什么是Westernblot?
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、试剂准备1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。2、匀浆缓冲液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巯基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。3、转膜缓冲液:甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。4、0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。5、膜染色液:考马斯亮兰 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。6、显色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺 0.1ml;H202 1.0μl。三、操作步骤(一)蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃,13,000g离心15min。取上清液作为样品。(二)电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。(三)转移:(半干式转移)1、电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次。2、膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min。3、转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好,滤纸、凝胶、NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2,转移1.5hr。转移结束后,断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干夹于两层滤纸中保存,留与显色结果作对比。(四)免疫反应:1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。2、加入包被液,平稳摇动,室温2hr。3、弃包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。4、加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放置12hr以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。5、弃一抗和1%BSA,用0.01M PBS分别洗膜,5min×4次。6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释),平稳摇动,室温2hr。7、弃二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。8、加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。四、注意事项1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。2、显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。
对于大分子的蛋白做western blot 有哪些需要注意的
大分子蛋白和小分子蛋白做western blot其实要求是一样的,区别就在于大分子蛋白跑得慢,所以电泳和转膜需要的电压或电流更大,时间更长,当然,一般大分子蛋白需要用低浓度胶,而小分子蛋白则选择高浓度胶.
RNA gel blot是什么
gel是硅胶 blot是印迹 所以就是RNA印迹技术,相当于Northern Blot。
做好westernblot需要注意各种细节,转给需要的你!
做好Western需要注意各种细节。工欲善其事,必先利其器,首先还是从蛋白提取开始谈起。 1.收样前3min先配制细胞裂解液(现配现用),RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul,计算用量。以收集六孔蛋白为例,按比例加入RIPA 1200ul,蛋白酶抑制剂12ul,磷酸酶抑制剂12ul,混匀后置于冰上。(我使用的试剂RIPA裂解液(中),蛋白酶抑制剂混合物(100×),蛋白磷酸酶抑制剂混合物(100×)均购自***公司) 2.弃掉旧的培养基,PBS洗三遍。 3.每孔加入200ul刚配好的裂解液,立即置于冰上,在摇床上裂解30min。 (全程在冰上操作) 1.将动物组织(脑、肺等)取出后分装成三份或更多(一份WB,一份qPCR,一份备用),取出后立即存于-80℃。(注:取完一块组织后立即冻存于-80℃,反复冻存样品对待测蛋白有影响,最好用新鲜样品实验) 2.配制细胞裂解液(现配现用),组织:RIPA=1mg:10ul,可根据实际情况调整。RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。配好后置于冰上。 3.将其中一份组织剪下约90mg于有钢珠的震荡匀浆器中匀浆。此匀浆器的盖子或芯通常置于-20℃,使用时取出,操作应快捷,匀浆1min基本可保持温度。 4.将匀浆加入90ul现配的裂解液中,冰上摇床裂解30min。 我采用的是***公司的BCA蛋白定量试剂盒测定提取蛋白浓度,和说明书protocol差别不大,稍有不同,如下: 1.稀释BSA标准品以制作标准曲线:取7支EP管,每管加30ul生理盐水,第一管加30ulBSA,混匀后再取30ul至第二管,依次倍比稀释,最后一管不加为空白(即本底值)。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。 可提前配制: 戴好口罩和手套,选用1.0mm玻板,用试管刷和洗洁精仔细刷洗玻板,清水冲洗干净。卡槽对齐卡好后置于软橡胶垫片上,夹紧,向板中加满蒸馏水试板子是否漏液。观察几分钟后若不漏液,将板子中水倒出,倒扣晾干。 1.配制8ml 10%分离胶,依次向小烧杯中加入蒸馏水3.04ml,30%丙烯酰胺2.7ml,1.5Mu2022pH8.8 2.0ml,10%SDS 80ul,10%AP 80ul,TEMED 3.2ul。加入TEMED混匀后立即灌胶,用1ml枪头沿着玻板上沿从左至右轻轻将胶打入,以免胶浓度不均匀,避免气泡产生。加完后换200ml枪头从左至右更加小心加入蒸馏水水封,以免冲散刚灌的分离胶。静置,当水和胶之间出现一条水平的折线时,即已凝固。 2.待分离胶凝固后,将水封的蒸馏水倒出,可将滤纸条放于玻板角吸水加快残留水流出,倒置。配制4ml 5%分离胶,依次向小烧杯中加入蒸馏水2.7ml,30%丙烯酰胺670ml,0.5Mu2022pH8.8 500ul,10%SDS 40ul,10%AP 40ul,TEMED 4ul。加入TEMED混匀后立即灌胶,同上用1ml枪头从左至右轻轻加入浓缩胶,加满后冲洗10孔梳子,水平轻轻插入浓缩胶中静置待其凝固。可将剩余的浓缩胶沿着梳子加入玻板中以完全密封。 3.此时,可将之前分装好的煮过的加入loading buffer的蛋白样品、预染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化。 Little Trick 1.AP和TEMED均为神经毒性、致癌物质,使用时需小心。 2.灌胶时视线与胶面水平,注意操作,避免胶溅入眼睛中。 3.常温下半小时胶可凝固,若天气寒冷或需加快凝固,可将其置于37℃孵箱中,15min左右即可凝固。 