿香、 连翘。 辅料为蜂蜜、蔗糖、羟丙基-β环糊精。3.工艺流程设计原则 3.工艺流程设计原则（1） 尽可能采取先进设备，先进生产方法及成熟的科学技术成就，以保证 产品质量。 （2）就地取材、充分利用当地材料，以便获得最佳的经济效果 （3）所采用的设备效率高、降低原材料消耗及水电气消耗。以使产品的成本 降低。 （4）按 GMP 要求对药物的剂型进行工艺流程设计。 （5）药材的前处理、提取、浓缩等生产操作，按单独设立的前处理车间进行 前处理工艺流程设计。 （6）遵循三协调原则即人流物流协调、工艺流程协调清洁级别协调，正确划 分生产工艺流程中生产区域的洁净级别，按工艺流程合理布置，避免生产流程的 迂回、往返和人物流交叉等。 （7）充分预计生产故障，以便及时处理、保证生产的稳定性。4. 生产工艺的简介此次设计任务是生产抗病毒口服液。首先，对各种主料和辅料进行清洗、 烘干以及粉碎； 第二步， 按生产工艺对原料进行提取、 浓缩得到粗产品； 第三步， 加入辅料、配滤制成口服液；第四步，对产品进行灌装、灭菌；最后，对产品进 行质量检测及包装。5. 工艺方案的分析经过大量的试验及查找相关资料，最终确定了采用水溶性环糊精包含抗病 毒口服液的生产工艺。 此工艺的优点在于： 1）采用水溶性环糊精包含抗病毒口服液中挥发油的有效成分，包合率可以10达到 40%~85%、保证了产品的质量，增加了挥发油的稳定性； 2）改善了抗病毒口服液的口感，提高了产品的疗效； 3）产品的生产工艺简单，适合工业上大批量生产。6． 生产工艺的确定 具体水溶性环糊精包含抗病毒口服液的生产工艺如下： 具体水溶性环糊精包含抗病毒口服液的生产工艺如下： 水溶性环糊精包含抗病毒口服液的生产工艺如下 1.对原料进行预处理 1.对原料进行预处理取药材板蓝根 900g、石膏 400g、芦根 425g、地黄 225g、郁金 175g、知母 175g、石菖蒲 175g、广藿香 200g、连翘 325g。进行清洗、烘干级粉碎。2.对原材料进行提取 2.对原材料进行提取将按比例配制的混合后的原材料投入提取罐中，加入 8 倍量的水，夹层加 热煮沸提取 3 小时，同时收集得含挥发油的乳浊液 1953ml，经油水分离器分离 收集挥发油得挥发油 18ml 及芳香水 1935ml，备用。提取液经卧式螺旋卸料过滤 离心机放出，备用。 药渣再加入 6 倍量的水提取 1.5 个小时，经卧式螺旋卸料过滤离心机放出 提取液，与第一次提取夜合并，备用。药渣弃去。3.对提取液进行浓缩 3.对提取液进行浓缩合并提取液，在 65℃以下真空浓缩至相对密度 1.12（60℃热测） ，放置冷 却至室温，于搅拌中缓慢加入 85%乙醇，使含乙醇浓度达到 70±2%，静置 24 小 时，过滤，取上清液回收乙醇并浓缩至相对密度为 1.09（20℃测） ，得抗病毒浓 缩液 2100ml，备用。4.包合物的制备 4.包合物的制备取羟丙基-β环糊精 75g 制成饱和水溶液， 加入经无水硫酸钠脱水后的挥发 油 15ml，控制温度 40~60℃搅拌 5 小时，搅拌速度 300r/min，得羟丙基-β环糊 精包合液 125g。包含率为 75%。5.配滤 5.配滤取抗病毒浓缩液 2100ml 过滤后，加入蜂蜜 840g、蔗糖 1260g、羟丙基-β 环糊精包合液 125g、芳香水 1935ml、调节 PH 至 5.10，混匀至澄清，加水定容11至 7000ml，定容过滤。6.灌装、 6.灌装、灭菌 灌装通过口服液灌装灭菌一体机进行定溶液灌装 10ml/支，灭菌产品。7.质量检测及包装 7.质量检测及包装人工进行质量检测，然后贴上标签，装盒，入箱制成成品。三、物料衡算1.主料总物料衡算 1.主料总物料衡算 主料生产任务：年产 1 亿支抗病毒口服液，每支 10ml。 每年按 300 天计算，每天按 24 小时不间断生产。 日产：100 000 000 支/300≈333 334 支 时产：100 000 000 支/(300*24)≈13 889 支 共需要药材总质量如下（按 95%总效率计算） ： 板蓝根：100 000 000支*（900g/7000ml）*10ml/95%≈135 吨 石 芦 地 郁 知 膏：100 000 000 支*（400g/7000ml）*10ml/95%≈60 吨 根：100 000 000 支*（425g/7000ml）*10ml/95%≈64 吨 黄：100 000 000 支*（225g/7000ml）*10ml/95%≈34 吨 金：100 000 000 支*（175g/7000ml）*10ml/95%≈27 吨 母：100 000 000 支*（175g/7000ml）*10ml/95%≈27 吨石菖蒲：100 000 000 支*（175g/7000ml）*10ml/95%≈27 吨 广藿香：100 000 000 支*（200g/7000ml）*10ml/95%≈30 吨 连 翘：100 000 000 支*（325g/7000ml）*10ml/95%≈49 吨辅料总 2. 辅料总物料衡算蜂 蔗 蜜：100 000 000支*（840g/7000ml）*10ml=120吨 糖：100 000 000支*（1260g/7000ml）*10ml=180吨羟丙基-β环糊精：100 000 000支*（75g/7000ml）*10ml≈11吨12四、设备的选型1、清洗罐：生产能力：100kg/h 清洗罐外形尺寸：100*150CM（直径*高）2、烘干机：型号：CT-C-I 烘干机：生产能力：100kg/h 外形尺寸：140*80*180 CM（长*宽*高）3、粉碎机：型号：HK-180生产能力：30-120kg/h 外形尺寸：48*100*100 CM（长*宽*高）4、提取机：型号：BDHF-5B生产能力：12~30Kg/h 外型尺寸：200*120*135 CM（长*宽*高）5、浓缩机：型号：YZ-450 浓缩机：生产能力：20000-50000 ml 外型尺寸：100*60*180 CM（长*宽*高）6、配滤罐：型号：WCG-20 配滤罐生产能力：20000-50000 ml 外型尺寸：150*100 CM（直径*高）7、灌装机：型号：GR-ZGF-40 型 灌装机：生产能力：4800（罐/h） 外型尺寸：250*90*140 CM（长*宽*高）五、能量衡算 能量衡1.浸取设备的能量衡算浸取过程的能量的衡算： 查酒精比热容 2.4*103J/（Kg .