blot

免疫组化利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。所以免疫组化在组织定位和定性上比较准确，但是在定量上不够准确。western blot也是利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应。western blot因为有内参标定，所以在定量上要更加准确。但是在组织定位上不如免疫组化

目的蛋白的含量只要达到皮克级别就能检测到～一般为纳克量～如果说上样体积～体积要根据梳子大小来定～普通的小胶一般为10ul～20ul体积～

用植物细胞做western blot 首先液氮保存叶片样品，用的时候研磨粉碎，再用蛋白提取液浸泡离心取上清 上清样品可以先去做定量检测 之后在样品中加上样缓冲液就可以进行western blot检测了

根据你的样品,要检测的蛋白等来决定 一般蛋白浓度在20ug - 80ug 不等 marker的话2-5ul足够了.

　　1. western blot每孔上样总量15-50ug大部分蛋白能做出来，跟蛋白质表达量、分子量、抗体效价都密切相关。 2. 组织一般取200mg，匀浆后蛋白常能得到几百ug，跑十块胶足够。

做贼瞒不得乡里，偷食瞒不得舌齿。

主要是两点不同：抽提方法不同。利用不同的抽提试剂或方法，分离不同的组分用于检测，可以有助于提高检测灵敏度。使用的内参会有所不同，因为蛋白分布位置和特性不同，选用传统的胞内蛋白内参可能不能真实反应样品制备过程中的蛋白得率，所以膜蛋白和核蛋白的内参需要分别再选取。

Western blot 与 Western blotting 是一样的 都是指蛋白质印迹法，具体怎么用好像也没有什么强制的要求，可以写成 Western blot 也可以写成Western blotting。简单一点写成 Western 也没有关系，或者缩写成 WB 也可以

理论上Western blot的抗体是可以用来免疫沉淀的但是免疫沉淀是在相对较弱的变形条件下进行抗原和抗体的识别，这时候蛋白质还保留着大部分的三级结构。如果用单抗IP有可能不能识别起有效的抗原决定簇位点而Western blot则是在变性条件下进行的，抗原决定簇都已经暴露，所以比较容易被单抗所识别所以用Western blot的抗体来做免疫沉淀有较大失败的可能性

western blot实验都需要的基础仪器有：电泳仪，制胶板，电泳槽，湿转的转膜槽或者半干转仪，脱色摇床，暗室，X光片，红外灯，成像仪，一些基础耗材和试剂等基本上生化实验室要做western blot还是很容易的

正常表达量的蛋白上20ug足够了对于过表达的蛋白，10ug也够了一般上样浓度调整到1ug/ul，这样可以保证上样体积不会太大超过孔的体积而溢出。

在做westernblot实验中，会用到固相载体（如nc膜，pvdf膜），在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和覆盖“蛋白结合位点以避免一抗的非特异性结合，所以有”封闭“的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固的结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。封闭液封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白，不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。【摘自网络】

原理：先制备蛋白质样品，再利用SDS-PAGE原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体（一抗）结合。由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原-一抗-二抗结合物，再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。

western blot操作流程如下：1、收集蛋白样品(Protein sample preparation)使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。2、电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制。SDS-PAGE凝胶（分离胶及浓缩胶）可以参考一些文献资料进行配制。(2) 样品处理。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。3、转膜(Transfer)（1）我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA。（2）在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春 。

westernblot原理及过程如下：Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。原理：先制备蛋白质样品，再利用SDS-PAGE原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体结合。由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原-一抗-二抗结合物。再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。

Dance With MeMichael BoltonI walked inShe was standing thereby the bar in a red dressI couldn"t catch my breathHer eyes like fireReached into my heartBut my soul was the targetI didn"t know it yetI couldn"t fight itI felt my knees go weakShe barely had to speakCHORUS:I don"t really wanna dance with the devilI admit it she"s a little too hot for meI don"t really wanna walk through the fireThe flames gettin" higherShe said:Dance with meDance with meOh baby dance with meDance with me Dance with meOh baby dance with meDance with me Dance with meOh baby dance with meDance with meDance with meOh babyShe took my handLed me down the stairsTo the floor where the music wasWorshipped by strangersHer body moved in ways I"ve never seenHow"s the face of an angelSo filled with dangerI couldn"t fight itI couldn"t take the heatShe barely had to speakREPEAT CHORUSI don"t really wanna fall tonightBut it feels so rightWhen I know it"s so wrongI don"t really wanna walk awayBut she"s beggin" me to stayAnd she"s much too strong