4.若第二天早上立即跑胶,这样就不耽误午饭时间,可头天晚上先把胶配好,凝固后取下玻板,连夹子、梳子一同放入蒸馏水中,4℃过夜保存。 1.将玻板卡紧电泳槽中,先在内槽加满已配好的1×电转液,十几分钟后观察是否漏液,若漏液重新调整玻板,再次卡紧,直至不漏液为止。否则,可能胶还没跑完,电转液就漏完了。 2.轻轻拔去梳子,第一孔加入5ul预染的蛋白maker ,2~7孔依次加入20ul待测蛋白样品,第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上样时轻轻加入,注意不要将样品加入其他孔,或加样过快导致样品溢出。 3.插好正负极,注意检查正负极不能插反。调节电压至80V(浓缩胶),跑0.5h后;将电压调至100V(分离胶),约1.5h后,maker分离明显,在胶底部出现一条蓝色的buffer条带,此时电泳完毕。使用完在实验仪器使用本上做好登记。 注意:避免蓝色条带跑出分离胶,这样有可能目的蛋白也已经跑出,所以在分离胶底部出现一条整齐水平的蓝色条带时,即停止电泳。 Little Trick 1.电泳时插好正负极后,从电泳槽底会有小气泡上升,气泡的数目和上升速率与电压大小呈正比。若小气泡和往常不太一样,观察几分钟后还是如此,则需检查是否加错了电泳液,或者电泳液配制有误。 2.一般浓缩胶80V 0.5h,分离胶100~120V 1~1.5h,具体跑胶电压和时间与目的蛋白大小、实验仪器和实验室环境都有关,需多次探索最佳条件。若目的蛋白较小,则尽量缩短跑胶时间,并及时观察maker位置,避免目的蛋白跑出。我分别实验了浓缩胶80V 0.5h,80V 1h,分离胶120V 1.5h,120V 1h,100V 1.5h,100V 1h,110V 1.5h,110V 1h,结果显示在本实验室实验仪器下,我的目的蛋白及内参在浓缩胶80V 0.5h,分离胶100V 1.5h条件下,分离效果最好。在此条件下,我做了几次重复实验,结果均一致。因此,总结出本实验室此目的蛋白的最佳电泳条件。 3.电泳的好坏直接影响到目的蛋白的显影情况,尤其时磷酸化目的蛋白的二聚体,若电泳条件优化,结果可清晰显出蛋白表达情况。所以探索最佳电泳条件是决定胜负关键一步。 4.电泳快结束时即可准备转膜所需的滤纸和PVDF膜,浸泡在电转液中。建议在第一次WB后分别剪好不同大小的硬纸片,标好面积和孔数(即样品数),存好以后随时使用。 5.WB中夹取PVDF膜最好使用平头镊子,并夹住膜左上角,可最大程度减小对膜上蛋白的损害。 电泳结束后,取出玻璃板,稍微冲洗,洗净电泳槽,放好。轻轻撬开玻璃板,根据maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切胶,为了防止切歪,可在玻璃板下垫上上述剪好的同切胶大小一致的硬纸片。一般一块胶需切下目的蛋白和内参两小块胶,将切下的胶分别浸泡在电转液中。 1.根据每一块切胶的大小剪6张同样大小的滤纸和一张PVDF膜,浸泡于电转液中,可以提前准备好的硬纸片为模板剪。PVDF膜先经甲醇活化20s后浸泡于电转液中。 2.在电转仪上制作“三明治”结构转移膜,最下面放三层滤纸,然后依次放PVDF膜,胶,三层滤纸,用玻璃棒轻轻赶走气泡(注意上下三层滤纸之间不能接触,否则易造成短路)。盖上盖子,根据膜的总面积调整电流,电转2h。 3.在电转的同时,可以配制以下液体,事先根据膜的数量计算好所需体积: 以一块膜为例,封闭5ml+稀释一抗4ml+稀释二抗4ml,需要13ml,则配制15ml。 5% BSA溶液(w/v):配制15ml 5% BSA溶液(w/v),称取0.75g BSA晶体,溶于15mlTBST中,漩涡振荡器混匀,现用现配,4℃保存(若目的蛋白为磷酸化蛋白时配制)。 5%牛奶(w/v):配制15ml 5%牛奶(w/v),称取0.75g脱脂奶粉,溶于15ml TBST中,漩涡振荡器混匀,现用现配,4℃保存。 1×TBST洗液:使用时将100×TBST用双蒸水稀释至1×,常温保存。 Little Trick 1.关于电转膜,有些使用NC膜。我没有尝试过NC膜,但隔壁实验室使用NC膜多次WB结果仍不理想,换用PVDF膜后有所改善。因此建议还是使用PVDF膜,可购买Millipore的PVDF膜,一卷有些贵,但是可以够一个实验室用好几年哪。最好不要在经销商购买分装的的PVDF膜,另一实验室一同学想着价格便宜也就只做几次,就从试剂公司只买了100cm2的膜,结果这价格虚高不说,而且膜还是假的,直到做完实验了才发现,蛋白样品也浪费了。所以建议还是购买Millipore公司原装的PVDF膜。 2.关于电转方式,有些采用湿转,有些采用半干转,两种方式均可。个人觉得半干转方便简捷些。 1.电转结束后,根据maker位置和目的蛋白及内参大小剪膜。可在标有maker的一边左上角剪一个小角,以清楚哪一条带是1号样品。 2.分别用已配好的5% BSA和5%牛奶封闭目的蛋白和内参,室温摇床上孵育2h。根据盒子大小,加入封闭液的量需没过膜。 1.配制p-STAT1一抗( 公司),1:500稀释,加入上述配制的5% BSA 4ml,再加入8ul p-STAT1一抗,混匀,现配现用。 配制actin一抗( 公司),1:2000稀释,加入上述配制的5%牛奶4ml,再加入2ul actin一抗,混匀,现配现用。 2.将PVDF膜从封闭液中取出,可用平头镊子小心放入塑料手套的手指中,加入一抗,封口,使膜完全浸泡在一抗中,放入冰箱,4℃过夜。我一般用封口膜做成小盒,置于大玻璃平皿中,放入PVDF膜,用枪从上到下向膜上加一抗,完全浸没,之后和PCR上样仪一同固定在摇床上,4℃孵育过夜。 次日,回收一抗,做好标记,-20℃保存,可再使用3~4次。将膜放入1×TBST中,摇床上清洗三次,每次10min。 1.配制具有种属特异性的HRP标记的二抗(抗鼠或抗兔),1:2000稀释,加入上述配制的5%牛奶4ml,再加入2ul 二抗,混匀,现配现用。 2.TBST洗完膜后,加入二抗,室温摇床上孵育2h。 1.二抗孵育完后,回收,-20℃保存。1×TBST摇床上洗膜三次,每次10min。 2.一条目的蛋白即一张膜需要100ul发光液A和100ul发光液B,根据膜数计算用量,提前4℃混合好发光液A和B。 3.到暗室中加混合好的发光液,在胶片左上角剪一小角(和PVDF膜一致),曝光胶片,可分别不同时长曝光,如15s,30s,1min,5min等,然后在显影液和定影液中显影,放入自来水中。出暗室后,将胶片挂起晾干。 也可用Bio-rad凝胶成像系统照相,选择不同的曝光时间成像。 Little Trick1.需通过不同曝光时间探索某蛋白最佳曝光时间,多次重复实验即可采用此曝光时长。我最开始也是在暗室中显影,后来用Bio-rad凝胶成像系统照相,对比结果发现后者的结果更加清晰明显,背景也更加干净,之后就一直用成像仪曝光照相了。 2.夹取胶片可用普通镊子,但也只夹胶片左上角,避免损害胶片上曝光的蛋白条带。 3.胶片左上角maker一侧一定要剪一小角或做其它标记,才可在显影后明显对应各个样品。 4.若暗室曝光,可能内参蛋白发光液刚加上就出现很亮的条带,这时最长曝光15s已经足够。 若显影效果不好,可将膜重生,再次显影,省去了配胶、电泳和电转等步骤。 1.加4ml蛋白印迹膜再生液,室温摇床30min。
western blot的原理
与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达
western blot 怎么保证上样量一致
在进行Western blot检测前,先用其他方法检测样品浓度,比如通过BCA法,Lowry法,Bradford法等。检测后根据样品浓度调整上样体积,这样既可保证上样量一致。如果无法检测样品浓度,可以先在SDS-PAGE跑完后进行考染或者银染,根据SDS-PAGE的结果适当调整上样体积,也可以保证Western blot时上样量一致。
western blot抗体洗脱液的配方?