℃）13采用的料液比：1:8起始温度 25℃ 酒精密度 0.8g/ml加热温度 50℃每天消耗板蓝根量 450kg 故需酒精量为 450*8*0.8kg=720kg 消耗电的能量： Q=cm(t2-t1)=2.4*103*720*(50-25)J=4449600J= 4449.6KJ 理论的电量：Q/(3600s*1KW)= 4449.6/3600=1.236 度 电机的功率：6.5KW 浸取过程总消耗的电量：6.5*24+1.236=157.236 度2.其他主要设备的能量衡算清洗烘干粉碎联合设备的功率：7.38KW 灌装灭菌一体机的功率：5.5KW 搅拌器功率：2.8 KW 自动灌装封口机的功率：3.4 KW 其他合计：11.6 KW 每天消耗的电量： （7.38+5.5+2.8+3.4+11.6） *24 度=763.32 度六、工厂总体设计及选图1）.厂址的选择我厂拟建于六安市裕安区月亮岛西区，原因如下： 1．月亮岛环境优美，大气含尘、含菌浓度低，无有害气体，自然环境好，对药 品质量无有害因素，卫生条件较好。 2．月亮岛在居民区最大频率风向的下风口，药厂所产生的废气不会对居民健康 造成影响。 3．要预见的市政区域规划，药厂建在市政区域规划不影响药品质量的影响。 4．月亮岛处于六安市，交通发达，且离原材料产地很近，方便原材料的购买与 产品的出售。145．月亮岛水、电资源丰富，将不会出现能源不足的情况。 6．我厂拟进口一批污水处理系统，届时，我厂污水将得到妥善处理2).厂房总体布置1．根据《建筑设计防火规范》GBJ1s-87 等规范，我厂总图布置符合防火、安全 和卫生的要求。各建筑物之间离有一定的距离，生产药品的车间类别不同，它们 之间的间距也设置不同。 2． 我厂区内的主要道路要径直短捷 ， 而且有考虑消防通道。 厂区道路环形相通， 厂内的主要道路为双车道。人流和物流之间 ， 货流和货流之间尽可能避免了交 叉和迂回。 3．我厂生产厂房布置在厂区环境清洁区域，不让厂区的地面、路面及运输不对 药品的生产造成污染。 4．根据产品的工艺特点和防止秤时交叉污染，合理布局、间距恰当。我厂原料 药生产区应置于制剂秤区的下风侧。车间仓库等的分布是根据药物的流程安排 的。 5．我厂厂房与道路之间应有一定距离的卫生缓冲带，缓冲带种植了草坪，绿化 设计做到“土不见天” 。最大限度的减少空气中的微粒，防止污染药物。 6. 我厂车辆的停车场设在办公区前，远离药品生产厂房，防止发生爆炸。 7. 本厂涉及到中药提取，有残渣生成，为防止污染，生产废弃物的回收是独立 设置的。3).工厂的总体平面设计根据生产发展需要，首先要进行厂区划分，确定全厂建筑厂房，构建物，道 路，堆场管路管线及绿化美化等设施在厂区平面上的相互位置。 工厂的总体平面设计不仅需要如下依据： 1 审批的设计任务书。 2 厂址的选择报告。 3 厂址总体平面布置方案草图。154 生产工艺流程简图。 平面的设计还需要一些要求： 1 符合生产流程的要求。 2 生产主厂房处于占地面积较大的中心地带。 3 考虑地区主风向的影响。 4 人流货流通道的分开，避免交叉。 5 遵循城市规划的要求。 6 符合国家有关规范和规定。4).生产车间设计及布置原则 1、要求(1)生产设备要按工艺流程的顺序配置，在保证生产要求、安全及环境卫生的前 提下，尽量节省厂房面积与空间，减少各种管道的长度。 (2）保证车间尽可能充分利用自然采光与通风条件，使各个工作地点有良好的劳 动条件。 (3）保证车间内交通运输及管理方便。万一发生事故，人员能迅速安全地疏散。 (4）厂房结构要紧凑简单，并为生产发展及技术革新等创造有利条件。2、原则(1）各工序的设备布置要与主要流程顺序相一致，是生产线路成链状排列而无交 叉迂回现象，并尽可能自流输送，力求管线最短。 (2）注意改善操作条件，对劳动条件差的工段要充分考虑朝向、风向、门窗、排 气、除尘及通风设施的安装位置。设备的操作面应迎着光线，使操作人员背光操 作。 (3） 辅料制备车间应与适用设备靠近， 但如液氯汽化、 制漂等有污染和粉尘部分， 应有墙与车间隔开，应有通风等必要的设施。 (4）冬天无严重冰冻地区的工厂可考虑把不适宜在车间内布置的设施，布置在室 外。高压容器等有爆炸危险的设备应布置在室外。并有安全报警和事故排空等安 全措施。16(5）相互联系的设备在保证正常运行、操作、维修、交通方便和安全条件下，尽 可能靠近。 (6）设备与墙柱之间的间距，无人通过最小 500mm，有人通过最小 800mm (7）泵与泵之间间距一般 1000mm，泵组之间间距约 1500mm。 (8）设备的安装位置不应骑在建筑物的伸缩缝或沉降缝上。 (9）发散有害物质、产生巨大噪音和高温的生产部分应同一般的生产部分适当的 隔开，以免互相干扰。 (10）要统一安排车间所有操作平台、各种管路、地沟、地坑及巨大的或震动大 的设备基础，避免同厂房基础发生矛盾。 (11）操作平台的宽度应大于 500mm，平台向上距梁底或楼板的距离应大于 2000mm，平台下若走人或有设备需检修，平台底部净高不应小于 2000mm。 (12）合理安排厂房的出入口，每个车间出入口不应少于 2 个，厂房大门的宽度 应 比 所 需 通 过 的 设 备 宽 度 大 200mm 左 右 ， 比 满 载 的 运 输 工 具 宽 度 要 大 600~1000mm，总的宽度不应小于 2000~2500mm。 (13）要考虑必要的锥料面积。 (14）遵守国家的有关劳动卫生及防火安全等方面的各项规定， 《建筑设计防火规 范》 。 (15）要考虑到厂房扩建的需要。 (16）在满足生产工艺需要的同时，设备布置要尽量符合建筑结构标准化要求， 18m 以下，采用 3m 的倍数，18m 以上采用 6m 的倍数，多层厂房跨度和柱距均以 6m 进位，高度应为 300mm 的倍数。 (17）车间布置相关专业的要求。七、废液的处理及其防治1.废液的处理方法 1.废液的处理方法我厂拟从德国进口整套的污水处理循环系统， 最大量的减少了污水的排放， 同时， 我厂排放的污水也将符合国家级相关标准。17八、参考文献朱宏吉,张明贤．制药设备与工程设计．化学工业出版社 张珩.制药工程工艺设计．化学工业出版社 刘红霞,梁军，马文辉.药物制剂工程及车间工艺设计.化学工业出版社 高俊亭，毕万全，马全明.工程制图.高等教育出版社 王志魁.化工原理.化学工业出版社 中华机械网 国家知识产权局网18

