a signature at the end什么意思

endA 是endonuclease（核酸内切酶）的意思，+表示这个菌的外切核酸酶没有发生缺失，-表示发生缺失。EndA+宿主菌就是指那些可以表达核酸内切酶的宿主菌，如BL21，HB101，JM系列等。

其区别是Edda的意思是“奥狄之书”。Edda的词源不确定，因为迄今为止提出的众多假设都没有被一致接受。有人争辩说，这个词来源于冰岛南部城市Oddi的名字，Snorri曾在那里接受教育。Edda的意思是“奥狄之书”。然而，这个假设被大多数北欧人拒绝了。埃达的英文版和译本的作者安东尼·福尔克斯(AnthonyFaulkes)称它“不太可能，尤其是由于历史语言学的原因”，但也因为斯诺里当时并不住在奥迪。另一种假设将Edda一词的起源与ó_r一词联系起来，这意味着“诗意的灵感”。与发生的事情完全一样看到地名Oddi的派生词的词源，这个假设遇到了严重的语言困难才能被无异议地接受。在冰岛语中，名词edda的意思是“曾祖母”：这个词是Snorri本人在他的Skáldskaparmál中使用的，它是Edda的三个部分之一。有了同样的含义（“曾祖母”），我们发现Edda是Rígs_ula中的一个人物的名字。通用名称与书名的识别吸引了研究人员，例如弗朗索瓦-泽维尔迪尔曼（Snorri"sEdda的部分法语翻译的作者），“对于他们来说，这个通用名称似乎很可能被选为作品的标题.”根据另一位伟大的法国北欧作家雷吉斯·博耶(RégisBoyer)的说法，这本书的书名应该是解释为所有神圣知识的祖母"。另一个假设源自拉丁语edo的edda，意思是“撰写”。它基于这样一个事实，即冰岛语单词kredda（最初的意思是“信条”，现代意思是“教条”）是拉丁语信条“信条”的改编。

dane数据。该数据的意思enda只有。单一的。ande精神的

奥斯卡电影《保镖》的主题曲：我将永远爱你 演唱： 惠特妮·休斯介绍：1992年,惠特妮·休斯顿开始涉足影坛,与凯文·科斯特纳联袂主演了《保镖》. 影片在全世界获得3.9亿美元的票房收入 .由惠特妮主理的电影原声唱片售出3400万张,成为90年代销量最大同时也是史上最成功的电影原声专辑,惠特妮高低自如,深厚无比的唱功和优美的嗓音、深厚的歌曲诠释功力打动了无数歌迷的心,影片主题歌《我将永远爱你》打破并成为流行音乐历史上最热门的单曲,并为她赢得无数奖项包括多项格莱美大奖,成为国际乐坛最顶级的"音乐天后")歌词如下：if i should stay i would only be in your way so i‘ll go, but i know i‘ll think of you every step of the way and i will always love you i will always love you you, my darling you, you bitter sweet memories that is all i‘m taking with me so goodbye, please don‘t cry we both know i‘m not what you need and i will always love you i will always love you accompaniment(伴奏) i hope life treats you kind and i hope you have all you dreamed off and i wish to you joy and happiness but above all this i wish to you love and i will always love you i will always love you 《我将永远爱你 - 惠特尼休斯顿》if i should stay i would only be in your way so i‘ll go, but i know i‘ll think of you every step of the way and i will always love you i will always love you you, my darling you, you bitter sweet memories that is all i‘m taking with me so goodbye, please don‘t cry we both know i‘m not what you need and i will always love you i will always love you accompaniment(伴奏) i hope life treats you kind and i hope you have all you dreamed off and i wish to you joy and happiness but above all this i wish to you love and i will always love you i will always love you回答正确的话 能给点分呗？

data

strains of E.coli that express endonuclease A

大肠杆菌基因型的基本概念野生大肠杆菌（E.coli）的基因组DNA中有470万个碱基对（bp），内含4288个基因。E.coli基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组分的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有可塑性。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或者缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型（Phenotype），把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型（Genotype）。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。这些不同基因型特性的菌株在基因工程的研究和生产中具有广泛的应用价值。大肠杆菌的主要基因型大肠杆菌的主要基因型包括：与基因重组相关的基因型（如recA、recB和recC等）、与甲基化相关的基因型（如dam、dcm、mcrA、mcrB和C、mrr和hsdM等）、与点突变相关的基因型（如mutS、mutT、dut、ung和uvrB等）、与核酸内切酶相关的基因型（如hsdR、hsdS和endA等）、与终止密码子相关的基因型（如supE和supF）、与抗药性相关的基因型（gyrA、rpsl和Tn5等）及其他与能量代谢、氨基酸代谢、维生素代谢等相关的基因型。基因工程中，经常使用的大肠杆菌几乎都来自于K-12菌株，也使用由B株和C株来源的大肠杆菌。

