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nasty consequences恶劣后果

TCP协议主为了在主机间实现高可靠性的包交换传输协议。本文将描述协议标准和实现的一些方法。因为计算机网络在现代社会中已经是不可缺少的了，TCP协议主要在网络不可靠的时候完成通信，对军方可能特别有用，但是对于政府和商用部门也适用。TCP是面向连接的端到端的可靠协议。它支持多种网络应用程序。TCP对下层服务没有多少要求，它假定下层只能提供不可靠的数据报服务，它可以在多种硬件构成的网络上运行。下面的图是TCP在层次式结构中的位置，它的下层是IP协议，TCP可以根据IP协议提供的服务传送大小不定的数据，IP协议负责对数据进行分段，重组，在多种网络中传送。TCP的上面就是应用程序，下面是IP协议，上层接口包括一系列类似于操作系统中断的调用。对于上层应用程序来说，TCP应该能够异步传送数据。下层接口我们假定为IP协议接口。为了在并不可靠的网络上实现面向连接的可靠的传送数据，TCP必须解决可靠性，流量控制的问题，必须能够为上层应用程序提供多个接口，同时为多个应用程序提供数据，同时TCP必须解决连接问题，这样TCP才能称得上是面向连接的，最后，TCP也必须能够解决通信安全性的问题。网络环境包括由网关（或其它设备）连接的网络，网络可以是局域网也可以是一些城域网或广域网，但无论它们是什么，它们必须是基于包交换的。主机上不同的协议有不同的端口号，一对进程通过这个端口号进行通信。这个通信不包括计算机内的I/O操作，只包括在网络上进行的操作。网络上的计算机被看作包传送的源和目的结点。特别应该注意的是：计算机中的不同进程可能同时进行通信，这时它们会用端口号进行区别，不会把发向A进程的数据由B进程接收的。进程为了传送数据会调用TCP，将数据和相应的参数传送给TCP，于是TCP会将数据传送到目的TCP那里，当然这是通过将TCP包打包在IP包内在网络上传送达到的。接收方TCP在接收到数据后会通信上层应用程序，TCP会保证接收数据顺序的正确性。虽然下层协议可能不会保证顺序是正确的。这里需要说明的是网关在接收到这个包后，会将包解开，看看是不是已经到目的地了，如果没有到，应该走什么路由达到目的地，在决定后，网关会根据下一个网络内的协议情况再次将TCP包打包传送，如果需要，还要把这个包再次分成几段再传送。这个落地检查的过程是一个耗时的过程。从上面，我们可以看出TCP传送的基本过程，当然具体过程可能要复杂得多。在实现TCP的主机上，TCP可以被看成是一个模块，和文件系统区别不大，TCP也可以调用一些操作系统的功能，TCP不直接和网络打交道，控制网络的任务由专门的设备驱动模块完成。TCP只是调用IP接口，IP向TCP提供所有TCP需要的服务。通过下图我们可以更清楚地看到TCP协议的结构。上面已经说过了，TCP连接是可靠的，而且保证了传送数据包的顺序，保证顺序是用一个序号来保证的。响应包内也包括一个序列号，表示接收方准备好这个序号的包。在TCP传送一个数据包时，它同时把这个数据包放入重发队列中，同时启动记数器，如果收到了关于这个包的确认信息，将此包从队列中删除，如果计时超时则需要重新发送此包。请注意，从TCP返回的确认信息并不保证最终接收者接收到数据，这个责任由接收方负责。每个用于传送TCP的通道都有一个端口标记，因为这个标记是由每个TCP终端确定的，因此TCP可能不唯一，为了保证这个数值的唯一，要使用网络地址和端口号的组合达到唯一标识的目的，我们称这个为了套接字（Socket），一个连接由连接两端的套接字标识，本地的套接字可能和不同的外部套接字通信，这种通信是全双工的。通过向本地端口发送OPEN命令及外部套接字参数建立连接，TCP返回一个标记这个连接的名称，以后如果用户需要使用这个名称标记这个连接。为了保存这个连接的信息，我们假设有一个称为传输控制块（Transmission Control Block，TCB）的东西来保存。OPEN命令还指定这个连接的建立是主动请求还是被动等待请求。下面我们要涉及具体的功能了，TCP段以internet数据报的形式传送。IP包头传送不同的信息域，包括源地址和目的地址。TCP头跟在internet包头后面，提供了一些专用于TCP协议的信息。下图是TCP包头格式图：源端口：16位；目的端口：16位序列码：32位，当SYN出现，序列码实际上是初始序列码（ISN），而第一个数据字节是ISN+1； 确认码：32位，如果设置了ACK控制位，这个值表示一个准备接收的包的序列码；数据偏移量：4位，指示何处数据开始；保留：6位，这些位必须是0；控制位：6位；窗口：16位； 校验位：16位；优先指针：16位，指向后面是优先数据的字节；选项：长度不定；但长度必须以字节记；选项的具体内容我们结合具体命令来看；填充：不定长，填充的内容必须为0，它是为了保证包头的结合和数据的开始处偏移量能够被32整除；我们前面已经说过有一个TCB的东西了，TCB里有存储了包括发送方，接收方的套接字，用户的发送和接收的缓冲区指针等变量。除了这些还有一些变量和发送接收序列号有关：发送序列变量SND.UNA - 发送未确认SND.NXT - 发送下一个SND.WND - 发送窗口SND.UP - 发送优先指针SND.WL1 - 用于最后窗口更新的段序列号SND.WL2 - 用于最后窗口更新的段确认号ISS - 初始发送序列号接收序列号RCV.NXT - 接收下一个RCV.WND - 接收下一个RCV.UP - 接收优先指针IRS - 初始接收序列号下图会帮助您了解发送序列变量间的关系：当前段变量SEG.SEQ - 段序列号SEG.ACK - 段确认标记SEG.LEN - 段长SEG.WND - 段窗口SEG.UP - 段紧急指针SEG.PRC - 段优先级连接进程是通过一系列状态表示的，这些状态有：LISTEN，SYN-SENT，SYN-RECEIVED，ESTABLISHED，FIN-WAIT-1，FIN-WAIT-2，CLOSE-WAIT，CLOSING，LAST-ACK，TIME-WAIT和 CLOSED。CLOSED表示没有连接，各个状态的意义如下：LISTEN - 侦听来自远方TCP端口的连接请求；SYN-SENT - 在发送连接请求后等待匹配的连接请求； SYN-RECEIVED - 在收到和发送一个连接请求后等待对连接请求的确认； ESTABLISHED - 代表一个打开的连接，数据可以传送给用户；FIN-WAIT-1 - 等待远程TCP的连接中断请求，或先前的连接中断请求的确认；FIN-WAIT-2 - 从远程TCP等待连接中断请求；CLOSE-WAIT - 等待从本地用户发来的连接中断请求；CLOSING - 等待远程TCP对连接中断的确认；LAST-ACK - 等待原来发向远程TCP的连接中断请求的确认；TIME-WAIT - 等待足够的时间以确保远程TCP接收到连接中断请求的确认； CLOSED - 没有任何连接状态；TCP连接过程是状态的转换，促使发生状态转换的是用户调用：OPEN，SEND，RECEIVE，CLOSE，ABORT和STATUS；传送过来的数据段，特别那些包括以下标记的数据段SYN，ACK，RST和FIN；还有超时，上面所说的都会时TCP状态发生变化。下面的图表示了TCP状态的转换，但这图中没有包括错误的情况和错误处理，不要把这幅图看成是总说明了。3.3. 序列号请注意，我们在TCP连接中发送的字节都有一个序列号。因为编了号，所以可以确认它们的收到。对序列号的确认是累积性的，也就是说，如果用户收到对X的确认信息，这表示在X以前的数据（不包括X）都收到了。在每个段中字节是这样安排的：第一个字节在包头后面，按这个顺序排列。我们需要认记实际的序列空间是有限的，虽然很大，但是还是有限的，它的范围是0到2的32次方减1。我想熟悉编程的一定知道为什么要在计算两个段是不是相继的时候要使用2的32次方为模了。TCP必须进行的序列号比较操作种类包括以下几种：(a) 决定一些发送了的但未确认的序列号； (b) 决定所有的序列号都已经收到了；(c) 决定下一个段中应该包括的序列号。对于发送的数据TCP要接收确认，处理确认时必须进行下面的比较操作：SND.UNA = 最老的确认了的序列号；SND.NXT = 下一个要发送的序列号；SEG.ACK = 接收TCP的确认，接收TCP期待的下一个序列号； SEG.SEQ = 一个数据段的第一个序列号；SEG.LEN = 数据段中包括的字节数；SEG.SEQ+SEG.LEN-1 = 数据段的最后一个序列号。请注意下面的关系：SND.UNA < SEG.ACK =< SND.NXT如果一个数据段的序列号小于等于确认号的值，那么整个数据段就被确认了。而在接收数据时下面的比较操作是必须的：RCV.NXT = 期待的序列号和接收窗口的最低沿；RCV.NXT+RCV.WND-1 = 最后一个序列号和接收窗口的最高沿； SEG.SEQ = 接收到的第一个序列号；SEG.SEQ+SEG.LEN-1 = 接收到的最后一个序列号；上面几个量有如下关系：RCV.NXT =< SEG.SEQ < RCV.NXT+RCV.WND 或 RCV.NXT =< SEG.SEQ+SEG.LEN-1 < RCV.NXT+RCV.WND测试的第一部分是检查数据段的开始部分是否在接收窗口中，第二部分是检查数据段的结束部分是否也在接收窗口内；上面两个检查通过任何一个就说明它包括窗口要求的数据。实际中的情况会更复杂一些，因为有零窗口和零数据段长，因此我们有下面四种情况： 段长度接收窗口测试00SEG.SEQ = RCV.NXT0>0RCV.NXT =< SEG.SEQ < RCV.NXT+RCV.WND>00不可接受>0>0RCV.NXT =< SEG.SEQ < RCV.NXT+RCV.WND或RCV.NXT =< SEG.SEQ+SEG.LEN-1 < RCV.NXT+RCV.WND请注意接收窗口的大小可以为零，在窗口为零时它只用来接收ACK信息，因此对于一个TCP来说，它可以使用零大小窗口在发送数据的同时接收数据。即使接收窗口的大小为零，TCP必须处理所有接收到信息的RST和URG域。我们也应用计数的方式保护了一些特定的控制信息，这是通过隐式地使用一些控制标记使数据段能够可靠地重新发送（或确认）为达到的。控制信息并不在段数据空间中传送，因此，我们必须采用隐式指定序列号进行控制。SYN和FIN是需要保护的控制量，这两个控制量也只在连接打开和关闭时使用。SYN被认为是在第一个实际数据之间的数据，而FIN是最后一个实际数据之后的数据。段长度（SEG.LEN）包括数据和序列号空间，如果出现了SYN，那么SEG.SEQ是SYN的序列号。初始序列号选择协议对于特定连接被重复使用没有什么限制。连接是由一对套接字定义的。新的连接实例被定义为连接的另一次恢复，这就带来了问题：TCP如果确定多个数据段是从以前连接的另一次恢复中取得的呢？这个问题在连接迅速打开和关闭，或因为内存原因被关闭然后又迅速建立后显示特别突出。为了避免混乱，用户必须避免因此恢复使用某一连接，而使序列号发生混乱。我们必须保证序列号的正确性，即使TCP失败，根本不知道以前的序列号是什么的情况下也要保证序列号的正确性。当新的连接被创建时，产生一个新的初始序列号（ISN）产生子，它用来选择一个新的32位ISN。产生子和32位时钟的低度位字节相关，低位字节的刷新频率大概是4微秒，因此ISN的循环时间大概是4.55小时。因此我们把网络包的最长生存时间（MSL）小于4.55小时，因此我们可以认为ISN是唯一的。对于每个连接都有发送序列号和接收序列号，初始发送序列号（ISS）由发送TCP选择，而初始接收序列号是在连接建立过程中产生的。对于将要连接或初始化的连接，两个TCP必须和对方的初始序列号同步。这通过交换一个控制位SYN和初始序列号完成。我们把带有SYN的数据段称为"SYNs"。同步的获得过程这里就不重复了，每方必须发送自己的序列号并返回对对方序列号的确认。1) A --> B SYN 本方序列号是X 2) A <-- B ACK 本方序列号被确认3) A <-- B SYN 对方序列号是Y 4) A --> B ACK 确认对方序列号上面的第2步和第3步可以合并，这时可以成为3阶段，所以我们可以称它为三消息握手。这个过程是必须的，因为序列号不和全局时钟关联，TCP也可以有不同的机制选择ISN。接收到第一个SYN的接收方不可能知道这个数据段是不是被延时，除非它记住了在连接上使用的最近的序列号（这通常是不可能的），因此它必须要求发送者确认。为了保证TCP获得的确认是刚才发送的段产生的，而不是仍然在网络中的老数据段产生的，因此TCP必须在MSL时间之内保持沉默。在本文中，我们假设MSL=2小时，这是出于工程的需要，如果用户觉得可以，他可以改变MSL。请注意如果TCP重新初始化，而内存中的序列号正在使用，不需要等待，但必须确认使用的序列号比当前使用的要大。如果一台主机在未保留任何序列号的情况下失败，那么它应该在MSL时间之内不发出任何数据段。下面将会这一情况进行说明。TCP的实现可以不遵守这个规定，但是这会造成老数据被当成新数据接收，而新数据被当成老数据拒绝的情况。每当数据段形成并进入输出队列，TCP会为它指定序列空间中的一个值。TCP中多复本检测和序列算法都依赖于这个地址空间，在对方发送或接收之前不会超过2的32次方个包存在于输出队列中。所有多余的数据段都会被删除。如果没有这个规定，会出现多个数据段被指定同一个序列号的情况，会造成混乱。数据段中序列号的多少和数据段中的字节数一样多。在通常情况下，TCP保留下一个要发送的序列号和还未确认的最老的序列号，不要在没有确认的时候就再次使用，这样会有些风险，也正是因为这样的目的，所以序列空间很大。对于2M的网络，要4.5小时来耗尽序列空间，因为一个数据段可能的最大生存时间也不过十几分之一秒，这就留下了足够的空间；而在100M的网络上需要5.4分钟，虽然少了点，但也可以了。如果在实现TCP时没有为保存序列号留下空间，那清除多余的包可能就不能实现了，因此推荐这种类型的TCP实现最好在失败后等待MSL时间，这样保证多余的包被删除。这种情况有时候也可能会出现在保留序列号的TCP实现中。如果TCP在选择一个另一个TCP连接正在使用的序列号时，这台主机突然失败了，这就产生了问题。这个问题的实质在于主机不知道它失败了多久，也不知道多余的复本是不是还在网络中。处理这种问题的方法是等待MSL时间，如果不这样就要冒着对方错误接收数据的危险，要等待的时间也就称为“沉默时间”。实现者可以让用户选择是不是等待，但是无论用户如何也不见得非要等待MSL时间。3.4. 建立一个连接建立连接应用的是三消息握手。如果双方同时都发送SYN也没有关系，双方会发现这个SYN中没有确认，于是就知道了这种情况，通常来说，应该发送一个"reset"段来解决这种情况。三消息握手减少了连接失败的可能性。下面就是一个例子，在尖括号是的就是数据段中的内容和标记。其它的就不多说了。在第2行，TCP A发送SYN初始化序列号，表示它要使用序列号100；第3行中，TCP B给出确认，并且期待着A的带有序列号101的数据段；第4行，TCP A给出确认，而在第5行，它也给出确认，并发送了一些数据，注意第4行的序列号与第5号的一样，因为ACK信息不占用序列号空间内的序列号。同时产生请求的情况如下图所示，只复杂一点。使用三消息握手的主要原因是为了防止使用过期的数据段。为了这个目的，必须引入新的控制消息，RESET。如果接收TCP处理非同步状态，在接收到RESET后返回到LISTEN状态。如果TCP处理下面几种状态ESTABLISHED，FIN-WAIT-1，FIN-WAIT-2，CLOSE-WAIT，CLOSING，LAST-ACK，TIME-WAIT时，放弃连接并通过用户。我们下面就详细说明后一种情况。通过上面的例子，我们可以看出TCP连接是如何从过期数据段的干扰下恢复的。请注意第4行和第5行中的RST（RESET信号）。半开连接和其它非正常状态如果一方在未通过另一方的情况下关闭连接，或双方虽然失败而不同步的情况我们称为半开连接状态。在一方试图发送数据时连接会自动RESET。然而这种情况毕竟属于不正常情况。应该做出相应的处理。如果A处的连接已经关闭，B处并不知道。当B希望发送数据到A时，就会收到RESET信号，表示这个TCP连接有误，要中止当前连接。假设A和B两个进程相互通信的时候A的TCP发生了失败，A依靠操作系统支持TCP的存在，通常这种情况下会有恢复机制起作用，当TCP重新恢复的时候，A可能希望从恢复点开始工作。这样A可能会试图OPEN连接，然后在这个它认为还是打开的连接上传送数据，这时A会从本地（也就是A的）TCP上获得错误消息“未打开连接”。A的TCP将发送包括SYN的数据段。下面的例子将显示这一过程：上面这个例子中，A方收到的信息并没有确认任何东西，这时候A发现出了问题，于是发送了RST控制信息。另一种情况是发生在A失败，而B方仍然试图发送数据时，下面的例子可以表示这种情况，请注意第2行中A对B发送来的信息不知所云。在下面的例子中，A方和B方进行的被动连接，它们都在等待SYN信息。过期的包传送到B方使B回应了，而收到回应的A却发现不对头，传送RST控制信息，B方返回被动LISTEN状态。现实中的情况太多了，我们列举一些产生RST控制信息的规则如下：通常情况下，RST在收到的信息不是期待的信息时产生。如果在不能确定时不要轻易发送RST控制信息。下面有三类情况：如果连接已经不存在，而发送来的消息又不是RST，那么要返回RST。如果想拒绝对不存在的连接进行SYN，可以使用这种办法。如果到达的信息有一个ACK域，返回的RST信息可以从ACK域中取得序列号，如果没有这个域，就把RST的序列号设置为0，ACK域被设备为序列号和到达段长度之和。连接仍然处于CLOSE状态。如果连接处于非同步状态（LISTEN，SYN-SENT，SYN-RECEIVED），而且收到的确认是对未发出包的确认或是接收到数据段的安全级别与不能连接要求的相一一致时，就发送RST。如果SYN未被确认时，而且收到的数据段的优先级比要求的优先级要高，那么要么提高本地优先级（得事先征得用户和系统的许可）要么发送RST；如果接收数据段的优先级比要求的优先级低，就算是匹配了，当然如果对方发现优先级不对提高了优先级，在下一个包中提高了优先级，这就不算是匹配了。如果连接已经进入SYN，那么接收到数据段的优先级必须和本地优先级一样，否则发送RST。如果到达的信息有一个ACK域，返回的RST信息可以从ACK域中取得序列号，如果没有这个域，就把RST的序列号设置为0，ACK域被设备为序列号和到达段长度之和。连接仍然处于与原来相同的状态。如果连接处于同步状态（ESTABLISHED，FIN-WAIT-1，FIN-WAIT-2，CLOSE-WAIT，CLOSING，LAST-ACK，TIME-WAIT），任何超出接收窗口的序列号的数据段都产生如下结果：发出一个空确认数据段，此段中包括当前发送序列号，另外还包括一个确认指出希望接收的下一个数据段的序列号，连接仍然保存在原来的状态。如果因为安全级，优先级之类的问题，那就发送RST信号然后进入CLOSED状态。天互数据