1 cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。在获得高质量的 mRNA 后，用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。 1.2 cDNA 全长文库 经典 cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的 cDNA。为了克隆到真正的 cDNA 全长，建立富含全长的 cDNA 文库具有重要意义。为此，必须克服仅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长 cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的 mRNA 分子经反转录而得到的 DNA 分子群体，是 mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长 cDNA 文库不仅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到 mRNA 剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen，USA) 使用说明进行。判断一个 cDNA 文库中的 cDNA 序列是否是全长基因的 cDNA，主要方法有以下几种。 1.2.1 直接从序列上评价 5"端：如果有同源全长基因的比较，可以通过与其它生物已知的对应基因5"末端进行比较来判断。如果无同源基因的新基因，则首先判断编码框架是否完整，即在开放阅读框的第1个 ATG 上游有无同框架的终止密码子；其次，判断是否有转录起始点，一般加在5"帽结构后有一段富含嘧啶的区域，或者是 cDNA 5"序列与基因组序列中经过酶切保护的部分相同，则可以确定得到的 cDNA 的5"端是完整的。3"端：同样可以用其它生物已知的对应基因3"末端进行比较来判断，或编码框架的下游有终止密码子，或有1个以上的 PolyA 加尾信号，或无明显加尾信号的则也有 PolyA 尾。 1.2.2 用实验方法证实 可以通过引物延伸法确定5"端和3"端的长度，如：5"端 RACE，3"端 RACE，或者通过 Northern Blot 证实大小是否一致。 1.3 对 cDNA 文库的分析 对 cDNA 文库质量的评价主要有两个方面。第一方面为文库的代表性，cDNA 文库的代表性是指文库中包含的重组 cDNA 分子反映来源细胞中表达信息(即 mRNA 种类)的完整性，它是体现文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用文库的库容量来衡量，它是指构建的原始 cDNA 文库中所包含的独立的重组子克隆数。库容量取决于来源细胞中表达出的 mRNA 种类和每种 mRNA 序列的拷贝数，1个正常细胞含10000～30000种不同的 mRNA，按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度三种，其中低丰度 mRNA 是指某一种在细胞总计数群中所占比例少于0.5％时。满足最低要求的 cDNA 文库的库容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 计算( P 为文库中任何一种 mRNA 序列信息的概率，通常设为99％；N 为文库中以 P 概率出现细胞中任何一种 mRNA 序列理论上应具有的最少重组子克隆数；n 为细胞中最稀少的 mRNA 序列的拷贝数；T 为细胞中表达出的所有 mRNA 的总拷贝数)。第二方面是重组 cDNA 片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种 mRNA 片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种 mRNA 尽管具体序列不同，但基本上都是由3部分组成，即5"端非翻译区，中间的编码区和3"端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。因此，要从文库中分离获得目的基因完整的序列和功能信息，要求文库中的重组 cDNA 片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。 2 cDNA 文库构建的其它类型 2.1 均一化 cDNA 文库 它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在 cDNA 文库中表达基因对应的 cDNA 的拷贝数相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通过基因组 DNA 饱和杂交的原理将 cDNA 文库进行均一化的理论。但该理论一直以来都被认为不能应用于实际。其主要限制因素是难以提供足量的极低表达丰度的 cDNA 用于饱和杂交，从而可能会造成部分基因的 cDNA 的丢失。20年前，基于 DNA-RNA 杂交的研究就已经将基因的转录水平分为高中低3类。随后研究进一步表明，绝大多数基因是处于中等或低等表达丰度的，在单个细胞中含有近1～15个拷贝，而高丰度表达基因的转录产物在单个细胞中最高可达5000个左右拷贝，约占总表达量的25％。这种基因表达能力上的巨大差异成了获得一个具有完整代表性的 cDNA 文库的障碍，其表达量上的巨大差异更为大规模研究增添了困难。对单一组织的 cDNA 文库而言，高拷贝基因序列的大量存在给基因的筛选和鉴定带来不必要的浪费，尤其是在大规模的 EST 测序中。 均一化 cDNA 文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。现在，在构建均一化的 cDNA 文库中至少有2种主要的观点：一种是基于复性动力学的原理，高丰度的 cDNA 在退火条件下复性的速度快，而低丰度的 cDNA 复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组 DNA 在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过 cDNA 与基因组 DNA 饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的 cDNA 的丰度。