Cillian Murphy基里安·墨菲 来自爱尔兰的电影演员，拍过多部好莱坞电影，个人生活非常低调。 姓名：Cillian Murphy （发音"Kill-ian". 不是"Sil-ian"！！） 昵称：Cilly 译名：基里安·墨菲 斯里安·墨菲( 不准确！希望不要再出现了！！） 生日：1975年5月25日 出生地点：爱尔兰科克 身高：175 厘米 职业：演员 Murphy青少年就读Presentation Brothers College，之后在University College Cork （UCC）念法律。一开始他的兴趣在於音乐，他在一个受Frank Zappa影响的乐团「Sons of Mr. Greengenes」担任吉他手。但离开大学后，他的兴趣转移到演戏。 他第一个重要的脚色是UCC戏剧社（UCC Drama Society）制作的「Observe the Sons of Ulster Marching Towards the Somme」。之后他出现在职业舞台演出 Pat Kiernan导演、Enda Walsh编剧的「Disco Pigs」。 「Disco Pigs」在伦敦、爱丁堡、Cork巡回表演后，Mruphy从UCC辍学。 （根据他在英Blag杂志的说法，他大一被当，第二年重修到一半人就跑了，采访的女记者很委婉地说他很诚实） 「Disco Pigs」是Murphy第一个突破，他是1996年第一个版本的男主角，之后Kirsten Sheridan在2001年的电影版再度雇用他担任男主角，他也 2005年BoP的记者会，有人问他你不是试镜过蝙蝠侠吗？则回答：「我看起来像他妈的蝙蝠侠吗？」让在场记者陷入一片静默，於是有人挑战他的极限问一个问题：「比起28 Days Later的全裸演出和Breakfast on Pluto的男扮女装，你觉得哪一个比较困难？」） 近来他的作品有爱尔兰导演Neil Jordan导演、Patrick McCabe的小说改编的「Breakfast on Pluto」和英国左派导演Ken Loach描绘爱尔兰独立的「The Wind That Shakes the Barley」。 个人私事：已结婚生子了。 电影作品 1998年 The Tale of Sweety Barrett as Pat the Barman 1999年 Sunburn as Davin McDerby The Trench as Rag Rockwood 2001年 On the Edge as Jonathan Breech How Harry Became a Tree (AKA Bitter Harvest in U.S.) as Gus Disco Pigs as Darren/"Pig" 2002年 28 Days Later as Jim 2003年 Zonad as Guy Hendrickson Intermission as John Girl with a Pearl Earring as Pieter Cold Mountain as Bardolph 2005年 Batman Begins as Dr. Jonathan Crane/Scarecrow Red Eye as Jackson Rippner Breakfast on Pluto as Patrick "Kitten" Braden 2006年 The Wind That Shakes the Barley as Damien O"Donovan 2007年 Sunshine as Robert Capa Watching the Detectives as Neil 2008年 The Dark Knight as Dr. Jonathan Crane/Scarecrow The Edge of Love as William Killick Wave Riders as Narrator 2009年 Hippie Hippie Shake as Richard Neville Peacock as John Skillpa/Emma Dali & I: The Surreal Story as Stan Lauryssens White Male Heart舞台作品 1996年9月–1999年1月 Disco Pigs by Enda 巡演 as Walsh Pig/Darren 1998年 Much Ado About Nothing by William Shakespeare as Claudio 1999年5月-6月 The Country Boy by John Murphy as Curly 1999年9月 Juno and the Paycock by Sean O"Casey as Johnny Boyle 2002年2月 The Shape of Things by Neil LaBute as Adam 2003年8月 The Seagull by Anton Chekhov as Konstantine 2004年2月-4月 The Playboy of the Western World by John Millington Synge 巡演 as Christy Mahon 2006年12月-2007年2月 Love Song by John Kolvenbach as Beane