hublot中文名宇舶表，hublot手表诞生于1980年，是首家融合贵重金属和天然橡胶为原材料的瑞士顶级腕表品牌，它的诞生无论从制表材料还是从腕表所诠释的独特美学概念来讲，在钟表界都掀起了一场革命。hublot是什么牌子?hublot中文名宇舶表，是来自瑞士的顶级手表品牌，接下来跟着她时代的小编一起来详细了解一下，感兴趣是伙伴快来了解一下吧。hublot是什么牌子hublot中午名宇舶表，hublot手表诞生于1980年，是首家融合贵重金属和天然橡胶为原材料的瑞士顶级腕表品牌，它的诞生无论从制表材料还是从腕表所诠释的独特美学概念来讲，在钟表界都掀起了一场革命。“复兴与征服”的精神贯穿于Hublot宇舶表的营销理念。hublot是第一个瞄准足球的钟表品牌，在成为英国曼联俱乐部等的官方手表后，2010年世界杯上Hublot宇舶表风光无限，作为世界杯历史上第一个官方手表，BigBang在马拉多纳的双手上熠熠生辉。除了足球，Hublot宇舶表也是F1，美洲杯帆船赛，世界滑雪赛，马球等各项世界知名赛事的合作伙伴。宇舶表也最终在2010年击败爱马仕(Hermes)，宝缇嘉(BottegaVeneta)等，被英国权威奢侈品协会Walpole授予年度奢侈品牌卓越奖。hublot宇舶表于2010年庆祝品牌成立30周年之际，推出了第一款完全自主生产的机芯--UNICO，这一研发速度在制表业可以说是奇迹。UNICO自主机芯是HUBLOT宇舶表最具标志性意义的计时机芯，这也是选择这款机芯的重要原因。它完全由宇舶表的微观机械师、工程师和制表师独立设计、研发、制造并组装。作为一款拥有飞返计时功能的机芯，它可以在任何时间进行重置，尤其在制表业中独树一帜的设计是机芯在表盘一侧整合了双按钮结构、日期显示、带双水平离合的独特定位机构和着名的“导柱轮”。hublot手表价格多少钱?这款hublot手表国内价格约为30000元左右。hublot宇舶ClassicFusion38mm系列561.CM.1110.RX腕表hublot宇舶ClassicFusion38mm系列561.CM.1110.RX腕表以经典圆形设计为初衷，该款腕表的亮点在于它的螺钉设计，表圈用精钢螺钉固定在表壳上，表带用螺钉固定到表耳处，为陶瓷腕表增添了金属质感;仅有38毫米的表壳直径并不使腕表显得过于渺小，反而一种大气天成的感觉散发了出来。hublot宇舶MasterPiece系列902.ND.1190.RX腕表这款hublot手表国内价格约为2200000左右。hublot宇舶MasterPiece系列902.ND.1190.RX腕表，这款时间之匙，最大的特点就是通过三个不同位置的表冠，让主人可以根据喜好，让指针按照正常时间的4、1/4和1倍的速度运作。也正因如此，宇舶才赋予了它一个极其另类的40毫米超大表盘。关于以上分享的hublot是什么牌子的内容，以及其他相关内容的分享，相信大家已经掌握了具体的信息，对于品牌的选择，可以根据自己的经济条件，结合自己多产品的需求进行选择。希望可以帮助大家。

“chronograph”是计时机芯的意思，表示有计时功能。

中国人还是认可劳力士，价格实惠，10万元左右带个劳力士手表就足够了

宇舶表属于高端档次的手表。1980年诞生于瑞士，是瑞士顶级的腕表品牌。宇舶手表其实在钟表界是一个非常与众不同存在，历史不算久，但是依然能在钟表界享有一席之地。正是因为它独特的设计风格，以及突破传统的腕表美学概念。宇舶手表设计的通常都是非常炫酷的，跟传统制表风格非常不同，同时也会比较吸引年轻点的用户群体，比较受一些富二代欢迎。外圈以直纹打磨，带绢状质感，上面固定了共十二颗抛光螺丝，用以指示时刻。表耳在外圈一侧，乃宇舶手表招牌设计，除美观外也不失实用，不但保护表冠不受损害，在某些表款（如SuperProfessional）上也有锁定外圈的功能。hublot手表的特点：宇舶有两大主要系列，一个是经典融合，一个是大爆炸（bigbang）。其中经典融合系列是偏向经典设计的系列，大爆炸是走炫酷、炸天、技术路线。经典融合系列多使用通用机芯，大爆炸基本都使用以UNICO为主的自产机芯。低调而别具特色的外观，让不计其数表友对它赞扬。相对别的著名品牌，HUBLOT的手表也是十分具备与众不同的，除了各式各样社会化营销，和融合的制表核心价值，更采用了具有与众不同的稀缺原材料。因而对比别的著名品牌而言，比较小众，比较增值。以上内容参考：百度百科-宇舶

hublot中文名宇舶表，hublot手表诞生于1980年，是首家融合贵重金属和天然橡胶为原材料的瑞士顶级腕表品牌，它的诞生无论从制表材料还是从腕表所诠释的独特美学概念来讲，在钟表界都掀起了一场革命。hublot是什么牌子?hublot中文名宇舶表，是来自瑞士的顶级手表品牌，接下来跟着她时代的小编一起来详细了解一下，感兴趣是伙伴快来了解一下吧。hublot是什么牌子hublot中午名宇舶表，hublot手表诞生于1980年，是首家融合贵重金属和天然橡胶为原材料的瑞士顶级腕表品牌，它的诞生无论从制表材料还是从腕表所诠释的独特美学概念来讲，在钟表界都掀起了一场革命。“复兴与征服”的精神贯穿于Hublot宇舶表的营销理念。hublot是第一个瞄准足球的钟表品牌，在成为英国曼联俱乐部等的官方手表后，2010年世界杯上Hublot宇舶表风光无限，作为世界杯历史上第一个官方手表，BigBang在马拉多纳的双手上熠熠生辉。除了足球，Hublot宇舶表也是F1，美洲杯帆船赛，世界滑雪赛，马球等各项世界知名赛事的合作伙伴。宇舶表也最终在2010年击败爱马仕(Hermes)，宝缇嘉(BottegaVeneta)等，被英国权威奢侈品协会Walpole授予年度奢侈品牌卓越奖。hublot宇舶表于2010年庆祝品牌成立30周年之际，推出了第一款完全自主生产的机芯--UNICO，这一研发速度在制表业可以说是奇迹。UNICO自主机芯是HUBLOT宇舶表最具标志性意义的计时机芯，这也是选择这款机芯的重要原因。它完全由宇舶表的微观机械师、工程师和制表师独立设计、研发、制造并组装。作为一款拥有飞返计时功能的机芯，它可以在任何时间进行重置，尤其在制表业中独树一帜的设计是机芯在表盘一侧整合了双按钮结构、日期显示、带双水平离合的独特定位机构和着名的“导柱轮”。hublot手表价格多少钱?这款hublot手表国内价格约为30000元左右。hublot宇舶ClassicFusion38mm系列561.CM.1110.RX腕表hublot宇舶ClassicFusion38mm系列561.CM.1110.RX腕表以经典圆形设计为初衷，该款腕表的亮点在于它的螺钉设计，表圈用精钢螺钉固定在表壳上，表带用螺钉固定到表耳处，为陶瓷腕表增添了金属质感;仅有38毫米的表壳直径并不使腕表显得过于渺小，反而一种大气天成的感觉散发了出来。hublot宇舶MasterPiece系列902.ND.1190.RX腕表这款hublot手表国内价格约为2200000左右。hublot宇舶MasterPiece系列902.ND.1190.RX腕表，这款时间之匙，最大的特点就是通过三个不同位置的表冠，让主人可以根据喜好，让指针按照正常时间的4、1/4和1倍的速度运作。也正因如此，宇舶才赋予了它一个极其另类的40毫米超大表盘。关于以上分享的hublot是什么牌子的内容，以及其他相关内容的分享，相信大家已经掌握了具体的信息，对于品牌的选择，可以根据自己的经济条件，结合自己多产品的需求进行选择。希望可以帮助大家。