3500为8通道，3500xl为24通道，为毛细管电泳测序，整套实验下来从提取扩增纯化到上机一般需要大约两天的时间。但是测序时间一般为1-2个小时，准确读长大约在800BP左右。而miseq和roche454为高通量测序，为二代测序技术。具体参数不是太清楚。总体来说ABI在核酸方面更有优势，没有高通量要求的话还是推荐使用ABI的。

选A. 句子意思： 这两个词之间有微妙/细微的的差异. 选项辨析： a.subtle adj.微妙的；精细的；敏感的；狡猾的；稀薄的 b.sharp adj.急剧的；锋利的；强烈的；敏捷的；刺耳的 c.subdue vt.征服；抑制；减轻 d.subsequent adj.后来的,随后的 按照句子意思,选A合适. 祝你开心如意!

根据报错来看，过程的第41行，你使用的表或视图不存在，检查一下是不是表名或视图名写错了。如果没有写错，检查是不是其他用户的，如果是其他用户下的表或视图，需要赋权限才能访问。

“你就那么有时间？” 当然不是。端午三天假期，分别推出了三个插件： 至于这些插件为什么要写？前面也已经提过。 一者是，分子辅助育种，已是常见育种手段，我们都需要了解自己的材料； 二者是，相关储备工作，我早已准备妥当，多少就是打个GUI的问题。 于是，上述倒没什么好说的。 有时候，如果因为一些生活琐事，心情无法平复。我会选择，要么就写写程序，要么就写写推文。 我们不能太看重一个事物，或者一个结果，这会让你过得煎熬。我无数次问自己，人生最重要的是什么？当然，我也清楚，这个不会有答案，尽管我知道答案。 至于「MACS2 GUI Wrapper」，这个插件出现后，可以让所有「TBtools」用户轻松在不同平台，如「Windows」或者「MacOS」上，从原始测序数据到 Peaks，自主完成分析。相比于其他所有解决策略，「TBtools」是最为简单的本地化分析策略，只要你有数据，也有安装「TBtools」就可以，一键安装插件，一键完成分析。 具体这个帖子倒不是教程贴，因为他似乎不需要....毕竟你就是输入两个文件就可以了。可以是两个bed，也可以是两个bam。设置一下输出目录和基因组大小，一切搞定。 写这个博文，主要还是简单记录一下，这个插件开发过程的一些情况。 我尝试了不同方式，不清楚是多少种，包括不同的跨平台实现模式，其中安装方式测试了很多，而运行时也可能遇到问题，于是运行方式也测试了很多；甚至也修改了一些源码云云。总之，用去了我说实话，挺多时间。我选择了放弃，但是又捡起来；要知道，针对 MACS2 的打包，这个念头在三四年前就有了。换句话说，我曾经为此付出了不少时间，也是尝试然后放弃，再尝试再放弃。 这一次，我还是放弃了，经过一天的尝试。从早上8点到晚上20点。说实话，我累了。我真的累了。因为现在的时间不应该用在这上面。每一次尝试都是对自己的一次拷问，到底这个方向对不对，是不是，可以不可以？时间花在这里值得吗？明显不值得。因为我还有很多其他事情要做。 是的，最后我放弃了。但是我又很不甘心。要知道，打包 Python 程序其实是一直以来的计划，他不是很稳定。不是因为不能打包python，而是因为很多所谓python程序包，他本身就只能在 Linux 或者 Unix 系统下运行。到 Windows下，不可能的。其中涉及到各位诸如系统库或者路径等问题。那怎么搞？ 当然，我突然想起来，很久以前被我关闭，但是忘了删除的一个失败项目。当时为了这个失败的项目，我从设计到实现，到最后发现从操作系统底层上，发现就是不可行，也足足花费了三四天。结局就是，这个东西，不可行。 但事实是，经过这一番折腾，我其实收获了一些副产品。而正是这个失败的项目开发过程的副产品，似乎就可以用来解决 python 程序打包或者说 macs2 的打包问题。 转念一想，又测试了三四个小时.....发现确实可行.... 至此，从某个角度来说，「TBtools」的 Plugin 拓展，直接上升了一个台阶~ 未来会有更多复杂的功能变得简单易用。 当然，至于「Python Server」插件，说实话，我还是没想好。暂时确实没时间去折腾Python的便携性处理。感觉上，可能比 R 包还麻烦。尽管，后者相关几乎完全解决了。