第一种方法的掌握对技术的要求比较高，对多数人而言需要多次摸索才能找到最适条件；而后一种方法易于掌握，但有研究者根据复性动力学的原理也提出了其不利因素，即采用基因组 DNA 饱和杂交的方法会因为低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂交上。目前已报到的均一化 cDNA 文库多是根据第二种原理构建的，常用策略有基于 PCR 技术利用 cDNA 多次复性 mRNA-cDNA 杂交等。有研究报道，针对各自选择的高表达靶序列进行分析后，均一化处理后文库的高丰度表达 cDNA 是处理前的0.3％～2.5％，基本满足节约筛选的要求。 均一化 cDNA 文库具有以下4方面的优点：第一，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本。第二，增加克隆低丰度 mRNA 的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三，与原始丰度的 mRNA 拷贝数相对应的 cDNA 探针与均一化的 cDNA 文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。而以往的文库构建，忽略了 mRNA 丰度的影响。第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。 2.2 差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA library) 差减文库也称扣除文库，使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料(如不同基因处理细胞系或植物的近等基因系等)提取 mRNA (或反转录后合成 cDNA)，在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子( Driver )与含有目的基因的试验方( Tester )进行杂交，选择性的祛除两部分共同基因杂交形成的复合物，往往进行多次的杂交—祛除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。消减杂交是构建差减 cDNA 文库的核心，差减文库是否构建成功很大程度上决定于差减杂交的效率。差减杂交的方法主要有(1)羟基磷灰石柱层析法 (HAP)；(2)生物素标记、链亲和蛋白结合排除法；(3)限制性内切酶技术相结合的差减方法；(4)差减抑制杂交法 (SSH)；(5)磁珠介导的差减法 (MAST)，其中 SSH 法最为常用。 抑制性消减杂交技术 (Suppression Subtractive Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人于1996年依据消减杂交和抑制 PCR 发展出来的一种分离差异表达基因的新方法，主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。它主要是利用抑制 PCR 对差减杂交后丰度一致的目的材料中两端连有不同接头的差异表达片段进行指数扩增，而两端连接上同一接头的同源双链片段仅呈线形扩增，从而达到富集差异表达基因的目的。因此应用该技术能够对两个有差异表达的材料(细胞或组织)高、中、低丰度目的基因都进行有效、快速、简便克隆。近年来已成功应用于植物发育、肿瘤与疾病、以及外界因子诱导组织细胞中相关的应答基因的分析和克隆。 2.3 固相 cDNA 文库构建 cDNA 的固相合成是人们早为熟知的技术，但局限之处 oligo(dT) 与纤维素胶粒或磁珠的结合比较牢固，将 cDNA 洗脱下来时得率不是很高，而且以后的反应步骤也不能都在介质上进行，这可能是该技术应用并不十分广泛的原因。 最近 THOMAS ROEDE 提出了一种新的 cDNA 文库固相合成方法( THOMAS ROEDE，1998)，克服了以前文库构建中存在的缺点，所用的酶和试剂与传统方法完全相同，不同的是 cDNA 的合成和修饰均在固相支持物—磁珠上完成。cDNA 通过一个生物素固定在链霉素偶联的磁珠上，这样在反应过程中就可以简便而迅速的实现酶和缓冲液的更换，因此它将快速与高质量的文库构建结合在一起(构建文库只需1 d)，并且构建的文库适合大多数的研究目的。 固相 cDNA 合成法的主要优点是可以简便 cDNA 合成的操作。在进行缓冲液更换时既没有 cDNA 的丢失之忧，也无其它物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真实的代表性文库，它包含有短小的 cDNA，这是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总之，固相法结合了传统的 cDNA 合成的优点并弥补了其不足。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量，因此它可能会替代目前应用的 cDNA 文库操作方法。 另外，最近发展起来的微量 RNA 的 cDNA 构建，是使用 PCR 技术，在实验室条件下扩增的 mRNA 的 cDNA 量，其 PCR 检测的灵敏度远远大于反转录 PCR(RT-PCR) 法。微量 RNA 的 cDNA PCR 文库的构建可为有关微量活性物质遗传基因的研究提供方便。 3 cDNA 文库应用于分离新基因的方法 发现并分离克隆新基因始终是分子生物学研究的主要任务和目的，虽然 cDNA 文库的用途很多，但是，应用于分离新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪种类型的 cDNA 文库，都可以用于分离新基因，只是使用的方法有差异。分离方法主要有两种：第一，对于非全长 cDNA 文库，即不管是经典的 cDNA 文库方法或差减法构建的 cDNA 文库，需要利用已经获得的新 cDNA 序列片段，通过 RACE 方法获得新基因的全长序列。