Stripping by Acidic pHApplicable to any chemiluminescent substrate system.Required Equipment and Solutions Stripping solution: 25 mM glycine-HCl, pH 2, 1% (w/v) SDS Phosphate buffered saline (PBS): 10 mM sodium phosphate, pH 7.2, 0.9% (w/v) NaCl Shallow tray, large enough to hold the membraneProcedure1. Place the blot in stripping solution and agitate for 30 minutes.2. Place the blot in buffer and agitate for 10 minutes. Repeat with fresh buffer.3. Proceed to the blocking step for the next round of detection.
western-blot中分离胶的浓度怎么选择
western blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量 不同的分离胶浓度对不同的目的蛋白分子量的分辨率不一样,比如15%的分离胶更适合45kDa的分目的蛋白,而10%的分离胶更适合70kDa的目的蛋白而因为western blot的膜应该是完全覆盖SDS PAGE的凝胶,所以不用太担心条带在凝胶上位置偏上活偏下 所以western blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量如果以溴酚蓝跑到胶的底部为准,26kD在10%的由下往上1/4的地方,而15%就在由下往上大约1/2(不太确定)的地方,对于分子量比较小的蛋白,当然是胶的浓度越大,分离效果越好.但是你必须考虑到,胶的孔径一旦小于蛋白-SDS复合体的直径,分子量大于这个蛋白的所有蛋白仍然不能有好的分离效果.如果孔径太大,所有蛋白都跑得那么快,也是分不开的.所以,关键是看这个分子量附近的蛋白,比如±5kD以内的所有蛋白,在不同浓度的胶中的速度差要尽可能达到最大,假设是对数正态分布,那么方差要足够大,才会有较好的分离效果.另一方面,蛋白跑的路程越大,也越能和附近的蛋白分开.我的建议是溴酚蓝跑到底,而目标蛋白正好在整块胶的1/2的地方,分离的效果时最好的
western blot显色原理
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是?>分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所(Friedrich Miescher Institute)的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。化学发光1、将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;1min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;1min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,放入X-光片夹中。2、在暗室中,将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中;在红灯下取出X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm);打开X-光片夹,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min或5min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果;曝光完成后,打开X-光片夹,取出X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。显影时间一般为1~2min(20~25℃),温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间;显影结束后,马上把X-光片浸入定影液中,定影时间一般为5~10min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。
western blot原理是什么?
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品,转移到固相载体上,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。相关如下原理:先制备蛋白质样品,再利用SDS-PAGE原理,分离不同的蛋白质,再将分离的蛋白质进行转膜,以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体(一抗)结合。由于此过程中,可能有未结合到抗原的抗体遗留,故需要清洗,以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段,相应的二抗可以结合到这个片段上,形成抗原-一抗-二抗结合物。再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上,由于加入的标记物相对质量分子很大,可以用离心作用将其沉淀下来,如果抗原与抗体结合,便可以一起沉淀下来,最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。
做Western blot时,用牛奶封闭的目的
一般使用脱脂牛奶来封闭,目的是要将除目的蛋白外其他无结合蛋白位置封闭起来,防止后面一抗非特异性结合产生较深背景。
Western-blot 用的3MM滤纸与普通滤纸有什么主要的区别
(PS 楼主可以百度嘛,网上关于WB的实验太多了) Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测.对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测. 一、原理与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达. 二、试剂准备 1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验. 2、匀浆缓冲液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巯基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml. 3、转膜缓冲液:甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml. 4、0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml. 5、膜染色液:考马斯亮兰 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml.包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中. 6、显色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺 0.1ml;H202 1.0μl. 三、操作步骤(一)蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min.然后4℃,13,000g离心15min.取上清液作为样品. (二)电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE. (三)转移:(半干式转移) 1、电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次. 2、膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min. 3、转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好,滤纸、凝胶、NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将碳板上多余的液体吸干.接通电源,恒流1mA/cm2,转移1.5hr.转移结束后,断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹.将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干夹于两层滤纸中保存,留与显色结果作对比. (四)免疫反应: 1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次. 2、加入包被液,平稳摇动,室温2hr. 3、弃包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次. 4、加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放置12hr以上.阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同. 5、弃一抗和1%BSA,用0.01M PBS分别洗膜,5min×4次. 6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释),平稳摇动,室温2hr. 7、弃二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次. 8、加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应. 四、注意事项 1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件. 2、显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2. 3、DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细
免疫印迹与elisa和western blot有什么区别,似乎原理差别不大,谁能细致说说
酶联免疫吸附实验(ELISA) ,蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot,二者在原理上、应用上有区别,具体如下:1、原理不同蛋白质印迹法,其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,此种结合不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,出现颜色反应。2、应用不同蛋白免疫印迹(Western Blot),将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室温下稳定;反应产物易于显现;能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等,其中以HRP应用最广。3、提出者不同蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所(Friedrich Miescher Institute)的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》中首次被称为Western Blot。Engvall和Perlman建立酶联免疫吸附实验。参考资料来源:百度百科-蛋白质印迹法参考资料来源:百度百科-elisa
β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数,是啥意思?