2021年开年第一篇笔记~ 该包的主要重点是确定样本之间有差异的位点。它包括支持峰集处理的功能，包括重叠和合并峰集，在峰集里进行重叠区间的测序read计数，以及基于结合亲和的证据(通过read密度的差异测定)识别统计上显著的差异结合位点。为此，它使用了在RNA-Seq环境中开发的统计包(edgeR和DESeq2)。此外，这个包构建在Rgraphics的基础上，提供了一组标准化的图来帮助进行结合分析。 DiffBind主要对峰集(peaksets)进行分析，峰集是一组代表候选蛋白质结合位点的基因组区间（也适用于ATAC-seq的峰集）。每个区间包括一个染色体，一个开始和结束位置，通常还有一个表示对峰的confidence或强度的分数。与每个峰集相关联的是与产生峰集的实验相关的metadata。此外，包含比对上的测序read文件(.bam文件)可以与每个峰集关联。 通常的，DiffBind处理数据一般是五个部分： sample sheet是一个列表，需要包括以下几列："SampleID"， "Tissue"， "Factor"， "Condition" ，"Treatment"，"Replicate"， "bamReads" ，"ControlID" ，"bamControl" ，"Peaks"和"PeakCaller"。 这个列表可以是dataframe，或者是从csv文件读取，比如： NOTE: 我用的数据是ATAC-seq数据，如果是ChIP-seq数据的话上面这个表里需要填写的内容会有些不同。具体请参考官网： https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf NOTE: 这一步有很多可选参数，我就直接用的都是默认值了，如果有特殊需要的，请参考 DiffBind官网说明书 。 使用peak calls的数据，可以生成一个相关热图，通过结合矩阵的每一行的相互关系给出样本的初始聚类: 下一步是根据每个样本的read计数(亲和力分数)计算一个带有分数的结合矩阵，而不是仅针对特定样本中call的那些峰(occupancy分数)计算置信分数。这些reads是使用 dba.count 功能获得的: 这里同样有很多参数可以选择，这里我只选择一个参数： bUseSummarizeOverlaps 。 这个参数会使得运行比较缓慢，但是是一个更标准的计算功能。如果你把它设置为TRUE，所有的read文件必须是bam，并且必须有其自己的索引文件（.bam.bai）。另外fragmentSize参数必须是缺省值。 结果如下： 这里添加了两个新列。第一个显示了每个样本的比对的reads的总数(“完整”文库大小)。第二个是标记的FRiP，它代表在峰的Fraction of Reads。这是共识峰集中与这个样品里某一重叠的峰所占reads的比例，可以用来表示总体上哪个样品富集程度更高。 这时可以画个PCA plot: 这时候的相关性热图就不一样了： 还可以画个MA-plot看一下： 这一部分你可以设置提取哪些组比较的差异结果，如果你只有两个组比较，就很容易，用默认值就好了。如果你的数据和我一样，我是4个组比较，上面提到就有6组比较组合，这时我可以设置提取哪两个实验条件的组合结果： metadata列显示了所有样本的平均read浓度(默认计算使用log2标准化read计数)和第4(four)组和第3(three)组中每个样本的平均read浓度。Fold列显示了DESeq2分析计算的两组之间的log Fold changes (LFCs)。正数表示four组的结合亲和力增加（对于ATAC-seq数据来说就是DNA的可接近性增加），负数表示three组的结合亲和力增加。最后两列给出了识别这些位点为差异位点的置信度，是原始p值和经过多次测试修正的FDR(同样由DESeq2分析计算)。 保存你的结果： 这时可以针对four组和three组的样品画PCA plot: 火山图： 把某两个组所有的差异峰用热图表示出来： 当然你也可以把所有的样品都画出来： 但是这里有一个问题，它把我的同一个Treatment的样品分隔开了。我尝试过调整列的顺序，但是貌似在 dba.plotHeatmap 这个函数里没有类似的参数可以调整。于是我试着用pheatmap将这个热图进行可视化。 使用pheatmap进行调整： 参考文章： 1. ATAC-Seq 差异分析 DiffBind 2. 第9篇：差异peaks分析——DiffBind 3. colorspace

把基因组长长的序列打断(shotgun sequencing)。短序列组装（Sequence assembly）几乎是近年来next-generation sequencing最热门的话题。简单来说，就是把基因组长长的序列打断(shotgun sequencing)。因为我们不知道基因组整条序列是如何排列（成一条链，最后成为一条染色体）组合（如何区分不同染色体）的，而我们又无法实现一次，把整条长序列完整测序（现在有单子测序可能是一个新的sunlight)。然后，我们通过算法，计算机的帮助，把这些短的序列组装起来成为一条完整有序的序列。

TRIMMED Sequence 截序列 按字意理解吧具体什么意思再询问高手吧

2014年7月2日，据国家食品药品监督管理总局官网消息，第二代基因测序诊断产品批准上市。华大基因成为首家CFDA批准无创产前基因检测上市机构。2014年6月30日，国家食品药品监督管理总局经审查，批准了BGISEQ-1000基因测序仪、BGISEQ-100基因测序仪和胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（联合探针锚定连接测序法）、胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（半导体测序法）医疗器械注册。这是国家食品药品监督管理总局首次批准注册的第二代基因测序诊断产品。 该批产品可通过对孕周12周以上的高危孕妇外周血血浆中的游离基因片段进行基因测序，对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征进行无创产前检查和辅助诊断。

随着学科的发展，目前许多研究都涉及高通量数据分析 (high throughput data analysis)。比较常见的是测序结果分析，例如RNA-seq、CHIP等等。 众所周知，数据分析是高通量测序应用于生物研究最关键的步骤，分析不好，得到的海量数据无异于一堆垃。

ATAC-seq ,英文全称Assay for Targeting Accessible-Chromatin with high-throughout sequencing。用于研究染色质可及性/开放性的方法。 一、什么是染色质可接近性/开放性？ DNA与组蛋白结合后形成核小体，核小体再进一步折叠压缩后最终形成染色质。DNA的复制和转录都需要 将染色质紧密结构打开 ，从而 允许调控因子结合DNA 。这部分被打开的染色质，就叫开放染色质区域（Open Chromation region, OCR ）。开放染色质允许调控因子结合的特性称为染色质的可接近性（Chromatin Accessibility）。 二、原理 转座子：一段可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用的DNA序列。 转座酶：能把转座子从相邻序列中脱离出来。 极活跃的Tn5转座酶 能 将测序接头插入到染色质可接近区域 。而染色质其他区域和组蛋白紧密结合，以核小体的形式存在，转座酶不能作用于非开放区域。之后再通过 测序分析 ，可得到开放染色质信息。 注：开放与否由激活子 promoters、增强子enhancers和其他调控元件regulatory elements以及是否能与转录机器accessible to transcription machinery 接触决定。染色质的压缩与动态的表观遗传密码有关：DNA甲基化、核小体位置、组蛋白结合以及修饰、转录因子、染色质重塑复合物和非编码RNA。 测序结果 可以用于判断区域的可接近性是否增加，也可以看转录因子结合区域和核小体的位置。 三、步骤1、准备细胞（计数、裂解） 2、转座反应与纯化 3、PCR扩增 4、qPCR(构建体系、运行、计算CT值) 5、文库质量控制：凝胶电泳（凝胶电泳的替代方法:生物分析仪） 四、与ChIP-Seq的不同 ChIP-Seq原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段 ，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。 ATAC-seq是 全基因组范围 内，找出所有的OCR。

将序列SEQ_TEST的下一个值 赋给新插入数据的id

SEQUEL awake承接前作SEQUEL blight的剧情。故事发生在blight的时间线之后。玛娜依然是不可或缺的至高资源，然而，邪恶的，偏离了世界的道理与法则的存在，却试图将玛娜从这世界上消除??为着拯救世界而前行的主人公，由于某种缘故再次失去了记忆，在「奥拉德」的森林中与被称为「魔物女」的库卢哈相遇。为了寻找恢复记忆的方法，主人公与可靠的同伴们一起，展开了在魔物之国帕尔革多的冒险之旅。随着旅途的进行，蛮族的皮丽拉，阴阳之徒的纳兹娜，甚至还有被称为科尔玛娜的阿尔玛，诺修，蕾库，茜拉，以及吸血鬼玛丽亚，工口兔伊阿妮都相继成为了同伴。然而，来自认识的外侧，偏离了内外两侧的法则与道理的充满恶意的存在，正悄然向这个平静的世界伸出魔爪??

下载的时候文件出错了吧？重新下载试一下。

每一个开始只不过是一个后续 故事其实已经开始了 没有前后文 开始不代表开始 只是结果的后续 大概是人生早已经开始

1.Welcome 2 Hell2.Fast Lane3.The Reunion4.Above the Law5.I"m On Everything (feat. Mike Epps)6.A Kiss7.Lighters (feat. Bruno Mars)8.Take from Me9.Loud Noises (feat. Slaughterhouse)以下两首为豪华版（Deluxe Edition）的歌曲10. Living Proof11.Echo

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《Home as Found. Sequel to Homeward Bound""》（Cooper, James Fenimore）电子书网盘下载免费在线阅读链接: https://pan.baidu.com/s/1fw_kQ7j-bBMJsbB7v1w1zA 提取码: 2qmp书名：Home as Found. Sequel to Homeward Bound""作者：Cooper, James Fenimore页数：522内容简介：AA by BB.Home as Found. Sequel to Homeward Bound"" by Cooper, James Fenimore。