是Hublot，geneve的意思是日内瓦，chronograph的意思是计时芯，Hublot是一款采用铸金表身和天然橡胶表带，由CarloCrocco设计，生产的手表，该品牌只有一款手表，分古典、优雅、活跃三个系列，每个系列均配有黑色橡胶表带。Hublot腕表却可于短短几年间晋身带动制表业的精英品牌之列。创制如此独特的表带及引证天然橡胶的卓越特性需要三年研究时间，橡胶与皮肤一经接触就仿如再生一样。制成表带的两个部份可于购买时专门调较至合适，便可瞬间舒适自如地适应顾客的手腕。扩展资料：Unico机芯：自制Unico机芯历经2年以上研发，由Hublot制表厂内部自行制造。新颖的Unico机芯包含不少于330个装配零件，配备整合导柱轮机构的飞返计时装置，该装置设于机芯的表盘一25325011如此独特的布局在高级钟表领域也属罕见。自诞生以来，Unico机芯还融入更多功能和复杂技术，包括世界时间GMT功能，以及用于为足球比赛计时的专利双逆跳计时装置。参考资料来源：HUNLOT官网-UNICO机芯参考资料来源：百度百科-HUBLOT

1、指示剂，方便观察电泳进行的程度；2、密度大，携带你的样本沉到孔的底部；3、保持蛋白线性及携带过量负电荷的状态

好抗体

内参，顾名思义就是内部参考。广义的内参可指任何机构搜集的供内部人员参考的信息资料。在我国，新闻内参特指新闻媒体向各级党政机关专门呈送的一种新闻报道，是新闻的一种特殊形式。与普通的新闻不同的是，新闻内参是一种不进行公开发布的报道。目前，我们所说的“内参”通常即指新闻内参。

换个抗体，或者用别人已经做出来的抗体做一下你的标本

Western blot出现两条带是经常会发生的情况 具体原因可能是该蛋白出现了同源二聚体，故都可以被抗体识别出来 或者改蛋白有部分降解，但是未降解部分依然可以和抗体结合 另外抗体特异性不高，也会出现非特异性的结合，造成出现两条或者多条带 所。

1：只有一天的时候，一个时刻， 今后无论在什么舒适，！ 的当然所有，在于在我父亲的手， 我会作为一个孩子，以及担心呢？ 他穿了我父亲的心 送礼者当然每个新生天 其公平分享快乐和痛苦， 劳累，休息和安慰。 2：当然，他每天都靠近我， 对于每一个有特殊的恩典特殊的时刻。 每一天的忧虑，他想穿， 他呼吁克拉夫特和忠告。 明天的关怀，我将保存; 可见，尽管我不确定远足径。 “由于您的一天，所以应是你的实力还” 这个承诺，他给了我。 3：帮助我静静地休息和安全 只有当您的承诺，亲爱的主啊， 然而Trones浪费昂贵的安慰， 正如我被收购字。 请帮助我，主啊，无论发生什么事对我来说， 以你的忠实的父亲关爱 只有一天的时候，一个时刻， 直到我达到了良好的土地。

bcl-2和bax既可以表示基因也可以表示蛋白 两个蛋白都可以通过相应的抗体进行WB检测

做对比检测实验例如AKT蛋白磷酸化后P-AKT做westernblot检测，看看AKT和p-AKT表达量又没有相关性。或者做elisa实验，毛细管电泳或者HPLC也可检测相关性。

因为Akt信号通路是通过 磷酸化而活化的，也就是所谓的P-Akt。所以想知道这个细胞的Akt信号通路是否活化就要比较在 总Akt 相当的情况下 p-Akt的含量，总Akt就算一个类似于内参的东西，当然并不能代替内参，如果总Akt条带差异很大的话，P-Akt条带有差异也就说明不了什么问题了！

不贵吧，这个在分子生物学实验室属于常规实验，我们几乎每天都做，平均下来很便宜。做多了，熟练了，就会做得更好。

最好一样，如果实在不一样，也尽量不要相差两倍体积，超过两倍体积，就要用PBS补充缺少的体积，否则体积不一样，起始电压会有影响

westernblot内参加在于所有加样的孔道内因为内参是样品组分之一～区别内参与目的蛋白的是其分子量的差异～蛋白处理：此步骤是关键，蛋白处理的好否决定结果好坏。取细胞，3000rpm 3min离心，加入含蛋白酶抑制剂（现做现加）的细胞裂解液(本实验室选择RIPA，1×106/L细胞对应100ul)，枪尖反复吹吸裂解细胞（此步非常重要，容易出现鼻涕样的液体，此为裂解不充分的缘故，所以应反复吹打或者置于振荡器上，直**鼻涕状液体消失）。冰上放置**少半小时。

首先必须建立白蛋白(bovinserumalbumin;BSA)之标准曲线,配置0.2,0.5,1,1.5mg/ml浓度的BSA,各取100μl於管中,另取一管加入100μlddH2O当作blank,另外收集待测定量之不同浓度的VLPsfraction100μl,加入5ml稀释过的Bio-radproteinassay试剂,混合均匀后,於室温下静置5分钟.测定595nm之吸光值,依各测定值可划出BSA之标准曲线,进而计算出欲测蛋白质之浓度.