第二，利用全长 cDNA 文库与目的基因片段作为探针的杂交筛选。 3.1 从非全长 cDNA 文库中筛选新基因 3.1.1 RACE 法 RACE 文库即快速扩增 cDNA 末端法( Rapid Amplification of cDNA End，RACE )只需知道 mRNA 内很短的一段序列即可扩增出其 cDNA 的5"(5" RACE )和3"端(3" RACE )。该法的主要特是利用一条根据已知序列设计的特异性引物和一条与 mRNA 的 PolyA (3" RACE )或加至第一链 cDNA 3"端的同聚尾(5" RACE )互补的通用引物，由于同聚体并非良好的 PCR 引物，同时为了便于 RACE 产物的克隆，可向同聚体引物的5"端内加入一内切酶位点。所用的 cDNA 模板可以使用多聚 dT 引物延伸合成(3"，5"-RACE 均可)。当 RACE PCR 产物为复杂的混合物时，可取部分产物作模板，用另一条位于原引物内侧的序列作为引物与通用引物配对进行另一轮 PCR (巢式 PCR )。早在1988年，FROHMAN 等即用此方法成功地获得了4种 mRNA 的5"合3"末端序列。 迄今已有几种改良的 RACE 方法，通过修饰与优化，与最初的 FROHMAN 报道有所不同：(1) BARSON 等采用锁定寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸引物“锁定”基因特异性序列的3"末端与其 Poly (A) 尾的连接处，进行第1条 cDNA 链的合成，消除了在合成第1条 cDNA 链时寡聚 (dT) RNA 模板 Poly (A) 尾任何部位结合而带来的影响。(2) EDWARDS 和 TROUTT 小组利用 T4 RNA 连接酶把寡核苷酸连接到单链 cDNA 的5"末端，然后用一个3"末端特异性引物和一个锚定引物就可以直接对锚定连接的 cDNA 进行体外 PCR 扩增和克隆。随后，BERTLING 等又用 DNA 连接酶代替 RNA 连接酶。这些方法都避免了在第2条 cDNA 链内同聚序列区互补而导致截断 cDNA 的产生。(3) MARUYAMA 等提出 cRACE 法，采用的引物为基因特异性的，所以非特异性 PCR 产物基本上不会产生。Clontech 等公司也根据 RACE 法的更新，相继推出了 RACE 的相应试剂盒，为克隆 cDNA 提供了方便的工具。最近 HUANG 等人即用 RACE 试剂盒克隆了一种含有类植物血凝素免疫受体 ITIM。 3.1.2 用 PCR 法从 cDNA 文库中快速克隆基因 通过对文库的筛选或适用简并引物进行 PCR 反应，常常只能获得不完整的 cDNA 片段。为了得到 cDNA 全长，常常要重新筛选文库。重新筛选文库工作量大，RACE 虽然为此提供可方便，但应用该方法需重新提取 mRNA 和反转录。而用 PCR 法从 cDNA 文库中快速克隆基因的方法，只需提取 λ 噬菌体 DNA，按保守序列设计 PCR 引物便可将未知片段进行克隆。特别是在基因的两端变异较大而中间某区域保守的情况下，用 PCR 法很容易获取 cDNA 的全长。同一转录产物，又是存在着不同的拼接方式，通过筛库的办法同时将不同拼接方式的克隆筛选出来可能性较小，而使用 PCR 扩增后，有利于观察到不同的拼接方式。另外，为研究基因在不同组织中表达情况，常根据差异显示法找出特异的 mRNA。 3.2 从全长 cDNA 文库中进行杂交筛选 3.2.1 标记探针 cDNA 文库筛选法 cDNA 文库通常涂抹到母盘培养基上，然后再把这些菌落的样品吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上；这时加入标记的探针，如果出现杂交信号，那么从母盘上就可以把包含杂交信号的菌落分离、培养出来。以此筛选出阳性克隆，进行序列分析，以获得 cDNA 全长。该方法能避免 PCR 扩增的非特异性扩增或错配，是一种比较准确可靠的 cDNA 克隆方法。主要缺点是克隆过程需要一系列的酶促反应、产率低、费时长、工作量大。该方法适合于表达丰度高的基因的筛选分离。用于做标记探针的 DNA 片段可以是其它生物的基因片段，在这种情况下筛选出来的基因往往是已分离基因的同源基因；如果用于做标记探针的 DNA 片段是通过新分离蛋白质的氨基酸反推设计的 DNA 序列，或者是特异分子标记子 DNA 序列，那么可以筛选得到新功能基因。 3.2.2 反式 PCR 反式 PCR 克隆 cDNA 全长的基因原理是：双链 cDNA 合成后进行尾—尾连接，环化的 cDNA 用位于已知序列内的限制性内切酶酶切位点造成缺口或用 NaOH 处理使之变性，然后用2条基因特异性引物对重新线性化或变性的 cDNA 进行扩增。反式 PCR 的优势在于，它采用了2条基因特异性引物，因此不易产生非特异性扩增。该方法可以快速、高效地扩增 cDNA 或基因组中已知序列两侧位置的片段。 4 小结 随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。在过去寻找新基因的方法中，以消减杂交、mRNA 差异显示，cDNA 的代表性差异显示分析法、差异消减展示等方法应用最广。这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。目前，比较可行而且应用较多的方法主要还是 cDNA 文库的筛选。一方面 cDNA 文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此 cDNA 克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多；另一方面由于每个 cDNA 克隆只代表一种 mRNA 序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低，所以 cDNA 文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。本文涉及到的有关 cDNA 文库构建方法，是目前比较常用的，这些方法各有优缺点，研究者应根据自己的实际情况，选择合适的技术，已达到自己预期的目的。