n=5;a = rand(n);for i=1:size(a,1)[~,positionTemp]=find(a(i,:)>0.5,1,"first");a(i,positionTemp)=0.5;enda = floor(900*rand(1))+100;b = mod(a,10)c = a - mod(a,100)d = c+ba = randi([100 999],1);b = a-mod(floor(a/10),10)*10;扩展资料：MATLAB数学函数库包括了大量的计算算法。从基本算法如四则运算、三角函数，到复杂算法如矩阵求逆、快速傅里叶变换等。MATLAB应用程序接口（API）是一个使MATLAB语言能与C、Fortran等其它高级编程语言进行交互的函数库。该函数库的函数通过调用动态链接库（DLL）实现与MATLAB文件的数据交换，其主要功能包括在MATLAB中调用C和Fortran程序，以及在MATLAB与其它应用程序间建立客户、服务器关系。参考资料来源：百度百科-MATLAB

仰望天空的少女

从左到右→喵呀！长出猫耳朵了 讨厌讨厌讨厌 enda~快把它拿开耳朵拿开u30fb゜u30fb(PД`q。)u30fb゜u30fb“哇擦擦擦 天噜天噜天噜taku喵好萌萌萌毛茸茸好想摸好想摸 X n"名字都翻成罗马拼音了，怪我实在搜不到这CP的名字u30fb゜u30fb(PД`q。)u30fb゜u30fb。

蒙特～

你好朋友你说的这个摩托车估计又是国内的厂家起一个外国的英文字母而已啦，也就是小品牌的吧，祝你好运。

Kenny n. 肯尼

不含甲基化的位点，否则不能够作为感受态。F-，F 因子缺失φ80dlacZΔM15，lacZDM15（Lactose）Map position：8 min功能：lacZM15是表达β-半乳糖苷酶α片断的一段基因，当M15缺失（△M15）时，lacZ基因虽然能表达ω片断，但不能表达α片断，β-半乳糖苷酶没有活性。当带有lacZ（α片断）基因的lac操纵子通过载体DNA（如pUC19 DNA）转化到lacZ△M15基因型的细胞 (如E.coli JM109）时，在有IPTG (异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷) 存在的情况下, β-半乳糖苷酶表现出活性,它能分解X-gal (半乳糖类似物)，使其呈现蓝色。因此可以通过平板上的蓝白菌落进行克隆体的鉴定。Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，功能：deoR 是大肠杆菌中deo 操纵子的调节基因，它表达的阻遏蛋白对deo 操纵子具有重要的调控作用。deo 操纵子位于大肠杆菌基因图谱100 min 的位置，它含有deoA、deoB、deoC 和deoD 等结构基因，分别表达DNA 代谢所需的酶类，即胸腺嘧啶磷酸化酶、磷酸转位酶、脱氧核糖磷酸醛缩酶和嘌呤核苷磷酸化酶。deoR 基因的变异，使deo 操纵子的阻遏蛋白不能表达，宿主细胞合成大量的dCTP，可以选择性地改善大分子DNA 的转化。recA1，recA (Recombination) 减少克隆DNA的非特异性重组。功能：recA 基因表达ATP 依赖型DNA 重组酶，它在λ-噬菌体与基因组DNA 的溶原重组时起作用，同时具有对DNA 放射性损伤的修复功能。由recA 基因的变异所产生的基因型使同源或异源DNA 的重组不能进行，保持插入DNA 的稳定性，对DNA 的转化有利。一个菌株的基因型如果是recA，则说明此菌株的表现型是重组缺陷的。endA1，endA (Endonuclease) 无Endonuclease I 酶活性，有利于质粒的纯化。功能：endA 基因表达非特异性核酸内切酶I，它能使所有DNA 双链解开，在DNA 的复制和重组中起重要作用。endA 基因的变异将使插入的外源DNA 更加稳定，提取的质粒纯度更高。hsdR17(rk-，mk+)，限制缺陷，修饰正常 可使 DNA 甲基化，但不限制外源 DNA 。hsdR (Host specificity defective)功能：hsdR 基因表达I 型限制酶EcoK (K12 株) 或EcoB (B 株)，在大肠杆菌细胞中起到一种“抗体”的作用，对外来的各种 DNA 有严格的限制。HsdR 基因的变异导致菌株细胞内的I 型限制酶EcoK 或EcoB 活性缺失，这对于外来基因的导入及质粒转化是有利的。hsdS20 (rB-、mB-)，其中S20 代表特异性识别蛋白发生变异，()中的 rB-、mB-表示由于S20 的变异而导致B 株来源的hsdR 和hsdM 的功能缺失。phoA，supE44，supE (Suppressor)功能：supE 基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG 结合，使蛋白质合成停止。supE 基因发生变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密码子UAG，蛋白质合成仍能继续，并使UAG 作为一个密码子来编码谷氨酰胺（Glutamine），从而使发生了琥珀突变（AAG→UAG）的基因对蛋白质表达得以延续，因此称supE 为琥珀突变抑制因子。supE44（sup 基因座E 的44 位突变）。如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“-”代替大写字母，如trp-31。λ-，thi-1，功能：thi 基因包含有thiA、thiB、thiC、thiD、thiK、thiL 等。thiA 表达硫氨素噻唑转运蛋白、thiB 表达硫氨素磷酸盐焦磷酸化酶、thiC 表达硫氨素嘧啶转运蛋白、thiD 表达磷酸甲基化嘧啶激酶、thiK 表达硫氨素激酶、thiL 表达硫氨素甲磷酸激酶。thi 的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养基中必须添加硫氨素（VB1），细胞才能正常生长。硫胺素代谢突变 在基本培养基上的生长需硫胺素的存在。gyrA96，gyrA（Gyrase）功能：gyrA 基因表达DNA 促旋酶A 亚基。DNA 促旋酶在DNA 复制时具有使DNA 解旋和回旋的作用。萘啶酮酸 (Nalidixic acid)、4-喹啉（4-Quinoline）等抗生素抑制DNA 促旋酶的活性是通过与促旋酶复合体 (A2B2)中的A 亚基的结合实现的。gyrA 基因的变异使DNA促旋酶A 亚基不能正常表达，萘啶酮酸和荧光喹啉等失去结合目标，从而使该基因型的菌株具有了对萘啶酮酸（Nalr） 和荧光喹啉的抗性。relA1relA（Relaxed）功能：relA 是松弛调节基因，对RNA 的合成具有调节抑制作用。同时relA 基因还表达ATP：GTP3"-焦磷酸转移酶，负责在氨基酸饥饿状态下鸟苷3"，5"-二磷酸 (ppGpp) 的合成，以适应饥饿环境。 relA 基因的变异对目的基因的转录有利。