根据你的目的蛋白的丰度以及抗体灵敏性调整，一般建议在10-30ug左右常规蛋白基本都可以。

western blot是为了区分蛋白质的大小和大概的量，在电泳后你的凝胶上有不同的蓝紫色小块，这些就是被染色的蛋白质，他们在凝胶上不同的水平位置代表不同的大小，紫色小块的厚度代表蛋白质的量，如果一个紫色小块很少或者看不到，说明凝胶做的有问题

你胶做歪了可能.做的时候要每加一个试剂摇匀一次.完了玻璃板要洗干净,下胶陪完之后等个15分钟或以上再加上胶,加之前倒水的时候,用滤纸伸进去吸水,记住不要碰到胶体.有个tip,就是你胶做好了放4度冰箱冰一下,一两天也可以,这时候跑出来的胶最直最清楚.

就是所有的细胞中几乎都表达的一种蛋白，就叫做内参，我理解的 设内参的目的就是为了看一下你的目的蛋白和这个内参的表达量的区别

Northern Blot杂交技术的原理方法与Southern Blot类似，本文主要介绍Northern Blot分离RNA是在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行RNA电泳实验方案，包括在甲醛-琼脂糖变性条件下RNA电泳的准备，通过上行毛细管转移到尼龙膜或者硝酸纤维素膜，以及使用标记的DNA或者RNA探针杂交检测RNA目的序列。 Northern杂交与Southern杂交的区别 Northern杂交与Southern杂交有着诸多类似，却也有显著不同，主要有以下三点区别： (1) 所检测的靶核酸是RNA 。Northern杂交可用来对特异性mRNA定量以及确定其分子量，可以提取细胞总RNA直接电泳。总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在。 (2) RNA电泳 。由于RNA是单链，大部分RNA能通过分子内碱基配对而形成二级结构，因此必须在变性条件下进行电泳。碱性溶液会水解RNA的2"-羟基基团，因此不能进行碱变性，而是采用甲醛或乙二醛和二甲基亚砜（DMSO)等进行变性电泳。常用的是RNA在甲醛-琼脂糖凝胶电泳，甲醛与谷氨酸残基的单亚基基团形成不稳定的Schiff 碱基对，这些加合物通过阻止链内碱基配对使RNA维持在变性状态，这种方法电泳速度较快而且对RNA的特异性序列分析方法可靠稳定。 (3) 转膜 。电泳结束，Northern杂交可以直接用毛细管虹吸法将胶中的RNA转移至膜上，不需要再进行变性和中和。 1.实验方案 1.1.经甲醛变性处理后进行的RNA电泳 (1)加热溶解1g琼脂糖到72ml水中，然后冷却到60℃。 (2)当冷却到60℃左右时，在通风柜中加入1OmL 1OxMOPS电泳溶液和18mL 37%甲醛，开始灌制琼脂糖水平凝胶。 (3)在琼脂糖中设置梳子，然后让胶凝固，取出梳子，把琼脂糖-甲醛胶放到电泳槽，加入足够的1 x MOPS电泳溶液使得液面覆盖凝胶上方1 mm左右。 (4)每一个RNA样品4.5 μL (10~20μg），加DEPC水到11 μL,然后分别加入5μL 10 x MOPS电泳溶液、9μL 37%甲醛、25μL 甲酰胺。 (5)混合均匀后，短暂离心5s,然后65℃孵育样品15 min，冰上制冷，离心（样品）5S，将所有液体沉淀到微型离心管中。 (6)加1/10体积（5μL)的无菌、DEPC处理的甲醛凝胶上样缓冲液，混合均匀后，上样电泳。 (7)电泳5 V/cm,直到溴酚蓝跑到凝胶的2/3时结束电泳。 (8)电泳结束后，切下分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化乙锭溶液（0.5 μg/mL,用0.1 mol/L乙酸铵配制）中染色30u301c45 min。在凝胶放置一把透明尺，在紫外灯下照相并测量照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RNA片段大小的1g对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。 1.2.变性RNA在膜上的转移和固定 (1)把凝胶转移到无RNA酶污染的玻璃皿内，用解剖刀片修整凝胶的无用部分，在凝胶左上角切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记，再加入DEPC水淋洗数次，以除去甲醛。 (2)加入10倍体积的0.05 mol/L的NaOH和1.5mol/L的NaCl到玻璃皿中浸泡30min，然后去除，再加入10倍体积 0.5mol/L 的 Tris·Cl (pH 7.4)和 1.5mol/L 的 NaCl，浸泡30min以中和。 (3)去除溶液后，加入10倍体积20xSSC，浸泡45min。 (4)用长和宽均大于凝胶的玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿内，上面放一张 Whatman 3 mm滤纸，倒入20 xSSC使液面略低于平台表面，当平板上方的3 mm滤纸温透后，用玻棒赶出所有的气泡。 (5)用剪刀裁一张硝酸纤维素滤膜或者尼龙膜。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大 1 mm。接触滤膜时须戴手套或用平头镊子，用油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸湿。 (6)将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用20 xSSC浸泡滤膜至少5 min，用干净的解剖刀片切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。 (7)将凝胶翻转后置于平台上湿润的3 mm滤纸中央，3 mm滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。 (8)用Parafilm膜围绕凝胶周边（不是覆盖凝胶），作为阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中的屏障。 (9)在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜或者尼龙膜，并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝胶之间不应留有气泡。 (10)用20XSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3 mm滤纸，轻轻地放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。 (11)切一叠（5~8 cm高）略小于3 mm滤纸的纸巾，将其放置在3 mm滤纸的上方。并在纸巾上方放一块越境玻璃板，然后用500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。 (12)使上述RNA转移持续进行6h或者过夜，每当纸巾浸湿后，应换新的纸巾。 (13)转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3 mm滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的3 mm滤纸上，用一支铅笔在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。 (14)从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以20xSSC溶液于室温浸泡滤膜5 min， 这一步可以除去粘在滤膜上的琼脂糖碎片。从20 xSSC溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干30 min以上。为估计RNA的转移效率，可将胶置于溴化乙锭溶液中染色45min,于紫外灯下观察。 (15)将晾干的滤膜放在两张3mm滤纸中间，用真空炉于80℃干烤0.5u301c2h。如干烤时间过长，滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不立即用于杂交实验，可用铝箔宽松地包裹起来，在真空下贮存于室温。 1.3.探针标记 （1）取25ng模板DNA (适当增大加入量）溶解在5~20 μL蒸馏水中，沸水浴加热 5 min,然后立即冰上制冷。 （2）冰上加入以下试剂： 1 μL dATP 1 μL dGTP 1 μL dTTP 10 μL 随机引物缓冲液（Random Primer Buffer) 3 μL 50 μCi, [a-32P] dCTP, 3000 Ci/mmol/L-1 1 μL Klenow 酶(5 U/μL) 加蒸馏水至总体积50μL,用移液器轻轻混匀，短暂离心。 (3)25 ℃温育1 h。（温育时间大于1 h可以产生较高的特异性） (4)加人5 μL 0.2mol/L的EDTA后65℃加热10 min终止探针标记反应。 1.4.杂交和放射自显影 (1)室温浸泡膜于2 × SSC中15min，然后倒掉液体，加入7.5 mL 预杂交液。42℃在摇床上摇摆预杂交4 h。 (2)将标记的探针100℃变性5 min,冰浴5 min,再加入到杂交液中 (3)42℃ 杂交 16h。 (4)倒掉杂交液，加入等体积的2×SSC/0.1% SDS室温洗膜15 min。 (5)0.2xSSC/0.1%SDS，55℃洗膜3次，每次15min，除去非结合探针以减少背景。 (6)去除洗脱液后，将膜放在双蒸水中漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水分，用保鲜膜将膜包好。 (7)在暗室中将杂交膜和X光片放入增感屏内，密封后放在-80℃中放射自显影48 h。 (8)显影和定影：暗室中显影10 min,定影20 min。 2.注意事项 在 Northern杂交 和 Southern杂交 之间最大的区别在于一开始的凝胶分离步骤。因为单链RNA容易形成二级结构，因此RNA样品在电泳时必须在变性条件下才能获得好的分离效果。总RNA和poly(A+) RNA都能用于Northern Blot,不过总RNA效果会差点因为非特异性杂交会使背景变深。Northern Blot能够检测到约5 pg RNA量，而通常mRNA量只占总RNA的0.5%。因此要得到大于5 pg mRNA，起始总RNA量要大于100ng。 3.预期结果 使用硝酸纤维素膜或者尼龙膜，标记的探针≥5×108dpm/g，Northern Blot将能检测到10 μg总RNA中0.01% mRNA或者3 g poly（A+）RNA中的0.0002%目的mRNA。