最近由于利用手机客户端作弊现象比较严重所以暂时关闭了手机端下载端口，待文库重新升级后会重新放开，请耐心等待，带来不便请谅解。

he behaved quite calmly in face of upcoming danger

不会

不是，cDNA文库是mRNA反转录产生的互补DNA

第一链和第二链合成后，cDNA末端不是平端。而下一步是需要将“连接子”连接到cDNA上，以便于进一步形成粘性末端，装到载体中。因此在连接之前要先补平。

①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。

因为cDNA是由成熟mRNA逆转录而成的.成熟mRNA是由基因组DNA转录并加工而成的,DNA转录的时候是不会把启动子也转录的,转录起始位点都在启动子下游.至于没有内含子,是因为（真核）mRNA成熟的过程中剪接体（也就是一系列...,15,

cDNA以mRNA为模板，基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如cDNA文库，首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。基因文库与基因库的概念不同。基因库是指某一生物群体中的全部等位基因的总称。基因文库与基因克隆的概念也有区别，基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。基因文库的建立和使用是70年代早期重组DNA技术的一个发展。人们为了分离基因，特别是分离真核生物的基因，从1974年起相继建立了大肠杆菌、酵母菌、果蝇、鸡、兔、小鼠、人、大豆等生物以及一些生物的线粒体和叶绿体DNA的基因文库。基因文库的建立使分子遗传学和遗传工程的研究进入了一个新时期。为了有效地保存基因文库，可通过细菌的繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。液体培养不适用于这一目的，因为各个细菌的生存和繁殖能力不同，各个克隆被保存的机会也会因此而不相等。在固体培养基上每一个细菌单独形成一个菌落，各个细菌并不相互干扰和竞争，因而有利于全部克隆的保存。形成的每一个菌落中大约包含1000万个细菌，这样一个基因文库中的所有的克隆几乎都扩增了1000万倍。把培养皿上的细菌全部洗下加以保存，便可以在需要时从中取得任何一个克隆。

　在构建均一化的 cDNA 文库中至少有2种主要的观点：一种是基于复性动力学的原理，高丰度的 cDNA 在退火条件下复性的速度快，而低丰度的 cDNA 复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组 DNA 在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过 cDNA 与基因组 DNA 饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的 cDNA 的丰度。第一种方法的掌握对技术的要求比较高，对多数人而言需要多次摸索才能找到最适条件；而后一种方法易于掌握，但有研究者根据复性动力学的原理也提出了其不利因素，即采用基因组 DNA 饱和杂交的方法会因为低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂交上。目前已报到的均一化 cDNA 文库多是根据第二种原理构建的，常用策略有基于 PCR 技术利用 cDNA 多次复性 mRNA-cDNA 杂交等。有研究报道，针对各自选择的高表达靶序列进行分析后，均一化处理后文库的高丰度表达 cDNA 是处理前的0.3％～2.5％，基本满足节约筛选的要求。 　　均一化 cDNA 文库具有以下4方面的优点：第一，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本。第二，增加克隆低丰度 mRNA 的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三，与原始丰度的 mRNA 拷贝数相对应的 cDNA 探针与均一化的 cDNA 文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。而以往的文库构建，忽略了 mRNA 丰度的影响。第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。

因为cDNA是由成熟mRNA逆转录而成的。成熟mRNA是由基因组DNA转录并加工而成的，DNA转录的时候是不会把启动子也转录的，转录起始位点都在启动子下游。至于没有内含子，是因为（真核）mRNA成熟的过程中剪接体（也就是一系列核内小分子核糖核蛋白snRNPs）会把前体mRNA的内含子切下来（当然也有部分前体mRNA的内含子本身是核酶，自己把自己切下来的），再把外显子拼接成成熟mRNA（当然完全成熟还差一步3"端多聚腺苷酸化，所以真核的cDNA总有一端是polyA.

cDNA文库 以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库.基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达,而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同,所以cDNA文库具有组织细胞特异性.cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因.但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同,基因组.DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA基因组文库 用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA,可以得到大量的基因组DNA片段,然后将这些DNA片段与载体连接,再转化到细菌中去,让宿主菌长成克隆.这样,一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库. 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆.这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合,即基因组文库,它包含了该生物的所有基因.

条件：1 、要使用mRNA经过反转录PCR产生cDNA。 2 、要进一步获得cDNA全长 3 、加适当接头，连接到适当的载体内。 4 、转化受体细胞，构建为cDNA文库。基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA 文库，获得高质量的mRNA 是至关重要的，所以处理mRNA 样品时必须仔细小心。由于RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA很重要。在获得高质量的mRNA 后用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链，cDNA 第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA 聚合酶I，同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断。扩增cDNA 文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ 噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。

cDNA文库 以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库.基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达,而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同,所以cDNA文库具有组织细胞特异性.cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因.但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同,基因组.DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA 基因组文库 用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA,可以得到大量的基因组DNA片段,然后将这些DNA片段与载体连接,再转化到细菌中去,让宿主菌长成克隆.这样,一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库. 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆.这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合,即基因组文库,它包含了该生物的所有基因.