littleend音乐是中国。LittleEnd(ENDA)电子音乐制作人，主要风格有Chillstep、FutureBass等。通常制作以融入周围环境和大自然的氛围音乐，如城市、乡村、星空、海洋等。远离城市的喧嚣，回到大自然的宁静。

大肠杆菌血清学分型基础（即其抗原） 大肠埃希菌主要有三种抗原：O抗原，为细胞壁脂多糖最外层的特异性多糖，由重复的多糖单位所组成。该抗原刺激机体主要产生IgM类抗体（出现早，消失快）。K抗原，位于O抗原外层，为多糖，与细菌的侵袭力有关。K抗原分为A，B，L三型。H抗原，位于鞭毛上，加热和用酒精处理，可使H抗原变性或丧失。H抗原主要刺激机体产生IgG类抗体，与其他肠道菌基本无交叉反应。

1、溶液P在使用前先加入RNaseA将试剂盒中提供的RNaseA部加入)，混匀，置于2-8℃保存。2、使用前请先检查平衡液BL溶液P和P是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。3、注意不要直接接触溶液P和P，使用后应立即盖紧盖子。4、所有离心步骤均为使用常规台式离心机宰温下进行离心，速度为12.000rpm~13.400xg。5、提取的质粒量与细菌培养浓度，质粒拷贝数等因素有关。6、实验前使用平衡液BL理吸附柱，可以充分激活硅基质膜，提高得率。7、用平衡液BL理过的柱子最好当天使用，放罟时间过长会影响效果。8、去蛋白液PD以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA(TG，BL1.HB01ET2567，JM列)等核酚酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD9、本产品不可用于临床诊断或治疗，仅可用于工业或者科研领域非医疗目的用途。

用format rat命令让其显示为分数形式

楼上的方法都很好，谢谢大家")这个问题的起源是想判断一个循环，当向量a中的元素不全为1时执行while 循环，a中只有0、1、2这三类数据。例如，初始时a=[1 2 0 1 0]，但是我用（while a~=1）或者（while a~=[1 1 1 1 1]）时程序根本不执行while中的语句，所以才想把a转换成数字12010，这样可以直接跟11111进行比较。下面这个语句倒是可以用（while not(all(a==1))），但是总感觉效率不高（a的维数大概是500），不知道这条语句跟上面转换成数字后进行比较的方法相比哪种方法的效率高？请问有没有其它好的办法啊？