β-Actin是管家基因,在不同细胞中均有表达。用其作为内参,是指在western实验中通过内参的含量的多少来调整样品之间的上样量,相当于作为标准曲线的作用,只有调整样品的上样量使得内参的含量一致才能比较不同蛋白间表达量的差别。western使用的抗体视个人所需不同,可以是兔抗、羊抗、鼠抗,做之前要先查阅相关资料
给出一张western blot的图,该怎么分析
western blot结果的分析是一个主观性比较强的过程western是一个半定量的实验。所以一般是作为定性的验证试验首先要分析的就是有无目的蛋白的条带,有无条带就是一个定性的结果,这种分析是比较简单。当然这其中还要综合考虑内参等对照样品。然后就是有条带之后,各个条带灰度值的分析,而对其灰度值的量化不外乎是在肉眼可见的基础上在给出一个数值的参考而已。所以说western blot结果的分析是一个主观性比较强而且需要综合考虑的过程
western blot条带会被摩擦掉吗
western blot一般是不会出现封闭过度的western blot封闭的目的是将PVDF膜上无蛋白的部分空隙用奶粉填满,以免孵抗体的时候一抗二抗与之结合,产生非特异条带或者是背景杂乱。为封闭掉膜上无蛋白区域的非特异结合位点,封闭时间长点是没关系。但时间太长会造成封闭试剂的变性,影响结果。
dotblotting和wb的区别
dot-blot 也就是把你的样品直接点在膜上不用电泳转膜,一般是用来快速检测你的样品里面有没有目的抗原。Western-blot经过了电泳,可以更清楚的分析你要的蛋白是不是你预期的分子量大小。拓展资料:斑点杂交(Dot blot)是将被检标本点到膜上,烘烤固定。这种方法耗时短,可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品,为使点样准确方便,市售有多种多管吸印仪(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它们有许多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本,这时的膜就可以进行杂交。
Western-blot实验中,蛋白上样一般多少含量
蛋白上样量在10-50ug,体积在10-25ul之间。
谁能详细地说一下southern blot的的原理和有什么应用吗?
一、Southern印迹杂交(Southern blot)是1975年由英国人southern创建,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 二、基本原理 Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片段长短进行分离,然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此,制备DNA样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下,将DNA样品放在0.8~1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳,标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70-80000bp的DNA片段,故可对DNA片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA片段。原则是分辨大片段的DNA需要用浓度较低的胶,分辨小片段的DNA则需要浓度较高的胶。经过一段时间电泳后,DNA按分子量大小在凝胶中形成许多条带,大小相同的分子处于同一条带位置。另外为了便于测定待测DNA分子量的大小或是所处的分子大小范围,往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA (DNA marker)进行电泳。DNA marker可以用放射性核素进行末端标记,通过这种方式,杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。 三、主要应用 1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析 3.检测样品中的DNA及其含量 4.PCR产物分析
Western Blot为什么必须要用内参
Western Blot为什么必须要用内参 要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot。因为WesternBlot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然,顺利的时候WesternBlot做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的。所以,严谨的WesternBlot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就可以查出问题所在,而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小),空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照),已知量标准产物的正对照;另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因,国内的不少人做Western Blot往往省略参照,导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。 内参是最容易被忽略的一项。我们知道,要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础。特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。 内参即是内部参照(InternalControl),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(HousekeepingProteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。 在国外发表的文章中,Western Blotting实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是,国内仍有不少科研人员在WesternBlotting实验中忽略了内参的使用,将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质,相对于比色法来说,操作简单,但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;且敏感度低,要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA,Bradford,Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高,且与一系列干扰Lowry,BCA反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。另外,蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样,此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参,即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。 在WesternBlotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 实验结果分析其实很简单:如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量,得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,再用此数值进行样品间的比较和分析,得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分,可以先检测内参,观测样品间内参显色条带是否一致,根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验,至内参量一致为止;若内参一致,即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点,但是可以保证结果更有说服力,更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。 附:在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有: 一、 超级简便的标记内参使用法:只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体,按照正常操作即可。 二、普通内参:当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时,可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体,重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。 三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下,可以在转膜后预染,根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分,使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育,二抗温育以及显色。【摘自网络】
Western Blot为什么必须要用内参
Western Blot为什么必须要用内参 要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot.因为Western Blot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化.虽然,顺利的时候Western Blot做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的.所以,严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用.特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就可以查出问题所在,而不必抓耳挠腮怨天尤人.良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小),空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照),已知量标准产物的正对照;另外还有内参.可是由于经费限制或者偷懒的原因,国内的不少人做Western Blot往往省略参照,导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析. 内参是最容易被忽略的一项.我们知道,要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础.特别表达量不高时,上样量误差就很可能影响结果的分析.所以你需要内参. 内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物.在Western Blot 实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性. 在国外发表的文章中,Western Blot 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例.但是,国内仍有不少科研人员在Western Blot实验中忽略了内参的使用,将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法.然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度.如UV法直接定量,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质,相对于比色法来说,操作简单,但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;且敏感度低,要求蛋白的浓度较高.比色法测定蛋白浓度一般有BCA,Bradford,Lowry 等几种方法.BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰.Bradford 法敏感度最高,且与一系列干扰Lowry,BCA 反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容.但是对于去污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性.另外,蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样,此步骤也存在操作误差.在Western Blot实验时使用内参,即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正. 在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中,同时用内参对应的抗体检测内参,这样可在检测目的蛋白的同时检测内参的表达.由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信.此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常. 实验结果分析其实很简单:如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的内参量和目的蛋白量.将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量,得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,再用此数值进行样品间的比较和分析,得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果.如果样品量充分,①可以先检测内参,观测样品间内参显色条带是否一致,根据差异大小②调整各样品的上样量重新进行Western Blot实验,至内参量一致为止;若内参一致,即可③进行不同样品间目的蛋白表达的比较分析.这样虽然麻烦一点,但是可以保证结果更有说服力,更可信.毕竟我们的实验是一种严谨的工作.