真核生物的基因组编码区包括内含子和外显子，而在转录为rna的时候，内含子转录的rna部分会被加工处理掉，就剩下外显子转录来的rna，也就是成熟rna，此过程在细胞核中进行。而cdna是由rna逆转录来的，也就是相当于没有内含子只有外显子。这就是区别。不过对于生物来说，内含子的作用还不明确，所以你可以看作cdna就跟dna一样可以控制性状就好，在基因工程中获取目的基因可以用cdna文库，它包含控制性状的全部基因片段。

基因文库,基因组文库是一回事。是某生物的全部dna“标本”（把各个基因植入载体分子保存）cdna是利用逆转录信使rna得到的dna，和生物体内的dna有所不同（cdna无内含子）

前者的基因不含有非编码序列，后者是完整的基因。

因为cDNA是由成熟mRNA逆转录而成的。成熟mRNA是由基因组DNA转录并加工而成的，DNA转录的时候是不会把启动子也转录的，转录起始位点都在启动子下游。至于没有内含子，是因为（真核）mRNA成熟的过程中剪接体（也就是一系列核内小分子核糖核蛋白snRNPs）会把前体mRNA的内含子切下来（当然也有部分前体mRNA的内含子本身是核酶，自己把自己切下来的），再把外显子拼接成成熟mRNA（当然完全成熟还差一步3"端多聚腺苷酸化，所以真核的cDNA总有一端是polyA）。

Opaque part contains invalid character: 代 就看这一句就好了，其他的没用，说是有非法字符，检查下standard-html-renderkit.xml

注册一个百度账号就行了

网页链接这里可以

MS有的要足够的财富值才能下呢

代下载各大网站文档

会员吧

是不是你没有财富值？

不能免费。

不可能的呢都像你这样上传者还去哪里有收益的呢所以在心里想想算了

也算是吧。其实就是像快照那样的意思，下载之后的文档很多都是无法修改的

做任务就有金币了。

你好，已下载，怎么发给你

我试过很多软件了，但都不能下载源文档，所以推荐下载源文档：http://www.xxuoo.com/page/index.asp?id=1

不用任何软件下载百度文库里有偿文档的方法。在百度里搜出此段文章的百度文库链接以后，不直接点开网页，而是用 “百度快照” 查看。打开的页面就是可以直接用来复制文字网页格式了。此方法也是在我求助无门以后自己摸索出来的，记得给分哦！！！！

冰点下载后 一般是pdf格式 你需要安装pdf阅读器 才可用打开他们

1下 载个“冰点文库下载”软件，打开你要找的文档那一页，复制地址冰点文库中就可以下载了。 2注册百度账号 3在打开的地址栏中wenku前家加wap慢慢复制吧！

冰点文库下载器可能被和谐了吧,你去搜搜有无冰点文库下载器的更新版本,　　还不行就换其他下载器吧,　　你可以百度搜>“百度文档免积分下载器”、“爆米花百度文库下载器”、“百度文库宝”等关键词，即可搜索到这些免积分下载工具了。(备注：此类免费工具下载的文档，有的不是原来的格式，有的文档内容不是正常大小，没有直接下载的好)

无论你是学生还是职场人，提到百度文库一定不陌生。然而，了解百度文库的人都知道，其中大部分文档是需要下载卷或开通VIP才能下载的，且价格不菲。那么百度文库vip文档怎么免费查看全文内容?今天小编就来给大家讲一讲百度文库文档免费查看下载方法，快来看看吧。百度文库vip文档怎么免费查看全文内容1、首先在百度文库找到你想要下载的文档，如下图，我找了一个创业计划书的Word文档，需要5个下载券才能下载。2、在文档页面的网址“baidu”后面加上“vvv”三个字母，然后回车。就可以跳转到这个VVV文档在线导出工具网站的下载页面。3、选择你需要导出文档的格式，可以word或者PDF，选择之后点击下载即可。4、下面以word为例给大家演示一下。点选word，然后点下载。以下展示的是下载后的文档。可以看到，下载的文档格式还是很不错的。5、同理，这个网站还可以直接下载收费的原格式文档，如下图，我找了一个需要3元才能下载的文档，然后“VVV”回车，也是可没有问题的。不过这种方法有一个缺点有时候用的人多，这种在线下载的方式自然拥挤。导致下载的时候就卡住不动了。不过没关系。小编给大家准备了，最新版的冰点文库下载器。拥挤的时候，就用它。以上就是小编为大家带来的百度文库文档免费查看下载方法，希望可以帮到大家。

学习过程中，很多小伙伴都会频繁使用百度文库，但是其中很多资料需要付费才能查看。那么，怎么复制百度文库里面的vip内容?下面将详细介绍百度文库怎么免费复制粘贴付费文字的具体方法，让我们一起来看看吧。怎么复制百度文库里面的vip内容1、首先在百度文库找到你想要下载的文档，如下图，我找了一个创业计划书的Word文档，需要5个下载券才能下载。2、在文档页面的网址“baidu”后面加上“vvv”三个字母，然后回车。就可以跳转到这个VVV文档在线导出工具网站的下载页面。3、选择你需要导出文档的格式，可以word或者PDF，选择之后点击下载即可。4、下面以word为例给大家演示一下。点选word，然后点下载。以下展示的是下载后的文档。可以看到，下载的文档格式还是很不错的。5、同理，这个网站还可以直接下载收费的原格式文档，如下图，我找了一个需要3元才能下载的文档，然后“VVV”回车，也是可没有问题的。不过这种方法有一个缺点有时候用的人多，这种在线下载的方式自然拥挤。导致下载的时候就卡住不动了。不过没关系。小编给大家准备了，最新版的冰点文库下载器。拥挤的时候，就用它。以上就是小编为大家带来的复制百度文库里面的vip内容的操作方法了，希望可以帮到大家。