拼错了，是end city，末影城。1.9版本时新加入的末地城堡。杀末影龙后就生出一个传送门，可以传送到末影城堡之地。

获取一个基因CDS序列的方法如下： 打开NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了） 然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图） 点击CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。 由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物，例如：! 正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5"到3"的方向，一般不会从3"到5"，所以我们的CDS虽然没有注明方向，但是其实也是5"到3"。 虽然可以这么简单粗暴的设计引物，但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。 Primer 5的使用 如下图，首先点击File->New->DNA Sequence， 然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。 下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。 点击左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense 如果对现在的引物不满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们删除掉末尾三个碱基，之后需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。 最后点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5"到3"的序列。所以非常方便。 这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。 Primer 5的使用 根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。 从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择，那是不是每个位点都可以用呢？当然不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的基因）本身没有的酶切位点！ 所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。 还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不可以选，其他的都可以选。 不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。 于是我们得到如下引物： 好了，我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。 质粒构建 终于到正题了！ 待引物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到 100 μM 作为母液，取一些稀释到 10 μM 做下一步实验了。 首先我们P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体系及反应条件如下图： 模板的获取 PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切，同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址 http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶切所用的最佳Buffer。 酶切回收之后的片段进行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下： 现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成，不过我保险起见，一般连接30 min， 切勿连接过夜！ 连接完成之后便是转化，挑菌（单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！ TRIzol法抽提RNA 提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比较稳定且广泛应用的，当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。 ABOUT TRIzol 注意事项及原理 注意事项： 1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又会迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。提取RNA时使用专门的RNase-free的枪头和离心管。 2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗！ 溶液配方及原理： 1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞内含物的同时保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 2、氯仿：氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。 3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。 4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。 操作步骤 1、细胞破碎 A、组织：按1 mL/50~100 mg组织样品的比例向打散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过TRIzol体积的10%。 B、贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪反复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污染。 C、悬浮细胞：悬浮细胞离心收集后，直接按1 mL/5~10×106个细胞（动物、植物或酵母）的比例加入TRIzol试剂。加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造成mRNA的降解。 如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2℃~8℃，12000×g离心10 min去除这些物质。 关于TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量： 一般情况下，根据细胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅供参考） 2、氯仿抽提分层 加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过高否则会导致RNA断裂。离心后液体分为三层，下层为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的水相。RNA在上层水相中，水相的体积约为加入的TRIzol体积的60%。 3、用异丙醇使RNA沉淀 将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机相。 加入与水相等体积的异丙醇，室温孵育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底，为无色胶状。 4、用乙醇洗涤去除残留的蛋白质和无机盐 去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。 5、用DEPC水溶解RNA 去除上清后，将管子敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉淀变成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解。根据后续实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。 逆转录法合成cDNA 一般逆转录（也可称作反转录）都有现成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作，问题都不大，在这里我就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。 Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序列为5"-(P)NNNNNN-3"，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。 Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5"端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。 两种引物可据实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物。 操作步骤 步骤简述如下：按照下图中1配制溶液，然后65℃处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。 连接产物的转化 常用的感受态细胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α，可以自己制备也可以购买商业化的感受态。 ABOUT Transformation 注意事项 1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感受态转化效率最高； 2. 避免反复冻融感受态细胞； 3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸； 4. 感受态和连接产物（或质粒）用量要适中，并不是越多越好。 操作步骤 1. 取50 μL感受态细胞置于冰上融化； 2. 加入5 μL连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可），混匀，置于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）； 3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上静置2 min； 4. 加入500 μL无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使细胞复苏； 5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取少量LB（50 μL左右），重悬沉淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应抗生素）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质粒：直接取20 50 μL涂于LB培养板上培养即可。 质粒的小量提取 ABOUT 质粒抽提 实验原理： 较常用的质粒提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（<15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（>15kb）。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法，其原理为：当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。 由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会再次形成。 在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。 当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。 本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。 实验试剂（试剂盒试剂配方不清楚，以下配方见《分子克隆实验指南》） 1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A 原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除质粒中混有的RNA，其不受EDTA的影响。 2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS 原理：0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。 3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸 原理：这一步的K+置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。 操作步骤 1、将过夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽量吸除上清。若暂时不提取，可将沉淀保存于-20℃，也可直接将菌液保存于4℃（短时间）。 注意：如果菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。 2、柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。 注意：若柱子放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。 3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用量也应成比例增加），并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作（不然P1+P2+P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时可过同一个吸附柱。 注意：菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。另外，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min，以免超过时间。但是时间也不可过短，以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。 注意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 5、向离心管中加入700μl溶液P3（记得冰上预冷），立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的离心管中，以免沉淀飘起。 注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μl）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 7、可选步骤：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。 如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步省略。 8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。 9、重复操作步骤8。 10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃预热），室温放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。 注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中．重复步骤 11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率，但也不应过大，以免所提质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。 结果判断 1、使用紫外分光光度计对质粒浓度及纯度进行测定 （1）检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能是蛋白质污染，偏高则可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。另外，测出来的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度和纯度不准确。 （2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样（如样品为2μl所提质粒+48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液+48μl ddH2O）。 2、酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测 （1）选用合适的内切酶对所提质粒进行酶切，并与未切质粒及转化用原质粒一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切结果及所提质粒与原质粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为目的质粒。 （2）所提质粒（未酶切）的电泳条带可能为一条带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口（保持环状，失去超螺旋），或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的，因此会出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。 测序结果的分析 构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。 可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即送菌液返还他们抽提的质粒）。 测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下： 在公众号内回复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！ 测序结果返回之后我们就可以分析测序结果了。 一般常用的序列比对软件有DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大家可以根据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。 DNAMAN 1. 首先打开软件，左侧数字为各个通道的编号，每个通道只能载入一个序列： 2. 然后点击File->New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl+A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。 3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File->Open打开测序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence->Multiple Sequence Alignment； 4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列的通道，点击OK即可： 5. 后面基本是一直点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands： 6. 然后一直下一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突变，如果是即质粒序列正确。 Chromas 1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File->Blast Search:

「エレファン」仆の名はエレファン ちいさな象の子boku no mei ha erefan chiisana zou no koママが大好きさ でもおねだりも大好きmama ga daisuki sa demoonedarimo daisukiぽっかり浮かんだ バター色の月pokkari uka nda bata^ shoku no gatsu「おいしそう あれが食べたい」と言ったね( oishisou arega tabeta i ) to itsutta ne涙でねだった 仆のほっぺにnamida denedatta boku nohoppeni长いお鼻で キスをくれたあとnagai o hana de kisu wokuretaatoママは「待っていてね」とほほえんだmama ha ( matte itene ) tohohoendaママは森へ行き お月さま探しmama ha mori he iki o gatsu sama sagashi仆はひとりきり ずっと待っていたけどbokuha hitorikiri zutto matte itakedoママが心配で 森へ駆け込むとmama ga shinpai de mori he kakekomu toミミズクが言った 「ママは湖さ」とmimizuku ga itsutta ( mama ha mizuumi sa ) to寂しい夜道で一人 愿った「ママに会いたい」sabishi i yomichi de hitori negatta ( mama ni ai tai )そして 湖に落ちたお月さまを见つけたんだsoshite mizuumi ni ochi tao gatsu samawo mitsu ketandaお鼻を伸ばして 水に映る月o hana wo nobashi te mizu ni utsuru gatsuとろうとするママ 仆には见えたのさtoroutosuru mama boku niha mie tanosa全部 仆のためにしてくれた…zenbu boku notamenishitekureta ...湖のほとり ママを见つけたよmizuumi nohotori mama wo mitsu ketayo铳にうたれて 倒れた仆のママをjuu niutarete taore ta boku no mama woいつもしてくれたみたいにお鼻でitsumoshitekuretamitainio hana deママにキスすると 月から声がしたmama ni kisu suruto gatsu kara koe gashita「エレファンあなたは( erefan anatahaほんとは强くて とっても优しいhontoha tsuyoku te tottemo yasashiiママの宝物よ ずっと」mama no takaramono yo zutto )「真夜中のメリーゴーランド with 手嶌葵」甘い匂いにamai nioi niつられてやってきたtsurareteyattekita耻ずかしがりやhazukashi gariyamy sweet little birdmy sweet little bird指を鸣らしながらyubi wo nara shinagaraダンスを踊りましょうdansu wo odori mashouきっとすてきな梦见るkittosutekina yumemi ruとても愉快なパーティさtotemo yukai na pa^tei sa流れ星饰りましょうnagareboshi kazari mashouパステルカラーの雪がpasuterukara^ no yuki ga街を染めたらmachi wo some tara动き出すのさugoki dasu nosa真夜中のメリーゴーランドmayonaka no meri^go^randoショーケースの中に并んだsho^ke^su no nakani naran da伤ついた仆のハートkizutsu ita boku no ha^to慌てて鸣らしたクラクションawate te nara shita kurakushon编みかけのレースをami kakeno re^su woほどいたら出かけましょうhodoitara deka kemashouママには内绪で借りたmama niha naisho de kari taハイヒールはいてhaihi^ru haite何にもいらないよnani nimoiranaiyo君がそばにいるからkun gasobaniirukara夜の街も色づくのさyoru no machi mo shoku dukunosa目と目合ったらme to me atta ra回りだすのさmawari dasunosa真夜中のメリーゴーランドmayonaka no meri^go^randoとても愉快なパーティさtotemo yukai na pa^tei sa流れ星饰りましょうnagareboshi kazari mashouパステルカラーの雪がpasuterukara^ no yuki ga街を染めたらmachi wo some tara动き出すのさugoki dasu nosa真夜中のメリーゴーランドmayonaka no meri^go^rando 翻译的话我怕我这种自学日语的不能承担此重任。。。