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《SequelKludge》1.0攻略不知如何解决，为此小编给大家收集整理《SequelKludge》1.0攻略解决办法，感兴趣的快来看看吧。《SequelKludge》1.0攻略小tips：这作没有锁个人线，通关后可以随便选女角了！好耶！本作不再有转生系统，相对的特定剧情之后等级解锁至150。结婚戒指素材是宝箱娘最后那张15000AG的卷给的，刷AG去封印的洞穴打素材合小道具卖。后期刷钱可去机神遗迹1层的门卫刷，一次1000。虽然已经算得上传统艺能了：只要你状态不带叉，粪炸弹解万物，什么主啊，成圣者啊，机娘啊，打不过就朝对面扔屎。不改难度通关cg房会送个宝箱娘大草原的45条羽毛我真的懒得一一去写了。工作量会死人的。主线细节具体看任务描述，大方向上总结个比较顺手的流程：跑主线-开到Colony那个国家南部的大草原地图，躲着怪拿风祈系武器和尽量多的白色羽毛，羽毛越多能力越高，这些武器可以用到主线毕业-于是主线就毕业了-去大草原下面的村子接劝诱任务开启大草原左边的道路，然后拿齐情报回大草原入口交差开启右下区域，进去找鸡房杀鸡练级-打三机神-打最终兵器三机娘最后再看看你要不要挑眼镜的电子机神遗迹，极其费事又吃力不讨好。旅途轨迹：冒险：走剧情完成事件就能全拿到。战果：1.杀一只地区boss；2.体感上大约杀掉100只地区boss；3.打败训练鸡（每回合回5w血）；4-6.打败三只最终兵器机娘；7.完成主线特殊：1.完成一个事件；2.完成多数事件；3.招募一个伙伴到基地；4.买下并使用基地宝箱娘的各种交流卷；5.败给任一机娘；6-11.各角色交流等级到5；12.任一角色欲情到100；13.将戒指送给一位可攻略角色（交流等级5好感可能要200？）胖次：ディ_タ、ユ_ベイル、ヴァイナ：推进好感剧情就能在附近获得ヨルナヤ、クゥ：欲情到100+对话选择榨金后榨一次选退出然后被追击ルジカ：欲情到100+ 厕所走廊泛用H（黄色气团）ファリア：欲情到100+休息室泛用H（黄色气团）看来鼠娘就是连体紧身衣打底了各角色分析：ディ_タ：延续传统无法换人的女一号位。作为明面上的女王角色，捆绑的cd变短了还能用技能去掉捆绑耐性，群控性能优异，debuff面也不错还能带点输出。クゥ：本作亲儿子二号，作为群奶角色同样是换不下来的位置。堆闪避甚至能堆到物理100%。素早在后期能提得非常高，配合部分非常规技能能打出脱离常识的伤害.......ヨルナヤ：物攻主C定位，系统比较简单总之就主要堆攻击力就行了。ファリア：魔攻定位，魔法伤害倍率不高但是相对的辅助系技能倍率高，另外退魔之瞳以及延长de/buff时间也有实用价值。ユ_ベイル：坦克定位，挑衅拉伤害给其他角色创造输出环境，自身有两种无伤手段但也不是万能还要看对方速度，配合伪娘的先后手奶和复活安心感杠杠的。ルジカ：万用型，什么都沾点甚至没有武器技能限制毕业武器也可以随便拿。攻击面算凑活，最大的亮点主要在群体生存能力上。后日谈boss：三机神钢之风：弱点是雷属性。特殊状态冻结是aoe攻击且在被冻住后随便碰下基本就没了，不过很没牌面的是药和魔法都能去除该异常状态，戴上リボン也能免疫。大雷神像：弱点是火属性。攻击会造成感电状态持续掉血降速并附带麻|痹。该boss某攻击会打断嘲讽并攻击其他角色。第六回合进入高杀伤模式，建议把捆绑留到这里用并去除其攻击大buff。重火机龙：弱点是冰，重火机龙的赤热也能用冰属性攻击解掉。该boss不但攻高而且会施加黑暗和スタン异常状态,飞天后会用高伤aoe，实在扛不住就用捆绑熬过去或者防御一回合。秘匿神イデア刷到150才去打的，不过看后面的对话估计是弹性难度，装备好的情况下低等级打说不定还简单点。由于只能打一次具体有什么异常状态已经记不清了。机制是31回合强制失败的DPS测试，イデア会每四五回合在物理无效和魔法无效之间切换状态，我方的特殊行动能主动使其切换状态。配队推荐全队要么全堆物理输出要么全堆魔法输出，然后只挑着一种状态打切换了就再强制切回来。最终兵器红机娘：异常状态有忘却，麻|痹，スタン。有单体秒人技。情报说是对有不具合对象状态的攻击力高，不过把对面的攻击大buff去掉后感觉也就那样，做好异常状态对策可以不管不具合状态直接打。紫机娘：回合开始确认下角色状态图标，该回合有行动解析剩余回合就-1，紫机娘扫描也-1，选择防御则解析剩余回合+1，回合到零就会被定住直到被打。推荐先专心防御撑个十几二十回合把解析回合拖上去就可以打得比较舒服了。记得做混乱和黑暗对策。蓝机娘：一看到对面冒再构筑状态就连给她两记粪爆弹，要两记，另外做好睡眠对策。※机娘系列道具特定数值加得比青字毕业套还猛，同时伴有其他能力下降，视情况有时候比毕业套管用。打完三机神后会开放眼镜娘的电子机神遗迹，从这里开始就是纯粹的刷子时间，刷素材拿来造更牛逼的装备打更牛逼的boss，敌人就几个没有成就没啥剧情通关最终也就象征性地送你一个纪念道具，所消耗的时间比通一遍SK还长，不推荐绝大多数人碰。前三层守卫没啥好说的，打不过明显就能感觉到是装备的差距，老老实实打素材强化装备就是了。从这里开始老被一招秒的话就要注意稍微垫一些血量上去了。强化后的三机神攻击力比较吓人，好在属性依然可以针对，部件能减20%对应属性伤害，装饰品能减50%不过只有一个。优贝鲁的雷付与和雷装甲算能派上用场了。里Boss合体机神纯粹是装备全部堆积到毕业套才刚好能站住的水准，而且220w血第30回合（实际能行动的是26回合）强制败北，每回合平均伤害要达到接近9w。有人已经通过小漏洞2回合给秒了，不过这里还是从正常攻略的角度来分析。攻击方面普攻会用三机神的各种攻击手段甚至会打断嘲讽状态，没垫血没上buff基本上一下就撑不住了。好消息是该boss行为是固定的可以通过背版来提前对策。第4，13，24回合Boss会用反重力生成两个方块空掉一回合并打乱角色与boss之后的行动顺序，该方块还会每回合都给我们上一个反重力buff，有这个buff我们接boss的重力波收到5000的不可回避固定伤害，没有的话则是500000，所以这些方块在重力波的回合前就弄死是不行的。重力波在第9，17，19，28回合。另外5，8，14，16，25，27回合有大伤害aoe，建议用捆绑抵掉其中两次避免三回合里挨两下。2，11，21回合为范围物理AOE伤害，其他回合基本都是物理单体攻击。下面谈下个人的配装。阵容方面女主跟伪娘的奶是雷打不动的，坦克方面鉴于AOE较多，ルジカ的护盾和防御大以及持续回血更让人安心，也能把其他角色的防御配装略微换到攻击上去，有罩子有buff的情况下全队血量维持在13000算是能挺下去的程度（以不防御站着接大伤害AOE为标准），于是每人发了跟猎犬强化管+1撑血。接下来就尽量追求高输出了。顶配装备下女主部件用とげとげパ_ツ（回合末减敌方1%最大血量），诅咒残渣+1（防御大down）。前两部件在创伤aoe和大多攻击下都能触发。伪娘这边还是比较纠结的，用钢之风+1和紫机娘之心撑素早狠心点能加到3000+输出甚至能追过主C，但相对的魔防力会很扯群补变得很_，而且素早低的奶有兜底优势不怕有人滑跪。权衡下还是把素早提到2700当作双C用，运气不好可能就跪了。ヨルナヤ为追求攻击装饰品用了恶鬼守护+1和疫病守护+1，感觉还是太贪了应该把恶鬼换成顶配机娘心的，血太薄还是跪了一次再拉起来浪费了输出。疫病守护+1的每回合TP回20再加上被攻击和看戏环节使之能基本维持200攻加连系1，TP50的蓄力和TP50单体500攻击的循环。部件用了重火机龙+1加攻，骸之圣辉+1充血量。ルジカ这边就纯粹是生存装了，确保能及时续上群体防御大，罩子和多回合群补。中期因为主力滑跪摸了三回合鱼最后第28回合勉强拿下，感觉阵容可以调得再稳一点，但不想再打第二次了。

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将TNT集体密集。TNT密集了，主要是数量就达到了，可以和岩浆同用，效果很明显。

sequel awake送礼+15好感总结貌似还没有一个总结帖呢。。。顺便一提我暂时还没有发现库鲁哈和玛利亚的+15礼品有趣的古书“克拉尔” 光彩夺目的饰品“诺修” 西式餐点“蕾库” 蛮族烤鱼“皮里拉”（会被其他人吐槽味道诡异） 花束“纳兹娜” 木质雕像“茜拉”（会被其他人吐槽雕得太难看） 高热量套餐“阿尔玛”（会被其他人吐槽肉太多下不去嘴）地狱辣饼干确定没人喜欢，是用来开玩笑的，便便似乎也没人喜欢（谁会喜欢便便啊！）是用来开玩笑的，卖了吧黑酒没什么人特别喜欢目前只尝试了一部分礼物。。。希望已经通关的大佬能做个补充

因为系统默认输入法的原因，对输入法进行设置即可1、在语文栏上单击右侧的小三角，在弹出的对话框中单击逗设置地2、选择一种中文输入法，然后单击右侧的逗上移地，移至顶端后逗确定地即可。

用怪物的火球点燃两边的火把

幻之庭（在你图背后这条路进去），然后右下角一个洞，进去就是阿姆鲁珐伊。或者从罗尼斯的墓走出来，右拐

Hell: The Sequel是由两名美国hip hop歌手Eminem和Royce da 5"9组成Bad Meets Evil组合演唱的。于2011年的6月13号发行，该专辑以171,000的销量登上了美国公告牌（Billboard）的首位。

铁之都防御系统密码1号2 2号8 3号7 4号3 5号128731

可能程序不兼容， 可以更换个版本试试。另外建议参考下程序对配置的要求。或者右键需要运行的程序 选择兼容性 用兼容模式运行试试。

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暂时没有呢。Sequel Ace 是长期使用的 MacOS 工具 Sequel Pro 的续集,Sequel Pro 是一款许多开发人员管理 MySQL 和 MariaDB 数据库的热门应用。Sequel Ace 作为流行的 Sequel Pro 应用的分支举起了火炬 (Sequel Pro 本身就是 CocoaMySQL 的分支)。不知道您是否注意到，Sequel Pro 最近变得有些不稳定，经常崩溃，开发人员通常会蜂拥使用其他应用程序。

1.在dos下运行mysql -u root -p 注意最好在mysql.exe所在目录下运行 mysql -u root -p 123456 show databases 列出所有数据库 看看mysql是不是真的运行起来了 2.用你的代码看看php是不是能连上正常运行的msyql 如果连不上,看php_mysql.dll 文件不没有 undefined function mysql_pconnect() 是说没有这个函数, 这是php_mysql.dll 里提供的函数 php5好像是用php_mysqli.dll extension=php_mysqli.dll 然后是那么你的mysql版本是？如果是3.x，那么将该目录下的my-example复制到c盘根目录下，并重命名为my如果是4.x，将该目录下的my-*（指任意一个）复制到c盘根目录下，并重新命名然后编辑这个文件，修改相关的路径

Mac OS X 原生的应用工具Sequel Pro是一款管理 Mysql 的工具也就是说你们的数据库是mysql，Sequel Pro是mysql的管理工具，老板让你备份的是mysql的数据库，备份mysql的工具有很多，你可以用Navicat Premium由于我这边没有mac环境，没法给你测试Sequel Pro，因此给你推荐Navicat Premium