2019-01-09 星期三 晴 说起昨天，真的很心酸。虽然以前看过同门大致做了一遍，但许多细节还是不清楚的。自己亲身体验才清楚。。。 1.蛋白测定之后要加5X SDS上样缓冲液，该怎么加呢？是所有的标本一起加了，还是就算准备上样的量？经中心试验室CWW指点后才知道，可以一起加了。就是把蛋白样品的体积除以4就是了，这样的5Xbuffer就变为了1X。 2.紧接着是配胶，也是一堆问题。过硫酸铵（AP），给我的是一支0.5g干粉，说明书说配成10%溶液，我先是拿1mlDDW稀释，然后去了100ul在稀释成1ml。结果依据产品说明书的要求配置分离胶，过了一个消失还是不能凝固。多方求教之后才发现AP，只有5%（Oh，my god！）。于是再取了100ul加入AP溶液中，这下就解决问题。 在配胶过程中，分离胶和浓缩胶所使用的SDS浓度是不一样的。一个1cm的胶，可能需要5ml的制胶液体。 3.配胶归配胶，分离胶的玻璃板如何安装才能不漏液也是一门技术活。我没有提前去把玻璃板清洁，只是临时把玻璃板清洗、擦干、再吹干。（这浪费了许多时间，故建议有自己专属的玻璃板，后者提前准备好。）在安装玻璃板的时候，要准备剥离板的底端要齐整，然后扣在制胶架上，要将绿色的卡夹下压到底，这样才能密切贴合。不然就像我那样，胶（前面提高胶不会凝固）就从缝隙里流光了。有人建议可以在剥离板上涂一些凡士林，有减少漏液的功效。 4.好不容易把胶制好了，开始跑电泳。电泳内槽也开始漏液，真是急死人了。（这时候，老病号的电话打过来了，之前和他约好11点的时候见面，安排复查事宜。两个事情堆在一起急死了。)肾内科的老师LLL建议我把电泳槽灌满电泳液，就没办法漏了，一开始想是个好办法，后来想想把胶重装一遍吧。在重装的过程中确实发现了问题所在，原来内槽上面有一个类似台阶的小疙瘩，之前没有注意到，没有将它配齐，故而留有缝隙，漏液了。于是针对性地重装了一遍，内槽不漏液了。开始电泳。电泳显示选择60V跑浓缩胶，跑了大概十分钟，发现没有啥动静，也没有传说中的泡泡冒出。认真核实了一下电路，没有接错之后，就赶紧去处理老病号的事情。临走之前还让麻醉的小兄弟JZT帮我瞄一眼。这位小兄弟一本正经地和我说，短路了。这可把我吓了一跳，赶紧电话追过去。原来他所谓的短路，是电泳内槽水漏没了。我十分悲伤地放下了电话，抱怨今天白忙活了。等我回到实验室，打开盖子，惊喜地发现电泳内槽水是满的。也发现了marker条带出来了。就是时间很久。大概过了一个消失，终于把分离胶跑完了。开始跑分离胶，设置100V，又过了一个小时，分离胶才跑了三分之一，于是把电压调到120V，又过了一个小时，分离胶才跑了三分之二。眼瞅着下午五点了，而且内参的条带已经出来了，索性把电压调到了150V，没到半小时，就跑完了。 5.转膜。电泳的过程相对比较顺利。不过切胶也切了我大半天，犹豫怎么下手就花了10分钟，现在想来，就是目标条带的判断准确之后，先切去浓缩胶和不要的孔道，然后切去剩下的分离胶。剪PVDF膜和活化膜，比较顺利。在“三明治”的配置过程中，耽搁了一会儿。一定要切记胶和膜的对应方向，膜上还要做个标记，以便判断蛋白所在的位置。开始电转的时候，已经快七点了，一看protocol要60V电转2小时，当时就有些想放弃了。好在问了一位高手YRL，她建议300mA电转45分钟就可以了。我一听一下子轻松了不少。 6.封闭。5%牛奶封闭了一会儿，直接扔冰箱里了。因为已经体力不支了，所以电脑也没带回去。在这期间我把病理切片的名单写在了载玻片上面，算是弥补了一点原本当天要完成的工作。 今天，早早地过去，就是希望把westernblot的流程完成了。 1.洗膜。1X TBST洗膜，这个我已经提前配置好了，没有压力。5minX3次。 2.孵一抗。按照GAPDH说明书，1:4000稀释一抗。我还以为4ml的一抗稀释液要16ul的抗体。我一想，有点不合理吧。我买的GAPDH总共才25ul，一次性全部用了。好在问了肾内科的LLL，跟我解释了一下。原来是抗体和一抗稀释液的配比是1ul和4000ul，果然这样才合理。就这样开开心心地常温孵化抗体3h。在这期间去了趟病理科，把昨天弄好的病理组织块切回来，准备下一步免疫组化。 3.去完病理科，吃了个午饭，没有休息继续奋斗。到细胞房惊喜地发现放在别人细胞层的140细胞居然一点污点都没有。这是细胞培养箱的问题吗？还是我一直怀疑的培养基问题，抑或是培养液没有提前预热的问题？总之，细胞状态很好，就准备一传三，同时冻存一部分。而这次510又开始一反常态，污点变多了，但没有之前增殖那么快，所以今天510我全部扔了。同时将第一次的510复苏了。希望你要好好的，明天见分晓。 4.回收一抗。（请注意，如果你要回收抗体，建议将抗体在冰上孵育，以保证抗体质量）。TBST洗膜三遍，5minX3次。 5.孵二抗。就简单多了。按说明书1:5000稀释，于是乎，二抗和二抗稀释液的配比是1ul和5000ul，继续常温孵化了2h。回收二抗。TBST洗膜三遍，5minX3次。 4.ECL曝光。今天很幸运，在曝光的时候碰到之前认识的一个小兄弟HMT，还认真地教我一遍，包括具体的方法及其选择事由。这次曝光发现了内参还是比较整齐，其上混有一些杂带。继续找人帮我解决。 于是乎，到今天下午，我总算把WB的流程磕磕碰碰地做了一遍，算是小有结果吧。明天看一下M3的曝光情况。期待明天SZM同学给我带来新的食管细胞109和709。还有继续筹备免疫组化的东西，落实het-1a细胞的状况。。。 附： Elivision二步法免疫组化染色步骤 1 石蜡印片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗二次，每次3分钟(3x3min) 2 根据每种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3 如果有必要，每张切片加1滴或50ul的3％H202，室温孵育10分钟，以阻断内原性 过氧化物酶的活性。PBS冲洗3x3·． 4 除去PBS液，每张印片加1滴或50ul第一抗体(用户自选)，室温孵育60分钟或4"C 过夜，建议参见每种抗体的说明书。 5 PBS冲洗3x5"。除去PB5液，每张印片加1滴或50ul聚合物增强刑(试剂 A )，室腽孵育20分钟．PBS冲洗3x3． 6 除去PBS液，每张切片加1滴或50ul酶标抗鼠／免聚什物(试剂 B )，室温孵育30分钟。PBS冲洗3x3·． 7 除上PBS液，每张切片加1滴或5Oul新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜观察3~5分钟( DAB )或10分钟( AEC )。 8 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1％HCl分化自来水冲洗，PBS返蓝． 9 如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封片，如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水， 而直接用水性封片剂。