Western Blot为什么必须要用内参
在 Western Blot 中使用内参其实就是在 WB 过程中另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个 Western Blot 显色或者发光体系是否正常。常用的蛋白质内参有 GAPDH 和细胞骨架蛋白 beta-actin 或 beta-tubulin。 一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。——厚百 Western Blot试剂以下是常见的内参:内参名称 分子量大小 适用范围Beta-actin 43 kDa 胞浆和全细胞GAPDH 30-40 kDa 胞浆和全细胞Tubulin 55 kDa 胞浆和全细胞VCDA1/Porin 31 kDa 线粒体COXIV 16 kDa 线粒体Lamin B1 66 kDa 细胞核TBP 38 kDa 细胞核
为什么要用western blot
印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA-DNA杂交检测特定的DNA片段的方法,随后人们用这位发现者的名字,将这种方法称为Southern印迹法。这里提到的Southern,原名:Edwin Mellor Southern中文名称为:埃德温u30fb迈勒u30fb萨瑟恩在这之后,人们用类似的方法,对RNA和蛋白制进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。其实主要是,首先用类似方法的人叫个Southern,后面的就用剩下的方向命名了。
western blot是什么意思
western blot[英][u02c8westu0259n blu0254t][美][u02c8wu025bstu0259n blɑt] [医]蛋白免疫印迹法即蛋白质印迹杂交,采用标记第二抗体的间接免疫检测反应。; 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot
膜蛋白和核蛋白做western blot有什么不同
膜蛋白和核蛋白做westernblot时并没有什么不同除了内参的选择和蛋白样品准备有所不同之外,在做sds-page获取凝胶,以及之后转膜封闭,一抗二抗,定影显影均没有什么不同在提取总蛋白的时候提取细胞核内的蛋白最好用强裂解液,提取膜蛋白最好不要用胰酶消化
生物科研实战——Western blot
western blot原理简介:western blot技术主要是通过电泳技术区分不同的蛋白质组分,并将所分离的蛋白质转移至固体支持体上,通过特异试剂和抗体作为探针,对靶蛋白分子含量进行检测的一种方法。 1.蛋白样品提取: 试剂:RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂 (1)取出含有细胞的6孔板,置于冰上进行操作 (2)吸出培养液,加入1ml预冷的PBS清洗一遍,加入PBS时务必沿着板壁注入,避免触碰到孔板底部导致细胞脱落。 (3)吸出PBS,再次加入1mlPBS清洗 (4)用细胞刮轻柔的刮下细胞,将刮下来的细胞连同PBS一起吸入1.5mlEP管中,(注意吸除干净) (5)将EP管放入离心机中离心,3000r 1min (6)吸除上清,务必完全吸除干净 (7)汉恒生物RIPA裂解液的配置:RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂(按照1:100体积比分别吸取2ml RIPA裂解液、 20ul蛋白酶抑制剂(PI),颠倒混匀。【此过程冰上操作】 (8)加入配置好的100ul汉恒生物RIPA裂解液到去除上清后的离心管中,吹打均匀,置于冰上裂解30min,12000r 4℃ 10min (9)取出上清,依次移取样本上清至对应的新EP管中 2.蛋白样品定量 试剂:BCA试剂A、BCA试剂B、BCA标准品 蛋白定量工作液配制:将汉恒生物BCA试剂A液与B液按照50:1混合均匀 (1)将10ulBSA标准品以及稀释后的待测蛋白样品加入96孔板,每个样品2个复孔 (2)将配置好的蛋白定量工作液加入96孔板中,每孔200ul (3)将96孔板放入37℃恒温箱中反应30min (4)将反应完的蛋白样品置于酶标仪进行蛋白样品浓度测定 (5)根据测定的蛋白浓度用RIPA裂解液将不同样品平衡同一浓度 3.蛋白样品变性处理 试剂:SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 (1)将汉恒5X样品缓冲液与蛋白样品4:1混合后涡旋振荡混匀 (2)将蛋白样品置于95℃水浴锅中水浴10min (3)蛋白样品配置完毕可置于-20℃以下保存备用 4.蛋白PAGE胶的配制 (1)玻璃板装配:将玻璃板擦干净,放入制胶器中夹紧(2)按照配方配制不同浓度的分离胶(下层胶) (3)将配置好的分离胶灌入玻璃板夹层,加入异丙醇压平分离胶,待凝固,一段时间后,分离胶与异丙醇出现明显的分界线,提示上层胶完全凝固。(4)倒出上层异丙醇,用滤纸吸干残余的异丙醇(5)按照配方配制不同浓度的浓缩胶(上层胶) (6)加入浓缩胶,插入梳子,待凝固。5.蛋白凝胶电泳 (1)取出PAGE胶,装入电泳槽,上推胶板以避免漏液,装入垂直槽电泳架,装入电泳槽,加入电泳缓冲液(2)轻柔缓慢拔出梳子,以免破坏胶孔,将槽内电泳液补满。(3)按照上样顺序进行点样,样本浓度、体积须保持一致 (4)加入蛋白分子量Marker(5)在泳道两侧加入10ug保护蛋白(即普通蛋白样本)以防止电泳时出现边缘效应 (6)对应正负极盖上盖子,红对红,黑对黑 (7)将电压调至80V进行电泳,气泡出现指示电泳开始,待蛋白样品电泳至下层分离胶时暂停电泳,将电压调至120V继续电泳(8)根据Marker指示,待目的蛋白电泳至分离胶三分之二处停止电泳。6.转膜 (1)将裁减掉右上角的PVDF膜泡入甲醇中待用(2)倒入预冷的转膜液,将转膜夹和海绵完全浸入缓冲液中,放置滤纸(需完全浸湿),确保滤纸与海绵之间无气泡(3)将电泳完的凝胶玻璃板取出,按照蛋白Marker 切割目的蛋白所在区域的凝胶(4)将目的蛋白凝胶置于滤纸上,并用转膜液浸湿,将泡完甲醇的PVDF膜置于凝胶之上膜的右上角对应凝胶的右上角(5)赶除PVDF膜与凝胶之间的气泡,盖上润湿的滤纸,放置时不要引入气泡,合上转膜夹(6)将转膜夹对应正负极放入转膜槽,黑对黑,白对红,放入冰盒,灌满转膜液,对应正负极盖上盖子。(7)将电流调至200mA进行转膜7.