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食品级的SEQUEL盘根符合FDA标准，是食品行业的理想产品。它成功应用于巧克力、制糖和食用油等场合同时还广泛应用于制药行业，特别是在混合搅拌机上使用效果特别明显。PH值0~14的环境中不受绝大部份化学物质腐蚀；且不老化； 它的特心性和戈尔公司的GFO盘根相似，只是它常用于一些对颜色比较敏感的应用场合。 1. 在PH值1~14 2.适用温度范围为 -240℃~ +288℃; 3.热传导性能是普通聚四氟乙稀的

SEQUEL blight、SEQUEL awakeS、EQUEL awake首部《SEQUEL blight》于2017/03/01发售。故事描述了主人公与伙伴们在将玛娜视为不可或缺的、代表着至高无上的资源的世界中冒险的故事。因其画风独特、音乐优美、故事精美且耐人寻味而倍受好评。背景在SEQUEL系列的世界里，生命之源——玛娜是不可或缺的，代表着至高无上的资源，可以制成食物、药品和能源。获取玛娜的方法有三种，第一是杀害他人——生命终结时，玛娜之力会残留下来；第二是自然发生的玛娜；第三则是从男性的体液中抽取。在物资不断枯竭殆尽的现代，玛娜日益稀缺，因此主人公与伙伴们踏上了一边寻找马娜一边拯救世界的冒险之旅。历代剧情1、SEQUEL blight在SEQUEL blight的世界里，生命之源玛娜是不可或缺的，代表着至高无上的资源、食物、药品。获取玛娜的方法有三种：第一是杀害他人生命终结时，玛娜之力会残留下来；第二是自然发生的玛娜；第三则是从男性的体液中抽取。在物资不断枯竭殆尽的现代，玛娜日益稀缺，因此拉比踏上了寻找玛娜的旅途。失去记忆的男主人公，在一个废弃的设施内与前来收集玛娜的拉比邂逅，之后为了寻找生命之源玛娜，便展开了在贝蕾特里亚的冒险之旅。随着旅途的进行，乌菈、尼克丝、缇蕾玛相继成为了同伴，但是贝蕾特里亚三大势力之一的贤人众的阴谋，又将主人公与伙伴们卷了进来。2、SEQUEL awakeSEQUEL awake承接前作SEQUEL blight的剧情。故事发生在blight的时间线之后。玛娜依然是不可或缺的至高资源。然而邪恶的，偏离了世界的道理与法则的存在，却试图将玛娜从这世界上消除。为着拯救世界而前行的主人公，由于某种缘故再次失去了记忆，在「奥拉德」的森林中与被称为「魔物女」的库卢哈相遇。为了寻找恢复记忆的方法，主人公与可靠的同伴们一起，展开了在魔物之国帕尔革多的冒险之旅。随着旅途的进行，蛮族的皮丽拉，阴阳之徒的纳兹娜，甚至还有被称为科尔玛娜的阿尔玛，诺修，蕾库，茜拉，以及吸血鬼玛丽亚，工口兔伊阿妮都相继成为了同伴。然而，来自认识的外侧，偏离了内外两侧的法则与道理的充满恶意的存在，正悄然向这个平静的世界伸出魔爪。3、SEQUEL colonySEQUEL colony依然承接前作SEQUEL awake的剧情。故事发生在awake的时间线之后。男主角与前作为同一人。为了完成与奥拉姆商会成员贝利尔·格里莫特的约定，前往传说中被诅咒的岛国“希斯玛”展开冒险。随着冒险越发深入，主人公与伙伴们将会逐步驱散笼罩在希斯玛的疑云。从扑朔迷离的层层迷雾中揭开那些被有意隐藏起来的黑暗历史。3、SEQUEL kludgeSEQUEL kludge承接前三部的剧情，而剧情的舞台来到了“伐斯塔斯”——据说这里是一个下着死亡之雨，由机械统治的、没有生灵存在的国度。主人公被不明的机械人形绑架到了一列驶向伐斯塔斯的列车上，不仅与昔日的伙伴失联，就连一直伴随在身边的戴亚也不见踪影。等待他的，将是怎么样的命运？

spin-off 英 [spu026an u0252f] 美 [spu026an u0254:f] n. 副产品; sequel 英 [u02c8si:kwu0259l] 美 [u02c8sikwu0259l] n. 继续; 续集，续篇; 结局，后果; 余波;

某皮具品牌 澳洲有卖 印度产

redo threadThe redo generated by a database instance.(通常情况下每个实例一个thread）log sequence numberA number that uniquely identifies a set of redo records in a redo log file. When the database fills one online redo log file and switches to a different one, the database automatically assigns the new file a log sequence number.（算是redo的序列号吧，从1开始计数）

把模块从FTM模式变为在线模式

个人理解应该是监狱代号吧，就像周星驰的8523之类的监狱里用来称呼犯人的代号。个人理解，仅供参考

你是本科毕业生吧可以申请的他们原来分成master和 master after master但是回中国的话都是硕士同等学历

consequence-free 没有后果的pander迎合，奉迎，投其所好interest在这里应当是“利益”的意思， interest group 利益集团。luxury: an advantage that you do not often have(不常有的优势）enjoying the luxury of consequence-free pandering to every attractive interest group that came to lobby them是现在分词短语作伴随动作，其中that came to lobby them是定语从句，修饰group，that在从句中作主语。句子的主体是Lib Dem MPs now know the feeling of trudging through the division lobbies to keep a government in power while police and protestors skirmish in the streets outside。这句话的翻译仅供参考：讨好每一个前来游说他们的，很有吸引力的利益集团而没有任何后果，这是一种优势。在几十年的对抗之后，自由民主党的议员们在享受着这种优势的同时，也体会到了在各自独立的游说团体之间进行斡旋以使政府能在警察与抗议者进行街头冲突的时期仍能保住权力的滋味。

就是《语言学》里的同化规则、序列规则、和省略规则。

Girls and boys主语 learn谓 to live and work together from an early age宾 and 【are consequently 副词(可提前到are前：状语修饰谓语) not emotionally副词（状语修饰谓语） underveloped并列谓语（被动语态）】 in their relations with the oppsite sex状语.

Abstract Deep sequencing has been revolutionizing biology and medicine in recent years, providing single base-level precision for our understanding of nucleic acid sequences in high throughput fashion. Sequencing of RNA, or RNA-Seq, is now a common method to analyze gene expression and to uncover novel RNA species. Aspects of RNA biogenesis and metabolism can be interrogated with specialized methods for cDNA library preparation. In this study, we review current RNA-Seq methods for general analysis of gene expression and several specific applications, including isoform and gene fusion detection, digital gene expression profiling, targeted sequencing and single-cell analysis. In addition, we discuss approaches to examine aspects of RNA in the cell, technical challenges of existing RNA-Seq methods, and future directions. WIREs RNA 2017, 8:e1364. doi: 10.1002/wrna.1364 For further resources related to this article, please visit the WIREs website. FIGURE 1 Methods for strand-specific RNA-Seq. (a) Ligation of the 3′ preadenylated and 5′ adapters. “xxx” indicates barcode. (b) Labeling of the second strand with dUTP, followed by enzymatic degradation. (c) The Peregrine method involves template-switch attachment of the 3′ adapter. (d) BrAD-Seq captures the 3′ adapter by taking advantage of terminal breathing of double-stranded DNA. Targeted RNA-Seq by target capture. (a) The Capture-Seq method is based on capture of regions of interest by hybridization of RNA-Seq libraries to DNA oligonucleotide probes. (b) TARDIS is based on hybridization of input RNA to DNA oligonucleotide probes. The enrichment step is followed by the construction of a directional RNA-Seq library by ligation of 3′ and 5′ adapters. Targeted RNA-Seq by amplicon sequencing. (a) PCR method using gene specific primers with overhangs containing sequences for common primers. (b) PCR methods using a pair of gene-specific primers followed by ligation of adapters with sequences necessary for sequencing. (c) Archer methods for detection of gene fusion. Sequence for a common primer is introduced by adapter ligation and is followed by nested PCR with gene-specific primers. MBC, Molecular Barcoded. (d) Detection of the TCR variable region. The sequence of a common primer is introduced during reverse transcription, and RT is followed by nested PCR with gene-specific primers. (e) Digital encoding of targeted mRNAs. Reverse transcription will introduce molecular indexes and sequences for common primers. Nested PCR follows, where gene-specific primers capture targeted sequences. RNA-Seq of single cells. (a) Reverse transcription with oligo-dT primers and a universal primer sequence is followed by poly(A) tailing. After PCR amplifications, standard RNA-Seq libraries are prepared. (b) Reverse transcription incorporates a universal primer sequence. Template switching of reverse transcription is followed by annealing of the oligonucleotide with the sequence for a second PCR primer. (c) cDNA synthesis introduces the T7 promoter sequence at the 5′ end. After second strand cDNA synthesis, cRNA copies are generated by in vitro transcription. Finally, the second adapter is ligated to the 3′ end of the cRNA and libraries are constructed by PCR amplification. (d) Single-cell MALBAC RNA-Seq. Primers with seven random nucleotides at the 3′ end are annealed to cDNA and extended. Amplicons are looped to protect them from being further amplified. Ten cycles of quasilinear amplification are followed by exponential PCR. 原文： RNA-Seq methods for transcriptome analysis.

记录一篇2019年Wulff实验室发表在NBT上的一篇关于R基因克隆方法——AgRenseq的文献，由于还未吃透，暂做简单记录。 驯化和快速育种导致作物多样性降低，单个R基因导入作物中费时费力而且抗性很快会被病原克服，而同时导入多个R基因则可避免上述情况，但是目前R基因克隆的方法要求分离或突变后代的产生，这对于有着难以分辨性状的近缘野生种属更难实现。GWAS可以关联性状至基因，但是受参考基因组的影响（如目标基因来自外源渗入片段，而参考基因组无此片段），而Kmer-GWAS则可以不依赖于参考基因组而实现。在本文中作者利用Kmer-GWAS与RenSeq技术发明了一种新的快速鉴定克隆R基因的方法——AgRenSeq AgRenSeq to engineer disease resistance Discovery and cloning of diverse R genes (colored dots on vertical chromosomes) in a germplasm panel (far left) allows the rapid engineering by transformation of a multi-R gene stack with zero linkage drag (R1 to R4, top right) or facilitates incorporation and stacking of R genes into elite lines and reduction of linkage drag (colored bars around R genes) by multiple backcrossing and marker-assisted selection (MAS; bottom right). AgRenseq原文 AgRenseq方法步骤

1）it may be prove difficult or impossible 这是主句,系表结构；2）it是引导词,引导后面两个动词不定式to stablish和 to answer3）to establish for a successful revolution a comprehensive and trustworthy picture of those who participated 中for a successful revolution 是状语,picture of those 是establish的宾语,who participated是定语从句,修饰those4）to answer even the most basic questions one might pose concerning the social origins of the insurgents中one might pose 是定语从句,concerning the social origins of the insurgents是后置大于,修饰questions整句翻译：因此,要为一次成功的革命建立参与者全面而可信的描述,或者回答人们可能提出的、有关起义者社会起源的哪怕最基本的问题恐怕是困难的,或者甚至是不可能的.