做Western blot的单抗和多抗标签并没有什么不同单抗标签选择的一抗范围比较小一些，多抗标签选择的一抗范围可能相对大一些。而商品化二抗基本没什么差别。不管是选择什么样的抗体，在Western blot检测方面都是一样的所以做Western blot的单抗和多抗标签并没有什么不同

一种半定量检测RNA含量的技术

【答案】：两种技术都用于检测混合的DNA样品是否含有可以与特定探针杂交的DNA序列。斑点印迹比Southern blot快，并可以同时分析多个样品，而Southern bolt可以同时检测出与探针杂交的DNA片段的大小，例如Southern bolt可检测出基因重组，而斑点印迹不可以。

蛋白上样多少含量取决于SDS-PAGE上样量是多少根据实际效果来看，一般来讲蛋白量控制在2~5微克Western-blot显印的效果比较好。上样量太少可能显印不出来（WB理论检测限是皮克级），上样量太大显印后可能面积太大颜色过深，对判断可能会有带来干扰。

1. western blot每孔上样总量15-50ug大部分蛋白能做出来，跟蛋白质表达量、分子量、抗体效价都密切相关。 2. 组织一般取200mg，匀浆后蛋白常能得到几百ug，跑十块胶足够。

没信号，原因很多1.目的蛋白没转到膜上，或者你根本没分离出来2.探针有问题很久没做这个了，仔细检查一下实验过程有木有问题就好

转膜时间主要是看分子量，看看你的目的蛋白分子量是多少，还有就是我在转120KD的分子时，用时2h30min，胶上还有maker，但是用该膜做目的蛋白还是可以的。

1、首先看你做的动物是人、大鼠、小鼠、还是兔等等？确定好这个之后，在购买一抗的时候，就要选择抗以上这些种属的抗体。说简单一点，比如：你的实验动物是大鼠。那么一抗就应该是某某抗大鼠，某某就是你一抗的种属来源（host species），假如你的一抗是兔来源的，也就是兔抗大鼠，二抗就应该是某某抗兔，一般常见的是山羊抗兔的二抗。明白了么？抗体在一个实验过起着关键的作用，一抗二抗一定要选对，要不然其他的操作都是徒劳。

