凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。聚丙烯酰胺凝胶电泳不是通过凝胶颗粒内部的孔穴保留小分子的，聚丙烯酰胺凝胶是通过三维网状结构分离，所以小分子先出，大分子比较慢出。不一样的原理