丽春红染色 试剂:丽春红染色液(1)取出汉恒生物丽春红染液待用 (2)转膜完成后,取出PVDF膜,膜上蛋白Marker清晰,胶上无明显蛋白Marker表明转膜完全,去除无蛋白区域,将膜的右上角以便确认膜的方向(3)将膜置于TBST中清洗,置于汉恒生物丽春红染液中,置于摇床摇动3—5分钟。(4)摇动结束后,用蒸馏水重复漂洗2—3次直至出现清晰条带,如条带清晰整齐则表明之前Western Blot 步骤成功 (5)置于TBST中重复清洗2—3次直至染液褪去 8.封闭 (1)将PVDF膜取出放入预先配制好的脱脂牛奶(3%—5%)室温缓慢摇动1个小时 9.抗体孵育 (1)将配置好的一抗倒入抗体孵育盒,将封闭完的PVDF膜用TBST清洗一遍后置于一抗中,置于4℃冰箱或者冷库缓慢摇动过夜 (2)过夜后将孵育了一抗的PVDF膜置于TBST中重复清洗3次,每次10min (3)将PVDF膜置于二抗中室温缓慢摇动1小时 10.显影 试剂:超敏ECL化学发光试剂盒(A液)、超敏ECL化学发光试剂盒(B液) (1)将汉恒生物影底物A液和B液1:1混合均匀 (2)将PVDF膜控干后平铺于一次性PE手套上,,将汉恒生物显影液均匀涂在PVDF膜上,避光孵育2min(3)置于Bio-rad自动显影仪器进行目的蛋白显影 11.去除一抗二抗(strip膜再生) Western 一抗二抗去除液(stripping buffer),用于Western中转移了蛋白的膜的重复利用。在Western中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后,有时还需要检测tubulin、actin等表达量相对稳定的蛋白作为参照,或检测某蛋白的翻译后修饰的表达量(磷酸化等)后进行该蛋白的总蛋白表达量检测进行比较。通过使用一抗二抗去除液,充分去除一抗二抗,可以非常方便地重复利用使用过的膜检测其他蛋白。和重新跑一个SDS-PAGE胶相比,不仅省时省力,而且可以消除重新上样而带来的误差,使可比性更强。 (1)将显影完的PVDF膜置于汉恒生物一抗二抗去除液中漂洗10min,室温摇床 (2)弃除一抗二抗去除液并吸尽残余液体加入TBST漂洗3次,每次5min (3)Strip完成后可再次进行封闭、一抗二抗孵育等Western Blot操作
Southern blot,Northern blot,Western blot三种分子生物学技术差异
Southern blot 是分析DNA的杂交技术,Northern blot是分析RNA的,而Western blot是分析蛋白质的 Southern 和Northerin原理基本相同,都是利用DNA或RNA的复性过程,但过程上也有区别,主要是 Southern是先电泳后变性,而Northern是先变性后电泳; Southern是碱变性,而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性,因为采用碱变性会导致RNA水解
什么是western blot?有什么用途?
【答案】:Western blot依据的基本原理有两个:蛋白质的凝胶电泳分离和抗原一抗体间的特异结合。Western blot就是蛋白质免疫印迹。将经过凝胶电泳分离的蛋白质条带,原位电转移至能吸附蛋白质且有一定机械性能的薄膜(如醋酸纤维素膜)上,然后分别与目标蛋白质的特异抗体以及酶标二抗进行孵育结合,最好加入酶底物进行反应,使与抗体特异结合的蛋白质条带显色,从而使目标蛋白得到鉴定。用途:(1)鉴定蛋白质样品中某种目标蛋白的存在与否(如果有显色条带,说明蛋白质样品中含有目标蛋白)。(2)鉴定抗体的特异性(如果在某一蛋白质混合样品中只有一条带显色,显示抗体具有特异性)。(3)结合标准蛋白的使用,可以鉴定目标蛋白的分子量和含量。
western blot中封闭起什么作用
转膜后,膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。在做Western blot实验中,会用到固相载体(如NC膜,PVDF膜),在这些固相载体表面有很多洞洞,通过电转,胶上的蛋白被转移到膜上,蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面,但是蛋白并不是连续的,而有很多空隙,抗体也是蛋白,也会被吸附在空的洞里,这样就会有很多非特异性的信号。扩展资料:封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合,以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上,填补和覆盖蛋白结合位点以避免非特异性结合。同样,这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固结合在空白位置上,这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上,而只会跟特异性蛋白结合。封闭液应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白,不结合靶蛋白表位,也不与抗体或检测试剂有交叉反应。转膜后,膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。参考资料:百度百科——蛋白印迹法western blot
western blot 步骤是什么?
简单的说的话,可以大致分为8点:1. 收集蛋白样品2. 电泳3.转膜4.封闭5.一抗孵育6.二抗孵育7.蛋白检测8.膜的重复利用,希望可以帮到你哦,你可以到网上找找啊
western blot是干什么的
简单说,就是检测蛋白的
blot和line有什么不同?
前一个只是把蛋白进行电泳分析,主要用于蛋白纯度分析及分子量分析,主要用于定性;后者则是在前者的基础上又经过了转膜及杂交等步骤,用于分析特定蛋白的表达多少的。
Blot,免疫组化有什么区别
免疫组化利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来,以此作为抗原或半抗原,通过免疫动物后获得特异性的抗体,再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。所以免疫组化在组织定位和定性上比较准确,但是在定量上不够准确。western blot也是利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品,转移到固相载体上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应。western blot因为有内参标定,所以在定量上要更加准确。但是在组织定位上不如免疫组化
blot医学代表什么?