示例结果可以看： https://www.dropbox.com/s/sn8drmjj2tar4xs/ChIPQCreport - full dataset.zip?dl=1 首先映入眼帘的是总体报告： 其中有一些指标见过，一些没见过，像是SSD, RiP and RiBL这几列就是ENCODE计划提出的指标。就是评估了信号的分布，在富集区域、整个基因组、已知的artefact regions 总而言之，这些全部的指标可以分为4类： 切记：通过这些指标也不意味着实验就是成功的，相反亦然 包括了：read depth, read length, duplication rate 如果read depth, read length在样本间差异很大，就要引起注意了 由于之前已经过滤掉了重复reads，所以这里的duplication rate没什么用 包括了RiP, SSD, and RiBL 也叫FRiP，表示：the percentage of reads that overlap ‘called peaks"，也就是peaks包含的reads数占reads总数的百分比 可以理解成：信噪比（signal-to-noise） 根据感兴趣蛋白（POI，protein of interest）的不同，RiP值也差异较大： 上面图中看到，Nanog比Pou5f1的RiP值要高，而Pou5f1-rep2更是低的可怜，可以说明的是：Nanog样本富集效果更好 有两张图可以反映： 不过看箱线图发现，虽然Nanog的RiP较高，但这个分布和Pou5f1也相差太远，推测可能与read length 、 depth有关 表示基因组中信号值的标准差，可以反映reads在基因组中覆盖度一致性，越大越离散，就是高的越高，低的越低 我们希望看到：IP样本中这个值较大，说明富集区域信号很强 ，非富集区域信号较弱，因此它的标准差很大；而control样本最好就是标准差较小，不要有太大的波动 SSD值高虽然说明有的区域信号强，但不一定是ChIP的富集区域，一些blacklist区域也会存在较强的信号 【关于blacklist：】 我们这里的数据显示：Pou5f1比Nanog的SSD值要高，可能说明Pou5f1的富集效果更好，但不能确定，因为还需要确定Pou5f1的SSD高不是由于未知的artifact造成 有一张图可以反映：Coverage histogram 好的富集结果一般是：有一条尾巴（依然存在很多位点具有较高的测序深度）；而像input样本这种低富集的，主要是包含背景，因此它的y轴很高，同时x轴很低 我们这个数据集中，尤其是 Nanog rep2样本，具有更粗壮的尾巴（Heavy tail，意思就是在曲线以下具有更大的空间） 。Nanog样本具有更多高深度的位点 综合考量： Pou5f1的coverage不如Nanog，但SSD高于Nanog。说明Pou5f1存在某一块区域深度较高，但不是整体都高，可能存在blacklist区域 那么是否真的存在blacklist区域呢？还有再看一个指标： 也就是与已知blacklist有交集的reads占比。这个值越低越好 黑名单区域一般也是唯一比对，因此常规的去重复操作对它无效。这些区域一般是：着丝粒，端粒和卫星重复序列 黑名单区域的危害是：confound peak callers and fragment length estimation，因此需要追踪并去除比对到这些区域的reads 我们的数据中，RiBL的比例看上去还比较合理，并没有出奇的高。因此高SSD可能是因为存在更多容易破碎的开放染色质区域，或者存在hyper-ChIPable区域，与很多不相干的蛋白也能产生富集，导致假阳性 当然，如果 在peak calling之前去掉了黑名单区域，就没必须分析RiBL了 主要包括：FragLength and RelCC（又称Relative strand cross-correlation coefficient or RSC） 一般，RelCC在所有的ChIP样本中大于1，表示具有较高的信噪比；FragLength也应该与文库制备过程中设定的片段长度接近 一个高质量的ChIP实验，会在POI附近形成非常显著的reads富集，会在正负链发现双峰分布 Cross-Correlation scores的计算：Pearson"s linear correlation between coverage for each complementary base. These Pearson correlation values are computed for every peak for each chromosome and values are multiplied by a scaling factor and then summed across all chromosomes，就是先在正负链生成两个向量，表示某个碱基位点的reads数量，然后求这两个向量的相关性，并逐渐沿着shift size移动，最后得到一个相关性表 最后这个cross-correlation值算好，就会画在y轴上，x轴就表示shift size <img src="https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-06-20-120928.png" alt="image-20200620200928712" /> 一般这个cross-correlation plot会产生两个峰： 我们这里的数据中，Nanog 和 Pou5f1都能看到两个峰： 它就是根据cross-correlation的最大、最小值计算的 RSC值低可能是由于ChIP的质量差、测序reads质量差导致错配多、测序深度不够【其实可以理解为：RSC值低=》就是相关性计算的值低=》正负链没有足够的reads =》 也就是上述原因】 另外，数据集的结合位点太少（比如小于200）也会导致低的RSC【这个也很好理解，结合位点少，更别提位点正负链富集的reads数量了】。结合位点少的原因可能是生物因素（比如某一个因子在某一个特定组织中就这么几个位点） Cross-Correlation Plots的例子 强信号： 下面这个例子是人类细胞的CTCF 转录因子(zinc-finger transcription factor)。使用一个好的抗体，转录因子一般会富集45,000 - 60,000个peaks。红线表示真正的peak，蓝色线表示read length 弱信号： 抗体不是特别有效，得到的峰也比较分散，在185-200bp间存在真的峰，另一个蓝色则是read length。对于弱信号的数据，read-length peak将占据主导地位 没有信号： 表示实验失败或者input样本，基本看不到fragment length这个峰 也就是在特定的结合位点附近，没有富集到reads 将peaks与基因组注释结合起来，看看reads主要富集在哪些区域 我们的数据中，“Promoters500” and “All5UTRs”的富集程度最高，也符合预期（Nanog和Pou5f1作为转录因子应该结合在这块区域） 这个形状根据抗体的类型存在差异：transcription factor, histone mark, or other DNA-binding protein such as a polymerase

安装路径问题，你不能按默认的路径安装，除非那个插件可以自动侦测到该安装到哪儿。X:/program files/adobe/adobe after effects/supports files/plug-ins(X为你的AE安装盘符)拜托以后先搜下别人的答案再问问题!

motivated sequence激励序列-----------------------------------如有疑问欢迎追问！满意请点击右上方【选为满意回答】按钮

<sequence id = ID maxOccurs = (nonNegativeInteger | unbounded) : 1 minOccurs = nonNegativeInteger : 1 {any attributes with non-schema Namespace}...>Content: (annotation?, (element | group | choice | sequence | any)*)</sequence>特性id该元素的 ID。id 值必须属于类型 ID 并且在包含该元素的文档中是唯一的。可选。maxOccurs序列可出现的最大次数。该值可以是大于或等于零的整数。若不想对最大次数设置任何限制，请使用字符串“unbounded”。可选。minOccurs序列可出现的最小次数。该值可以是大于或等于零的整数。若要指定该序列组是可选的，请将此属性设置为零。可选。元素信息出现次数在组内为一次；否则为无限制。父元素group、choice、sequence、complexType、restriction (simpleContent)、extension (simpleContent)、restriction (complexContent)、extension (complexContent)内容annotation、any、choice、element、group、sequence示例以下示例说明一个元素 (zooAnimals) 在 sequence 元素中可以包含下列元素的零个或多个：elephant、bear、giraffe。XML<xs:element name="zooAnimals"> <xs:complexType> <xs:sequence minOccurs="0" maxOccurs="unbounded"> <xs:element name="elephant"/> <xs:element name="bear"/> <xs:element name="giraffe"/> </xs:sequence> </xs:complexType></xs:element>

转录因子的chip-seq不一定需要qpcr验证，但如果对转录因子进行敲除或knockdown，又不愿意做chip-seq，可对靶基因进行chip-qpcr。做western如果是转录因子，作用位置应该在核内，但有一些TF是细胞质易位到细胞核，所以看你关心的是总量还是什么，是否存在特殊修饰等等，根据需求选择。

最近和很多小伙伴聊到ATAC-seq这个组学技术，正好趁此机会学习分享一下。 要想知道ATAC-seq的作用，首先必须知道染色质的结构，以human为例，有一定molecular biology背景的人都知道，人类的DNA并不是裸露的，长度惊人的DNA链是以一种特殊的结构被“收纳”在细胞中的：DNA缠绕在组蛋白上，形成串珠式的结构。这样的结构还能够进一步折叠、浓聚，并在其他架构蛋白的辅助下，进而形成染色体。 新的问题在于，这样的高级结构必然会导致转录的难以进行，那么细胞如何调整来进行正常的转录呢？答案就在于 染色质重塑 （chromatin remodeling），染色质重塑是通过对染色质结构的动态修饰，从而允许凝聚的基因组 DNA 与调控转录机制的相关蛋白相互作用，从而控制基因表达。[1]基于这样的调控机制，可以将染色质分为两类： 常染色质 （松散或开放染色质，euchromatin）结构可用于转录； 异染色质 （紧密或闭合染色质，heterochromatin）结构更紧凑，不易进行转录。 基于上面的描述，我们如何对基因组上不同的染色质结构进行研究呢？ATAC-seq给了我们这样的机会，ATAC-seq全称 A ssay for T ransposase- A ccessible C hromatin using seq uencing，是一种在全基因组范围内评估 染色质开放性 的组学技术，是表观遗传学研究的重要方法，该项技术于2013年被斯坦福大学William Greenleaf教授团队开发，相关论文发表在 Nature Methods 上。[3] 转座子 （transposons）是基因组上的一种元件，它能够改变自己在基因组上的位置，具有“跳跃性”，这个生物学过程就是由转座酶介导的（transposase），Tn5就是一种转座酶。 已经有研究表明，在体外例如转座子更倾向于插入开放染色质区域。 [4]所以ATAC-seq利用这个特点，将测序所用adaptor加在Tn5转座酶上，这样Tn5转座酶就可以将adaptor添加到开放染色质区域的DNA两端，这样就可以对这部分序列进行测序了。（当然作者们对其可行性进行了一波三折的评估，包括将其与之前经典的染色质结构研究组学技术 DNase-Seq 和 FAIRE-Seq 结果的比较） 还有其它的技术能够实现这样的目的，它们分别是 DNase-Seq 、 FAIRE-Seq 和 MNase-seq *，原理相通~ Reference: [1] https://en.wikipedia.org/wiki/Chromatin_remodeling . [2] Xu J, Liu Y. Probing Chromatin Compaction and Its Epigenetic States in situ With Single-Molecule Localization-Based Super-Resolution Microscopy. Front Cell Dev Biol . 2021;9:653077. [3] Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods . 2013;10(12):1213-1218. [4] Gangadharan S, Mularoni L, Fain-Thornton J, Wheelan SJ, Craig NL. DNA transposon Hermes inserts into DNA in nucleosome-free regions in vivo. Proc Natl Acad Sci . 2010;107(51):21966-21972.