我最近也是老是暴不出来，别人都可以做出来，郁闷中

主要就是SDS-PAGE电泳仪和转膜仪,摇床,离心机,不需要别的仪器了,试剂药品倒是要很多

目的蛋白的含量只要达到皮克级别就能检测到～一般为纳克量～如果说上样体积～体积要根据梳子大小来定～普通的小胶一般为10uL～20uL体积～

什么是Westernblot法：Westernblot法是一种将电泳与KIJSA结合起来的技术，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定方法。Westernblot法应用：Westernblot法应用分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法，并且是一种能对蛋白进行定性和半定量的分析方法。是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 蛋白质分析中应用的Western杂交法与DNA分析应用的Southern杂交法相似，均是把电流分离的组分从凝胶转移至一种固相支持体，并均以针对特定氨基酸(Westernblot法)或核苷酸(Southern杂交法)序列所制备的特异性样品作为探针检测其相同或相似序列。 对于蛋白质来说，通常使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。Westernblot法的主要优点在于，它能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提物中检测和识别几种特异的蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上通过电转移到一张合适的印迹膜上，随后用和灵敏检测系统相偶联的抗体来识别结合在膜上的一种或几种蛋白质。这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需俊免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。因此要对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量时，Westernblot法极为有用。此外，由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行，因此溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题全都无需加以考虑。伯乐生命bio-rad Trans-Blot 转印槽是一种多功能仪器，适用于多种Westernblot法应用。多组参数灵活可设，可调节的电压设置（从30V的过夜转印到到 200 V的1 小时快速实验）。电极间距设置为8cm可用于标准转印，设置为4cm用于高强度转印。采用特级冷却芯和水循环冷却装置来调节温度－是天然酶（4°C）或高强度转印的理想选择，随着转印时间增加（多达24小时），不会引起缓冲液耗竭。

相同的是 他们都是分子杂交不同的是 dna的杂交技术——southern印迹杂交rna的杂交技术——northern印迹杂交蛋白质的杂交技术——western印迹杂交

　　一、Southern印迹杂交(Southern blot)是一9漆5年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 　　二、基本原理 　　Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片段长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下，将DNA样品放在0.吧~一.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨漆0-吧0000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA片段。原则是分辨大片段的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段的DNA则需要浓度较高的胶。经过一段时间电泳后，DNA按分子量大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带位置。另外为了便于测定待测DNA分子量的大小或是所处的分子大小范围，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA (DNA marker)进行电泳。DNA marker可以用放射性核素进行末端标记，通过这种方式，杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。 　　三、主要应用 　　一.遗传病诊断 　　二.DNA图谱分析 　　三.检测样品中的DNA及其含量 　　四.PCR产物分

我可能不对就不在这里放屁了再见

western blot结果的分析是一个主观性比较强的过程western是一个半定量的实验。所以一般是作为定性的验证试验首先要分析的就是有无目的蛋白的条带，有无条带就是一个定性的结果，这种分析是比较简单。当然这其中还要综合考虑内参等对照样品。然后就是有条带之后，各个条带灰度值的分析，而对其灰度值的量化不外乎是在肉眼可见的基础上在给出一个数值的参考而已。所以说western blot结果的分析是一个主观性比较强而且需要综合考虑的过程

A Southern blot is a method routinely used in molecular biology for detection of a specific DNA sequence in DNA samples.The northern blot is a technique used in molecular biology research to study gene expression by detection of RNA (or isolated mRNA) in a sample.

Western-blot是一种半定量的检测手段。个人认为如果要通过灰度值来计算蛋白浓度，那就是和内参来做对比，因为内参的浓度是已知且单一条带的蛋白样品。通过待测样品盒内参样品灰度值做对比可以算出待测样品大概的浓度。个人意见，仅供参考，因为一般检测蛋白含量的做法都是通过BF，BCA，Lowry之类的检测方法来测的。

提蛋白裂解液太强或者时间太长 蛋白挂了 或者裂解液太弱 时间太短 裂解不充分 蛋白浓度太低 蛋白太小跑出去了 或者太大没跑下来 转膜时间太短没转过去或者太长转过了 抗体保存不当失效了 二抗搞错了 显色液有问题 显色时间太长

细胞色素c氧化酶可以做western blot的细胞色素c氧化酶是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。ApoAlert试剂盒不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素c抗体和细胞色素c氧化酶抗体标示细胞色素c和细胞色素c氧化酶的存在位置，从而判断凋亡的发生所以细胞色素c氧化酶可以做western blot的

这种情况大多不是因为溴酚蓝造成的，而是由大分子降解造成的。 这种情况经常在做小分子western blot的时候出现，解决办法只有在处理样品的时候设法减少蛋白降解，如低温操作，加蛋白酶抑制剂，操作速度要快，现制现用。 如果还是不能解决，尝试提高胶的浓度，使目的条带尽量与你说的条带拉开距离，发文章的时候可以截掉下面的条带。Good Luck!

southernblot是Southern这个人发明的，是“核酸杂交技术”结合“核酸印迹技术”的经典实验。大致原理是：不同来源的核酸分子，经变性、退火处理，当它们之间有碱基互补配对时，就可能会结合在一起。形成DNA/DNA，DNA/RNA杂交体。那么我们可以根据。

Western blot 与 Western blotting 是一样的都是指蛋白质印迹法，具体怎么用好像也没有什么强制的要求，可以写成 Western blot 也可以写成Western blotting。简单一点写成 Western 也没有关系，或者缩写成 WB 也可以

做Westernblot时，之前的蛋白如何定量，那种方法最好westernblot结果的分析是一个主观性比较强的过程western是一个半定量的实验。所以一般是作为定性的验证试验首先要分析的就是有无目的蛋白的条带，有无条带就是一个定性的结果，这种分析是比较简单。当然这其中还要综合考虑内参等对照样品。Western Blot前不一定要做蛋白浓度测定的首先Western Blot本身也是一种半定量的检测方法，如果内参准确而且内参的量一致，可以不去计较需检测蛋白的浓度而且需要Western Blot检测的蛋白可能是表达的蛋白，检测浓度也只能是检测组分内的总浓度，未必能精确的检测出目的蛋白的浓度所以Western Blot前不一定要做蛋白浓度测定的