就是蛋白质印迹,一种用于蛋白质检测的技术。主要根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法,是一种免疫生化技术。
blothes什么意思
是不是blotch这个单词啊?
blotch是什么意思及反义词
blotch英 [blu0252tu0283]美 [blɑtu0283]n. 斑点;污点;疙瘩vt. 弄脏更多释义>>[网络短语]blotch 污点,斑点,大斑点blotch checks 印经蓝斑格子布,印花经纱格子布Blotch printing 满地印花,底色印花,单面印花
blotch是可数名词吗
blotch是可数名词。[英] [blɒtʃ][美] [blɑ:tʃ]n.(皮肤上的)红斑,疹块; 大滴 [大片](墨水或颜色的)污渍;vt.使沾上污渍,弄脏;[例句]His face was covered in red blotches, seemingly a nasty case of acne.他满脸红斑,像是起了很严重的粉刺。[复数]blotches
PARP cleavage westernblot 是什么技术
热2楼PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)称为多聚(ADP-核糖)聚合酶,是一种与DNA修复,基因完整性监护有关的聚合酶。PARP的DNA结构域是一个锌指结构,可以特异性识别DNA在多因素作用下造成的断点,并启动以ADP-核糖为底物的基因修复。PARP 是Caspase-3,Caspase-7,Caspase-2,Caspase-9等的底物。其中凋亡执行酶Caspase-3可将全长为116Kda的PARP剪切成31Kda和85Kda的两个片断,导致PARP不能正常发挥功能,引起DNA的断裂。PARP降解是细胞凋亡的标志之一。在Western blot中,如果检测出全长的PARP(116Kda) 降解85Kda 和31Kda的两个带子,说明细胞已经发生凋亡。通常情况下由于31Kda的带子离116Kda的带子比较远,我们都把31Kda的带子忽略,只要检测出85Kda的带子即可。
western blot 显影使用ECL法,可以使用一般的凝胶成像仪吗,就是做核酸电泳用的那种仪器
和有光关系大否能够拍摄ecl图像主要取决于设备带有冷ccd只有制冷ccd才够灵敏度捕捉膜上发出光普通用于拍摄核酸和蛋白胶相机普通ccd天能2500普通凝胶成像ecl弱光点都拍要找更高端机器要只能用胶片曝光了否则无法观察ecl条带试试找找伯乐alpha有高端成像仪实验室或者找有暗室实验室
western blot 显影使用ECL法,可以使用一般的凝胶成像仪吗,就是做核酸电泳用的那种仪器
这个和有什么光关系不大,是否能够拍摄到ECL的图像主要取决于设备是不是带有冷CCD。只有制冷的CCD才够灵敏度捕捉到膜上发出的光。普通用于拍摄核酸和蛋白胶的相机就是普通CCD,天能2500就是普通的凝胶成像,ECL那么弱的光,一点都拍不到的。要么找更高端的机器,要么就只能用胶片曝光了,否则无法观察ECL的条带。你试试找找伯乐,Alpha什么的有高端成像仪的实验室,或者就找有暗室的实验室。
Western blot化学发光(ECL)时,条带特别弱势怎么回事啊?有哪些步骤是需要注意的吗?
曝光时间太长,抗体浓度过高,洗涤不充分,封闭不充分,发光试剂不好都有可能造成整张膜都发光.跟蛋白样品的蛋白量应该是没有关系的.
western blot时,ecl发光工作液怎么配制
最简单的办法,比比两个瓶子的大小,如果一样大,就是1:1混合,如果大小差异很大,可能是1:40混合的。所以知道要用多少体积的底物,根据比例就能算出来。但是最保险的办法,还是根据产品说明,或者货号在网上找一下说明书,应该也比较简单的。
为什么Western Blot化学发光(ECL)会出现高背景?
A:Western Blot导致“背景高”的原因有很多,主要有以下几个方面:①. 抗体浓度过高,洗涤不充分,②. 封闭不充分,会造成抗体在膜上的非特异结合,导致高背景。③. 使用了不恰当的封闭剂,可尝试不同的封闭剂。④. 曝光过度,可减少底物显色时间,缩短曝光时间。⑤. 操作过程中膜干了。确保膜完全浸没于buffer中,始终杜绝膜干。所以选择好的抗体和发光试剂盒非常关键,抗体技术目前国内还不成熟,建议选择进口试剂,不然容易特异性不好,发光试剂盒技术已经很成熟了,目前国内国外很多公司都研发出了灵敏度很高的试剂盒,进口可以看一下pierce的,但价格较贵,国产可以看一下上海炎熙生物的极敏型ECL试剂盒。和pierce一样是fg级别。很稳定。
western blotting 中的ECL什么意思
electrochemiluminescence化学发光试剂,一般是WB的最后一步,加入1:1的1号溶液和2号溶液,覆盖pvdf膜,可以显色原理是ECL中含有发光的底物,二抗上连接着酶(一般是HRP),使ECL底物发光。
western-blot化学发光(ECL)特异性差是什么原因?
特异性差,出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面: 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体,或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体,或降低抗体浓度,缩短抗体孵育时间,优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量,延长洗膜时间,或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. 目的蛋白在体内存在多种修饰形式,如乙酰化,甲基化,磷酸化,糖基化等。可查阅文献,用合适的方法去除蛋白的修饰,或选择合适的抗体。 5. 目的蛋白降解。重新准备蛋白样品,并加入足够的蛋白酶抑制剂。 6. 发光液质量问题,可选用灵敏的,发光清晰的ECL发光液,如Enlight-plus。
Western Blot 化学发光(ECL)为什么会“淬灭”?