科电Teseq 特测 NSG3040A 工频/脉冲磁场抗扰度测试系统是用于CE应用软件的4 kV解决方案。在测试过程中可调节参数，是范围广泛的测试附件。该产品模块化, 可扩展系统。浪涌电压至4.4 kV。EFT/脉冲群至 4.8 kV/1 MHz。PQT 至 16 A/260 VAC & DC。该产品采用7“ 彩色触摸屏，方便使用。TA (Test 助手) 是快速测试解决方案。

科电Teseq 特测 NSG3040A 跌落、中断、电压变化抗扰度测试系统的应用标准是：IEC/EN 61000-4-5, GB T/17626.5, IEC/EN 61000-4-4, GB T/17626.4, EC/EN 61000-4-11, GB/T 17626.11, IEC/EN 61000-4-11，GB/ T 17626.11, IEC/EN 61000-4-9，GB/T 17626.9, IEC/EN 61000-4-8。该产品是用于CE应用软件的4 kV解决方案。

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科电Teseq 特测 NSG5500 汽车瞬变抗扰度测试系统是依据 ISO 7637-2:2004 标准的模块化测试系统，其中，MT 5511 瞬态发生器模块符合ISO pulses 1, 2, 6 和 variants，LD 5505 抛负载模块符合pulses 5a and 5b，FT 5530 快速瞬态发生器模块符合 ISO pulses 3a/3b and variants。

科电Teseq 特测 NSG435 20kV 静电放电发生器很不错。用户可编程放电电压200 V～16.5 kV。该静电放电发生器内置式IEC 61000-4-2符合性测试装置。采用电池供电。小型轻便结构。产品符合IEC/EN 61000-4-2标准。该产品的特点及应用：NSG 435自身具有由内部电池供电的高压发生器。除了由预编程产生标准的IEC脉冲之外，使用者也可以编制满足特定需要的测试程序，即采用使用者选择的放电频率和人工或自动极性切换功能，进行单次或重复放电。可选配电源直接供电适配器，电池在充电时可用它供电进行测试。

科电Teseq 特测 NSG4070C1 射频传导抗扰度测试系统的产品特点是：NSG 4070C1，即NSG 2070的改进版 — 多功能EMC抗扰度测试系统。NSG 4070C1具有广阔的频率范围（从9 kHz至1 GHz）、使用外部或内部放大器的模块结构，因此它的应用范围很广：包括按照IEC 61000-4-6进行的测试，ISO 11452-4大电流注入测试，军标GJB 151B中CS 114的测试，在IEC 61000-4-20、IEC 61000-4-21应用中作为测试系统的信号发生器和功率计等。

BCI是Baltic Capesize Index的英文缩写，是波罗的海海岬型船运价指数. 1999年的9月1日，波罗的海交易所将原来反映巴拿马型船和好望角型船的BFI (即现在的BDI )指数分解成BCI和BPI两个指数.SCC: The Standards Council of Canada. facilitates the development and use of national and international standards and accreditation services to enhance Canada"s competitiveness and social well-being. 加拿大标准委员会PRS产品规格书（Product Requirement Specification

经典的转录组差异分析通常会使用到三个工具 limma/voom , edgeR 和 DESeq2 。今天我们就通过一个小规模的转录组测序数据来演示 DESeq2 的简单流程。 对于 DESeq2 的分析流程而言，我们需要输入的数据包括： u200b 下面就以 mobData 中的数据为例简单介绍 DESeq2 的分析流程 u200b 由于 mobData 中的行名没有提供基因的ID，我们也不是为了探究生物学问题，就以 mobData 的行数作为其ID DESeqDataSet 是 DESeq2 流程中储存read counts和中间统计分析数据的对象，之后的分析都建立在该对象之上进行。 u200b 在进行差异分析之前，需要对样本数据的表达矩阵进行预处理，包括： u200b 通过PCA结果来看各组样本分组情况还是不错的，但hclust的聚类结果反映的分组就略微有点混杂了，可能要聚类计算的距离函数选用不当有关。 使用 DESeq() 函数进行差异分析时，该函数干了以下三件事： u200b counts() 可以提取 DESeq object 中的表达矩阵，而 results() 可以提取差异分析的结果，其中包括了： 样本间的均值, log2 fold changes, standard errors, test statistics, p-values and adjusted p-values. u200b 使用 results() 函数时需要指明进行比较的样本，这里用 contrast=c("group_list","MM","WW") 提取 MM 组和 WW 组进行差异分析的结果。如果想要比较 WM 组和 WW 组，只要改变 contrast=c("group_list","WM","WW") 即可。 u200b 检查结果中是否包含 NA 值 u200b 这里 padj 中有1142个 NA 值是因为使用 results() 提取差异分析结果时，大于 alpha 值（这里是0.1）的矫正后p-value都会被当做是 NA 。因此，我们将这些 padj 值都设为 1 排序后以 log2FoldChange 绝对值大于1， padj 小于0.05为条件筛选显著的差异表达基因 u200b 至此，便筛选出了 217个 在 MM 组和 WW 组之间的显著差异表达基因。至于后续的可视化分析则是因课题而异了，等以后有空了再补坑吧！ u200b 有同学可能注意到，虽然我们的样本有多个组，但在差异分析时进行的还是pairwise的分析，为什么我们不可以三个组一起分析呢？学过ANOVA的同学应该都知道，ANOVA就是可以应对这种多组差异分析的情况。但要注意的是，ANOVA只可以告诉我们对于某个基因在这三组中是否存在差异，想要找出是哪一组有其他组别有差异还是需要进行pairwise t-test之类的分析。所以，在这里我们两组两组地进行分析正是出于这个考虑，并且有更方便我们解释差异分析的结果，说明在A组基因的表达量相对于B组的是上调还是下调。另外，本文的差异分析还是处于单因子水平（只有一个变量），至于多因子的差异分析以后研究透了再和大家进行分享。 完。

证实结果

呵呵呵就是辛苦点借鸡生蛋囧的呼唤点解点解大金额家几点能到你男的女的你男的女的就看我女宝宝简单机械那你睡觉无奈觉得你学计算机男那些年聚众闹事你睡吧男的女的叫我姐姐你放假多久就地解决大姐二姐难道你是姐姐到南宁多久男的女的呢

后接名词或动名词

consequent 是结果的 或 多要加 on upon；即 consequent upon / consequent on例:control consequent upon self-employment对自顾的控制造成的如果。the introduction of colour TV and consequent multi-set use in many homes彩色电视的面世，造成家庭有多台电视的结果。Consequential 则是: 相因而生的； 相接连的； 有连贯性的例:Time passes, none of it consequential 时间不断地过去，但没有一样东西是连贯的。most consequential election in decades 十年来最具连贯性的选举。

consequent的意思是：随之而来的。consequent，英语单词，形容词、名词，作形容词时意思是“随之发生的，作为结果的；（河流、山谷）顺向的；合乎逻辑的”，作名词时意思是“（逻辑）后件，推断；（音乐）答句；分母”。This would be good news all round were it not for the consequent crash in banking confidence. 这对所有人来说都是一个好消息，但对于信心业已崩溃的银行业来说并非如此。Irregularities in the ionosphere result in signals travelling by more than one path and this can produce interference and consequent difficulties in communications. 不规则性在电离层导致信号旅行由超过一个道路和这可能导致干涉和结果困难在通信。The desire for further increases in cycle conditions and consequent increases in the cycle efficiency, led to the addition of steam reheat during turbine expansion. 对循环条件的要求进一步增加，和循环效率的最终提高，导致蒸汽在汽轮机膨胀过程中的再热量增加。

n. 结果adj. 随之发生的；作为结果的

随之发生的; 必然的，合乎逻辑的; 继起的; [地] 顺向的

seqkit的使用方法 seqkit github mp.weixin.qq.com/s/OJsxFR33ej0ACozNbF_dNA 参数如下： amplicon 通过引物检索扩增子(或其周围的特定区域) bam 检查和在线绘制BAM记录文件的直方图 common 通过id/名称/序列查找多个文件的公共序列 concat 连接多个文件中具有相同ID的序列 convert 转换FASTQ质量编码格式：支持格式包括：桑格，Solexa和Illumina duplicate 重复序列N次 faidx 创建FASTA索引文件并提取子序列 fish 使用局部比对在较大的序列中寻找短序列 fq2fa 转换FASTQ到FASTA fx2tab 将FASTA/Q转换为表格格式(包含长度/GC含量/GC偏好) genautocomplete 生成shell自动完成脚本 grep 通过ID/name/sequence/sequence motif搜索序列，允许错配 head 打印第一条序列 help 打印帮助信息 locate 定位序列，或者motifs，允许错配 mutate 编辑序列(点突变、插入、删除) pair 匹配双端序列文件 range 打印一个范围内的序列 rename 重命名重复序列ID replace 使用正则表达式修改名称或者序列 restart 重置环状基因组的起始位置 rmdup 通过id/名称/序列删除重复的序列 sample 按数量或比例对序列进行抽样 sana 清理损坏的单行fastq文件 scat real time recursive concatenation and streaming of fastx files seq 转换序列(反向，补充，提取ID…) shuffle 随机序列 sliding 序列滑窗提取，支持环形基因组 sort 按id/名称/序列/长度排序序列 split 按id/seq区域/大小/部件将序列拆分为文件(主要用于FASTA) split2 按序列数量/文件数将序列拆分为多个文件(FASTA, PE/SE FASTQ) stats FASTA/Q文件的简单统计 subseq 通过region/gtf/bed得到子序列，包括侧翼序列 tab2fx 转换表格格式为FASTA/Q格式 translate 翻译DNA/RNA到蛋白质序列(支持歧义碱基) version 打印版本信息并检查是否更新 watch 序列特征的监测和在线直方图 seqkit rename --help seqkit seq test.fa -w 0 把多行的转为一行 seqkit seq demo.fa -w 100 把一行的转为多行，每行100个字符 seqkit seq -n test.fa 获取所有序列的名称 seqkit translate -T 1 demo.fa -T参数指定使用的转换模式，1是一般模式。 seqkit seq -i 2.fa >3.fa 提取后，header只保留 XP_012434104.1 seqkit seq -i --id-regexp "([A-Za-z0-9.]{1,30})" -w 0 CAZyDB.07312020.fa >CAZyDB.07312020.fasta 主要是使用 --id-regexp 这个参数，匹配的时候不需要匹配 ^> ，程序会自动匹配ID所在的行，中间的正则，必须用双引号包括一对小括号。小括号内是匹配要保留ID的字符 seqkit sort -N Genome.fa -o test.fa seqkit replace --ignore-case --pattern .+ -r "Chr{nr}" --nr-width 2 test.fa -o genome.new.fa rename.txt格式如下：两列之间是tab分隔符，第一列是旧的ID，第2列是新的ID genome.fa的头部格式是只有ID seqkit faidx genome.fa --infile-list genome.order -o genome.order.fa genome.order是一列文件，是你要排序序列ID的顺序，输出的genome.order.fa是排序后的顺序 seqkit seq --dna2rna Chr_genome_final.fa seqkit seq --rna2dna Chr_final.fa seqkit seq --lower-case test.fa seqkit seq --upper-case test.fa seqkit seq -t DNA --complement test.fa seqkit seq -t RNA --complement test.RNA.fa seqkit seq --reverse test.cds.fa 反向序列 seqkit seq -t DNA --complement --reverse test.cds.fa 反向互补序列 seqkit sample -n 10000 -s 10 test_1.fq -o sample.fq 随机提取10000条序列 seqkit sample -p 0.1 -s 10 test_1.fq -o sample.fq 随机提取总序列的10%的序列