不是很懂这个东西，但是我也想知道这个问题，希望大家多回答一些，好让我也多增加一点知识。我觉得楼上的说的也不错，大家多提点建议

1、原理：Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。2、应用：（1）遗传病诊断；（2）DNA图谱分析；（3）检测样品中的DNA及其含量：先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片段长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。（4）PCR产物分析。扩展资料Southern印迹杂交技术的过程：Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。参考资料来源：百度百科-Southern印迹杂交技术

A Southern blot is a method routinely used in molecular biology for detection of a specific DNA sequence in DNA samples.The northern blot is a technique used in molecular biology research to study gen...

Western blot实验需要准备试剂和耗材主要有：蛋白抽提试剂 BCA蛋白定量试剂盒 5×还原样品缓冲液 10×电泳缓冲液 考马斯亮蓝染色液 10×TBST pH8.0 湿转缓冲液 PVDF膜，0.22um孔径丽春红染色液 PMSF蛋白酶抑制剂封闭液ECL发光液一抗抗体二抗抗体

Western Blot为什么必须要用内参 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为WesternBlot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候WesternBlot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的WesternBlot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。 内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。 内参即是内部参照（InternalControl），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(HousekeepingProteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 在国外发表的文章中，Western Blotting实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在WesternBlotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。 在WesternBlotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。 附：在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有： 一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。 二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。 三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。【摘自网络】

百度一下就知道了。

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-DNA杂交检测特定的DNA片段的方法，随后人们用这位发现者的名字，将这种方法称为Southern印迹法。在这之后，人们用类似的方法，对RNA和蛋白制进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。其实主要是，首先用类似方法的人叫个Southern，后面的就用剩下的方向命名了。

western blot和ELISA的基本原理是一样的，都是免疫结合反应的原理。差别主要是技术方法，免疫结合的模式，检测的目的等western blot需要先电泳后转膜，然后免疫结合，虽然操作复杂但不需要很高级的仪器设备ELISA没有这么复杂的操作，但是需要酶标仪这样比较贵的仪器western blot的免疫模式基本是抗原结合抗体，抗体结合二抗酶ELISA模式更加不固定一些，可以是抗原 抗体 二抗酶，也可以是抗原 抗体 抗原酶，或者抗体 抗原 抗体酶等等western blot更偏向于定性的检测，定量也只能是通过比较的半定量，误差可能很大ELISA既可以定性也能非常精确的定量

严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量误差就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。 内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blot 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性

Southern blot 是分析DNA的杂交技术，Northern blot是分析RNA的，而Western blot是分析蛋白质的Southern 和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA的复性过程，但过程上也有区别，主要是Southern是先电泳后变性，而Northern是先变性后电泳；Southern是碱变性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性，因为采用碱变性会导致RNA水解

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-DNA杂交检测特定的DNA片段的方法，随后人们用这位发现者的名字，将这种方法称为Southern印迹法。这里提到的Southern，原名：Edwin Mellor Southern中文名称为：埃德温・迈勒・萨瑟恩在这之后，人们用类似的方法，对RNA和蛋白制进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。其实主要是，首先用类似方法的人叫个Southern，后面的就用剩下的方向命名了。还有什么问题可以再问我。

Western blot的原理：简单来说原理就是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。Western blot，中文为蛋白质免疫印迹试验，简单来说是抗原抗体特异性结合。Western blot结果中背景较高的原因及建议：膜封闭不够—延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。一抗稀释度不适宜—对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高—建议4℃结合过夜。膜在实验过程中干过—实验过程中要注意保持膜的湿润。检测时曝光时间过长—减少曝光时间。

Tween-20Tween-20也写作Tween 20，也称Polyethylene glycol sorbitan monolaurate，中文名为吐温-20或吐温20。Tween-20为黄色或琥珀色澄明的油状液体，具有特殊的臭气和微弱苦味。分子中含有较多的亲水性基团，可与水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙二醇、乙二醇、棉子油等混溶。是常用的非离子性去垢剂。Tween-20的应用Tween-20是一种非离子型表面活性剂。用途为水包油乳化剂、可用作溶剂、扩散剂、稳定剂、润滑剂和抗静电剂等。气相色谱固定液(最高使用温度120℃)分离分析挥发油、脂肪酸酯、醇、酮和卤化物。Tween-20在Western blot 中的作用？Western blot的操作流程中大部分都用到TBST洗液，而且还是封闭，一抗二抗孵育这种比较关键的步骤。通常Tween-20作为一种非离子型表面活性剂，效果和SDS、BSA作用差不多。由于膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时可使用Tween20清除去污剂，而且浓度不要超过0.3%（0.05%效果最好），如果牛奶封闭效果不好可以提高吐温浓度。在WB洗液里的吐温是和BSA一样，对抗原抗体蛋白提供保护作用，同时因为是表面活性剂（司盘加成亲水的环氧乙烷基团后的化合物），可以减少抗体对抗原的非特异性作用，用于洗脱未结合的抗体、减少非特异性结合。Tween-20是我们用TBST的时候Tween-20得用量是0.5ml/L，不加SDS。

Western Blot为什么必须要用内参 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。 内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量误差就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。 内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blot 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 在国外发表的文章中，Western Blot 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blot实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western Blot实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。 在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中，同时用内参对应的抗体检测内参，这样可在检测目的蛋白的同时检测内参的表达。由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，①可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小②调整各样品的上样量重新进行Western Blot实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可③进行不同样品间目的蛋白表达的比较分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。

在做westernblot实验中，会用到固相载体（如nc膜，pvdf膜），在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和覆盖“蛋白结合位点以避免一抗的非特异性结合，所以有”封闭“的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固的结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。封闭液封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白，不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。【摘自网络】