点评

百度的不要钱，豆丁的收费

答问题

冰点文库下载（软件） 免费下载百度文库

你好，百度文库可以用“冰点文库下载”这个软件下载，不需要财富值，只要把资料对应的文库地址复制进去就可以了，支持PDF下载，还可转换为WORD文档，（carlsber温馨提示：转换后的WORD文档可能需要自行调整板式）自己搜一下网上大把。 我告诉你的方法是一劳永逸的方法，以后就不需要求人或者去弄财富了。

shi di

no way

主要获取文库财富值的途径：1：注册新用户可以免费获得系统赠送的2个财富值；2：在文库个人中心接受并完成系统任务可获得10财富值（点文库页面右上方“我的文库”）：3：评论文档，评论1次1分，每天最多5分。点击文档页面右边当前文库信息下的“五角星”评论；4：自己上传文档，并对文档设置财富值，别人下载了即可获得别人的财富值；5：评论文辑。评论1次1分，每天最多5分，点击文辑页面的文档列表最下方的“五角星”进行评论：6：百度Hi的积分可兑换文库的财富值，200个积分可兑换10财富值，详情【点击文库页面上方搜索框右边“帮助”→如何获得积分】

先搜索到需要的文档后,在地址栏http:// 后加上wap

可以多挣积分和金币啊

电脑的问题吧！！

怎样在没有百度文库财富积分的情况下去下载文档?许多百度的网友在百度文库中看到自己需要的文档时，便想立即去下载。可就在这时，才发现自己想要下载的文档需要积分，而自己已经没有百度文库的财富积分了。遇到这种情况，他们便不厌其烦地到处去求人帮忙下载。其实，遇到这种情况，自己就可以解决问题。百度文库的人性化设计为我们提供了可能。在百度文库增加积分的规定中，评价文档，+1分/次，每天最多5分；给文辑打分评价，+1分/次，每天最多5分。只要我们按此操作，便可每天一下子获得10个财富积分。另外.文库新用户激活会获得2分财富值(xyz5819 意念时空)领取新手大礼包任务,并填写完善自己关注和擅长的领域.即使还没上传文档,也能免费获得文库经验值+12分及财富值+12.这样，我们还愁没有积分去下载自己喜爱的文档吗?再则，我们给百度文库中的文档和文辑评价打分，不但增加了自己的财富，更重要的也是对文档上传者辛勤劳动的认可。(xyz5819 意念时空)友情提示:知友你也可以文库首页输入关键词去搜一下有无同类文库文档是无文库财富值标价.可以免费下载的.怎样不用百度文库财富值就能下载百度文库文档?百度文库可以用“冰点文库下载”这个软件下载，不需要文库财富值.只要把资料对应的文库地址复制进去就可以了,支持PDF下载,还可转换为WORD文档.（友情提示：转换后的WORD文档可能需要自行调整版式）百度搜>冰点文库 下载 一搜大把下载地址的。恭喜你!以后下载文库文档就不需要再求人或者为去弄文库财富值而发愁了。(xyz5819 意念时空)知友你也可以百度搜>“百度文档免积分下载器”、“爆米花百度文库下载器”、“百度文库宝”等关键词，即可搜索到这些免积分下载工具了。(备注：此类免费工具下载的文档，有的不是原来的格式，有的文档内容不是正常大小，没有直接下载的好)怎样下载百度文库文档?百度文库文档目前不支持下载工具下载,请设置屏蔽你的所有下载工具的监控,使用浏览器自带的下载功能就能下载文库文档了.免费复制、下载百度文库的方法：1.截图复制。适用于短篇，用截图工具截下复制到文件夹里或word里即可。2.在文档地址栏里的wenku前面加上wap，敲回车键，即可进入该文档可复制的页 面，你复制粘贴到电脑上（注:此方法只对TXT和部分DOC文件有效，特殊格式 的不支持）这个方法得到的文档，在排版、格式上都会有变化。3.返回之前打开的网站，后边一般有个百度快照，点它进入，你会发现你要的内 容可以复制了。4.提问题，求你需要的文档、留邮箱，让有文库财富值的网友帮你下载。5.电脑上安装“百度文库下载器” ，安装好以后，在下载器的搜索框里输入关 键词或题目，就可以搜索到你需要的文档，并可以免费下载（要财富值的文， 下载器也可以免费下载，但特殊格式的也是不支持，一般支持doc格式、txt格 式。

电脑的问题，是不是在你的电脑上乱码了？？？？

一个个点下载啊

（carlsber温馨提示，支持pdf下载：转换后的word文档可能需要自行调整板式）自己搜一下网上大把，还可转换为word文档。我告诉你的方法是一劳永逸的方法，下载不需要文库财富值你好，只要把资料对应的文库地址复制进去就可以了，软件本身免费，百度文库可以用“冰点文库下载”这个软件下载，以后就不需要求人或者去弄财富了

肯定好用撒 资源那么多

下载文档啊

关注【无聊的社长有点好笑】领取文库下载器

我也碰见了同样的问题

据说有个叫财金通的软件可以。不过，普通的期货行情软件也可以使用的，下载一个模拟平台就行了。