一、Solexa测序技术前世今生（——Illumina平台） Solexa高通量测序技术是由英国剑桥大学派生的Solexa公司建立起来的。该方法以单分子阵列技术为基础，是对合成测序技术的发展与延伸。 二、测 序 原 理 Solexa是一种基于边合成边测序技术（Sequencing-By-Synthesis，SBS）的新型测序技术。通过单分子阵列实现在小型芯片（FlowCell）上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用相应的激光激发荧光集团，捕获激发光，从而读取碱基信息。 1）Flow Cell结构 2）可逆阻断技术 3）边合成边测序（SBS） a.加入测序引物 b.Cycles1 a)合成第一个碱基 b)清除未反应的碱基和试剂 c)激发荧光信号并读取 （可逆阻断技术的步骤） d)去除荧光基团和阻断基团 （可逆阻断技术的步骤） c.Cycle2……Cycle n 4）桥式PCR（——簇生成之“起始延伸”） 5）桥 式 PCR（——簇生成之“扩增”） 6）桥 式 PCR（——簇生成之“测序”） 7）碱基读取 三、工作流程 四、测 序 类 型 a)单端测序（single-read sequencing，SR） b)双端测序（Paired-endsequencing，PE） c)混样测序（Indexsequencing） 1）FollowCell 接头差异 Paired End Uracil Specific Excision Reagent (USER) 尿嘧啶切割位点 FormamidopyrimidineGlycosylase (fpg) 糖基化酶切割位点 Single Read Periodate Linearization 高碘酸盐切割位点 a）双 端 测 序 Paired-End sequencing（PE/双端测序） u2212检测基因片段两端的基因信息。 b）单 端 测 序 Single-read sequencing（SR，单端测序） u2212只检测基因片段一段的基因信息。 c）混 样 测 序 Index Sequencing：将多种样本混合测序 u2212充分利用solexa高通量测序特点。A：Adapter B：Fragment DNA C：Index seq primer D：Index E：Adapter五、仪 器 构 造 1）Miseq测序仪 六．测序结果展示 Fastq：Fastq是Solexa测序技术中一种反映测序序列的碱基质量的文件格式。 u2022Read 1 u2022Read 2

1、等待更新：您可以耐心等待DESeq2更新，支持M1芯片的Mac电脑。您可以关注DESeq2的官方网站或者GitHub页面，以获取最新的更新信息。2、使用Rosetta2：M1芯片的Mac电脑可以运行Rosetta2，这是一个兼容层，可以让之前的x86架构软件在M1芯片的Mac电脑上运行。您可以尝试在M1芯片的Mac电脑上安装Rosetta2，并使用Rosetta2来运行DESeq2。3、使用虚拟机：您可以使用虚拟机在M1芯片的Mac电脑上运行另一个操作系统，例如Windows或Linux。在虚拟机中安装DESeq2，并在虚拟机中运行DESeq2。

为什么工业革命会首先在英国爆发，此次革命带来了什么样的结果

这里我们注意3种DNA链： 1、Watson链和Crick链（名字不代表任何意义 仅用于区分互补的两条链） 【这两条链均为原始DNA链 未经处理 但已有待测的5mC】 3、BSW链（或者BSC链）：这两条链分别对应Watson链和Crick中 碱基的转换为“未甲基化的C-T” 4、BSWR链（或者BSCR链）：同理 因此碱基的转换为“G-A” 【首先我们要明确 因为处理后得到了四条链 这里是不能像RNA-seq一样直接进行比对的】将所有的C-to-T（包括reads和ref） 这一步的意义在于： 1、对于reads来说，此时reads上所有的存在（而待转换的） C 均带有甲基，此时将这些C转换为T是为了下一步与经过同样转换的ref相比对 2、对于ref来说，将所有的C人为地转为T是为了模拟重亚硫酸盐的处理，且假设所有的C均未甲基化。 这样，我们得到的ref和reads在序列上就完全一样了 我们也就能够得知每一个测序片段是来自原始的两条链中的哪一个，在知道了这个后，我们再将reads上转换过的C-to-T换回T-to-C，就能得出5-mC了。这一步的灵魂在于：create multiple versions of reference seed with C"s converted to T"s 这一灵魂操作的内在意义是：由于我们不知道被甲基化修饰的C是原始ref链上的哪一个，因此我们假设每一个C都有可能是5mC，于是对它进行C-to-T的处理，然后再和真正被bisulfite处理的片段进行比对。 【比对的原则是T可以比对为C或T，而C只能比对为C】 C只能比对为C的原因是：我们在灵魂操作的时候选择保留这个C而不人为地转换为T就是因为假设它是被甲基化的。 而T可以比对至C或T的原因是： 1、如果T比对T，即代表该T原为未被甲基化的C，而在bisulfite的处理中转换为了T 2、如果T比对C，即代表该C为甲基化的C

RNA-seq即转录组测序技术，就是用高通量测序技术进行测序分析，反映出mRNA,smallRNA,noncodingRNA等或者其中一些的表达水平。转录组测序技术（RNA-seq）作为目前二代测序领域最普遍的技术手段而获得广泛应用，应运而生的多种方法各有特点、争奇斗艳。传统方法通常需要富集mRAN，片段化mRNA，反转录和加接头，及扩增等。缺点是只能每个样品独立建库，获得的全长转录组信息中绝大多信息在后期分析中极少用到，普遍存在建库步骤多、耗时长、效率低、测序深度不够、成本高等问题；如果成百上千的样品需要测序，例如目前历程研究经常必须进行的成千上万样品的大规模队列研究，则效率十分低下。

RNA-Seq在衡量基因表达水平时，若单纯以比对到基因上的reads数来计算表达量在统计学上是不合理的。影响因素有： 1.基因长度：需要基因长度来比较同一细胞内不同基因之间的表达。RNA-seq实验中众所周知的固有技术效果与基因长度有关：RNA（或cDNA）分子在测序之前先进行片段化，较长的转录本会比较短的转录本被剪切成更多的片段。因此，转录本的reads数不仅与其表达水平成正比，而且与其长度成正比。如下图，我们不能单纯的数比对到基因上的read数来比较表达量高低，需要考虑基因长度的影响。 这样来说，序列长的基因永远会被认为表达量较高，从而错误估计基因真正的表达量。为了消除基因长度产生的固有技术误差，在过去十年中，已针对RNA-seq数据开发了许多归一化方法，其中常用的有RPKM、TMM、RLE、upper quartile上四分位处理等。所以需要对原始的表达矩阵进行标准化，去除掉测序深度和基因长度所带来的噪音。 是指所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化并且一直处于活性转录状态的基因。 矫正的思路很简单，就是在变化的样本中寻找不变的量，那么在不同RNA-seq样本中，那些是不变的量呢？一个很容易想到的就是管家基因。但其实这种办法有一个非常强的先验假设：管家基因的表达量不怎么发生变化。其实管家基因有几千个，这几千个基因有一定程度上的变化是有可能的。因此这种方法不准确。 在RNA-Seq建库的过程中掺入一些预先知道序列信息以及序列绝对数量的内参。这样在进行RNA-Seq测序的时候就可以通过不同样本之间内参（spike-in）的量来做一条标准曲线，就可以非常准确地对不同样本之间的表达量进行矫正 数值概念：计算公式：CPM=C/N*1000000 设C为比对到geneA的read 数（read count ）,N为比对到所有基因的总read 数 用途：在某些情况下，只想了解每个基因被覆盖到的相对read数，而不希望对其做长度校正，就会使用这个指标。CPM 只对read count相对总read 数做了数量的均一化。如果想进行基因间表达量的比较，则不得不考虑基因长度的不同。如果进一步做长度的均一化，就得到了下面的RPKM. RPKM，全称为reads per kilobase per million mapped reads，指的是每一百万个map 上的reads 中，map到外显子的每1K个碱基上的read数。 一般来说，基因越长，读取的次数（深度）越多，自然其有效读数就越多。而RPKM 就是为了消除这两个干扰的因素。以更好的比较不同结果。 数值概念：计算公式：RPKM=(1000000 C)/(N L/1000) 设C为比对到geneA的read 数（read count ）,N为比对到所有基因的总read 数，L为gene A的碱基数，RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达量的影响，计算得到的基因可直接用于比较不同样品间的基因表达差异 用途：用于与基因表达量相的后续分析，用于单端测序 计算步骤： 首先对总值数据进行标准化（当然正常来说map到的count 肯定不止这么多，这里只是除了10，但一般而言百万级的count 可以除一百万）相比于RPKM，FPKM 计算的是fragments，也就是一对reads。与RPKM 的差别主要体现在，FPKM在一对reads map上的情况下只计数1，而RPKM 会计为2。适用于双端测序。 与 RPKM/FPKM 的差别在于，TPM 首先进行了基因长度的标准化，接着再进行了测序深度的标准化。 步骤：1.长度标准化 2.深度标准化 自然从这点来说TPM 的使用范围更为广泛。 参考 excel演示DESeq2归一化原理 - (jianshu.com) 要回答这个问题，我们需要先撇开所有形式上的计算，重新思考到底什么是RNA转录本的表达丰度这个问题。 事实上，对于任何一个制备好测序文库的待测样本，它上面任何一个基因的表达量（或者说丰度），都将已是一个客观存在的值，这个值是不管你改变了多少测序环境都不会变的。而且总共有多少个不同的基因在这这一刻进行了表达，实际上也已经是客观定好了 此刻，我们可以假定，对于样本X，其有一个基因g被转录了n次，同时样本X中所有基因的转录总次数假定是m次, 那么正确描述基因g转录丰度的值应该是：rg=n/m 同时，样本X中其他基因的转录丰度的计算也应该和上述公式类似。除了要把分子n换为其他基因对应的转录次数之外，分母m都一样。于是有趣的事情就是，所有基因转录本丰度的均值mean将是一个恒定不变的数，由以上定义这个数就是：mean = (a+b+c+...+n+...)/m/x x代表基因个数 此时发现 (a+b+c+...+n+...)=m，公式化简变为mean = 1/x 这个期望值竟然和测序状态无关！仅仅由样本中基因的总数所决定的。也就是说，对于同一个物种，不管它的样本是哪种组织（正常的或病变的），也不管有多少个不同的样本，只要它们都拥有相同数量的基因，那么它们的mean都将是一致的。这是一个在进行比较分析的时候，非常有意义的恒等关系。 由于上面的结果是在理论情况下推导出来的，实际上我们无法直接计算这个r，那么我们可以尝试通过其他方法来近似估计r，只要这些近似统计量可以隐式地包含这一恒等关系即可 实际数据来证明FPKM和RPKM犯的错: 假定有两个来自同一个个体不同组织的样本X和Y，这个个体只有5个基因，分别为A、B、C、D和E它们的长度分别如下： 我们可以得到，样本X和Y的转录本的不变量，mean值是: 我们以FPKM的计算的为例子，以下这个表格列出的分别是样本X和Y在这5个基因分别比对上的fragment数和各自总的fragment数量： 于是，按照以上公式我们可以得到样本X和Y在这5个基因上的FPKM值分别为： 样本X在这5个基因上的FPKM均值FPKM_mean = 5,680; 样本Y在这5个基因上的FPKM均值FPKM_mean = 161,840 首先，我们可以把FPKM的计算式拆分成如下两部分。 第一部分的统计量是对一个基因转录本数量的一个等价描述（虽然严格来讲也没那么等价）: 第二部分的统计量是测序获得的总有效Fregment数量的百万分之一: FPKM其实就只是这两部分的商！这有道理吗？分开来看它们似乎都有点道理，但是合起来的时候其实很没逻辑。 尤其是第二部分（N/10^6），本来式子的第一部分是为了描述一个基因的转录本数量，那么正常来讲，第二部分就应该是样本的转录本总数量（或至少是其总数量的等价描述）才能形成合理的比例关系，而且可以看出来FPKM/RPMK是有此意的，这本来就是这个统计量的目的。 可是，它却失败了！ N/10^6的大小其实是由RNA-seq测序深度所决定的，并且是一个和总转录本数量无直接线性关系的统计量——N与总转录本数量之间的关系还受转录本的长度分布所决定，而这个分布往往在不同样本中是有差异的！ 比如，在有些基因中，虽然有效比对到基因的Fragment数是相等的，但一般来说长度越长的基因，其被转录的次数就越少。那也就是说，N必须将各个被转录的基因的长度考虑进去才能正确描述总体的转录本数！而FPKM/RPKM显然没有做到这一点，这便是FPKM和RPKM出错的内在原因。