做Western Blot 化学发光(ECL)实验经常会有“淬灭”的情况发生,经常有朋友反映,加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光,可亮光很快就消逝了,压完片后,条带却很弱,甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么? 要解释这种情况发生的原因,必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化,产生荧光,这个过程被发光增强剂加强,增强剂在HRP-鲁米诺-H2O2体系中扮演着核心角色,决定着ECL化学发光的发展。理想的发光增强剂是:1.发光灵敏,目前一般的发光增强剂都可以将发光灵敏度提高1000倍至100000倍以上,可以检测pmol甚至fmol级别的HRP,发光的灵敏度实际上已不是问题。2.发光稳定,这是目前研究的重点之一,发光不稳定的增强剂,容易在一些情况下发生“淬灭”,即快速消耗发光试剂,在几秒钟内发强光,又在几秒钟内迅速消逝,不容易被检测的现象。3.本底或背景低,这是发展的方向之一,由于化学发光反应对增高本底的因素很敏感,因此,化学发光分析欲得到准确可靠的结果,就必须确保试剂的特异性,在无HRP或很少HRP的情况下,不发光或很少发光。 所以,Western Blot“淬灭”的原因主要在两方面:含HRP的抗体和发光试剂。由于长期应用某种发光试剂,人们多注意了抗体,不知道发光试剂其实也会对实验结果造成重大影响。对抗体方面来说,可以采用适当降低抗体的浓度,发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题;对发光试剂来说,可以选用发光稳定的发光试剂来解决“淬灭”的问题。原文科从英格恩技术博客查看,希望我的回答能帮助到你。
干货 ▎Image J分析Western Blot蛋白条带灰度值
首先解释一下,为什么要分析灰度值? 灰度的概念是使用黑色调表示物体,即用黑色为基准色,不同的饱和度的黑色来显示图像。采用ECL发光时,蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上,留下的黑色条带。然而胶片扫描后为蓝色背景、黑色条带,这并不是单纯的黑灰白颜色。因此,我们首先得在Photoshop中将整张图片去色,使彩色图片变成黑白图片,形成近灰色背景、黑色条带的图片类型。此时,条带的深浅和面积综合代表着蛋白的量。灰度值分析自然就成为我们的首选。 延伸说一下,免疫组织化学染色(IHC)结果本身为近白色背景、棕黄色阳性表达,这时我们就不能直接用灰度反映阳性表达强弱了,而是积分吸光度,也就是咱们常说的平均光密度(IOD)。如果你真的想用灰度计算IHC结果,显然你需要将图片转为灰度图再计算。此处不表。 分析图文步骤如下: Image J软件界面 ↓ 1. 图片转换为黑白图: 首先使用Photoshop打开胶片扫描图片,点击“图像>调整>去色”,将彩色图片转化为黑白图片,并使用裁剪工具将目标条带裁剪至合适大小后另存图片。 2.打开Image J软件: 2.1.打开图片文件: File>Open; 将图片转化为8bit类型: Image>Type>8-bit。 (此步骤的目的是为了将图片的每个像素用8bit表示,这样的话,整个图片的灰度将分为256个级别,即黑、灰、白的像素模式;若保留原始的16bit格式或RGB格式,图片灰度级别会呈指数增长,并有其它颜色混入,造成计算误差。) 2.2.将整张图片背景灰度均一化,消除图片背景影响: Process>Subtract Background,默认数值为50即可。 2.3将图片黑白颜色反转。 使背景为黑色而条带为白色。既还原了条带发光时的样子,也方便我们后面圈选条带:Edit>Invert。 2.4设置从测量指标: Analyze>Set Measurements,选择Area面积、平均灰度值Mean gray value、积分灰度值Integrated dendity。 (解释一下,我们最终要使用的值为积分灰度Integrated dendity,而不是平均密度值Mean gray value。因为平均灰度仅是选定区域的平均灰度数值,而积分密度值则加权了平均灰度和选定的面积,这样选择就消除了选定面积大小对灰度值的影响。希望大家能好好理解这一概念,未来我讲到IHC测量时将详细说明。) 2.5设置测量单位为“单个像素”: Analyze>Set Scale,将Unit of length中的inch改为pixels。 2.6选定需要测量的条带,并测量积分光密度: 使用矩形选框、椭圆形选框或手动绘制选框(手残党勿用),将面积最大的条带完全圈住,快捷键Ctrl+m测量,弹出Results结果框,结果中的IntDen即积分灰度值;继续左键点击选定框中间,不要点框线(否则选定框的大小会改变,要保证框选范围一致),拖动选定框并移动至其它条带,快捷键Ctrl+m测量;重复操作至所有条带测完,最后不要忘了在图片无条带位置加测背景的灰度。 2.7测量结束后,点击Results框中的Edit,选择Select All,粘贴至Excel,开始下一步的分析。 2.8积分灰度值的计算和标准化 首先,将所有条带的IntDen都减去图片背景的IntDen,以扣除背景影响;然后用目标蛋白的灰度值除以其对应泳道的内参照条带灰度值,以此作为该组的目标蛋白相对表达量A。 标准化方法1:如果你是用一张膜来统计,那么直接用所有组的A值除以对照组A值,此时对照组结果为1,其它组结果为对照组的倍数,以此做均一化。 标准化方法2:如果你是用2张或以上的膜来一起统计,那么首先计算所有膜上的对照组A的平均值A",然后用其它组的A值除以A",以此做均一化。这种方法的前提是不同膜之间的背景颜色要相近,若偏差大则数据会很乱。 事实上,还有一种采用波峰下面积分析条带的方法。 即通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积,再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。这种计算方法可在Image J或者Quantity One上实现。但是有人注意到此法的缺陷,故我没有具体说明这种测量方法。附上链接,有兴趣的同志们可以看看。 http://muchong.com/t-3077265-1-authorid-593313
western blot与ELISE的区别
western 定性,定分子量,对蛋白含量半定量。elisa 定性,对蛋白含量定量。无法确定分子量。
急求 TMB做western blot 底物缓冲系统是什么 底物如何配置 拜托哪位高人指点一下 拜托拜托
这是我用的配方:buffer:0.1M 柠檬酸+0.2M Na2HPO4 pH5.0-5.4TMB:2mg/ml溶于无水乙醇或者DMSOH2O2: 30%工作液:0.5ml TMB+ 9.5ml buffer+ 1ul H2O2但是要注意,其实WB并不是太适宜用TMB显色,除非你买专用的沉淀型TMB显色kit。因为通常TMB可溶于水,你晃一晃条带就晃没了。最好用DAB或者ECL。
Bcl-2与Bax是蛋白还是基因 是否可以用Western Blot来检测,中文全称是什么?
bcl-2和bax既可以表示基因也可以表示蛋白 两个蛋白都可以通过相应的抗体进行WB检测
Bcl-2与Bax是蛋白还是基因 是否可以用Western Blot来检测,中文全称是什么?
bcl-2和bax既可以表示基因也可以表示蛋白 两个蛋白都可以通过相应的抗体进行WB检测