最佳答案 回答者：匿名用户 时间:2009-08-28 去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛？>>> pET-28（a）+质粒的拷贝数在细菌里本身就是很低，所以和其他质粒相比量会少一些，你可以多摇一段时间，16-18h都没有问题。 略微提高抗生素的浓度，有助于提高拷贝数。还有就是不要用BL21等表达菌提质粒，表达菌多没有endA－突变，质粒的完整性和保真性都不如DH5alpha，TOP10等菌，提取的质量也不高，因为碱裂解时会有大量的多糖干扰，质和量都不如DH5α和TOP10。 铺较高抗生素浓度的板子，重新划线，挑个大点的菌落再摇。培养时候也加大抗生素浓度。

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matlab for循环的时候本质是类似如下的操作for j=AxxxendA就是一个向量。j遍历向量A里的每个元素。你这里的这个向量就是1:i:40，这个向量在开始进行for循环的时候，就定死了。这个时候i=1，所以就是1:1:40，就是[1 2 3 ... 40]你后面再去改这个i，不会影响这个向量了。你想改变步长就用while循环吧。

问题一：不想去韩语怎么说 ??? ?工? ? ? ? ? ? ? 问题二：韩文不想怎么说 ??,???. 发音按拼音来发大概是，xi lao, xi lao you，指不喜欢，不想干什么的意思。 ?? ?? ???. bou gu xi(b,只做口型不发音) ji an na you，指不想（谁），don"t miss *** . ??叮???. sang ga ao(b) sao you， 指没什么想法，没想过什么》have no idea的意思 问题三：不要想我 用韩文怎么说 ?? ???? ? （na rl sen ga ha ji ma） 问题四：我不想说的韩语怎么读 ??? ??. 问题五：我不想这样 用韩语怎么说 我不想这样 ? ??? ?? ??(&福50836;). 如果是敬语，就写上括弧里面的。 问题六：不想告诉你。用韩语怎么翻译 您好， 我不想告诉你 的韩文是 ?? ?? ? ? ? ? ?? 问题七：“我不喜欢你”用韩语怎么说？用汉字表示 我不喜欢你 nan nuo ler an zuo a hai 问题八：你是不是不喜欢我了的韩文怎么写 你是不是不喜欢我了 ?? ?? ????? 问题九：不理你了 用韩语怎么说 这个要看具体语境 表达意思也不完全相同(非敬语表达） ???? ?? ?????(现在开始无视你） ???? ???(不搭理） ? ?? ?? ???(不搭理。躲着走) ???? ???(不搭理你了) 一般开玩笑的时候都说第一个 无视 请参考 问题十：我不喜欢你用韩文怎么说，怎么写 nan tangxi nen zua haji anenda 我 你 喜欢 不 (语气词) (韩文语法是动词于名词之后)

同性恋权利运动的兴起是为了回应被同性恋权利活动分子称为的对同性恋者的“歧视”和“偏见”。最先的一次同性恋权利运动发生在二战前的德国，以Magnus Hirschfeld为中心。这次同性恋权利运动完全被阿道夫·希特勒的纳粹运动镇压（参看纳粹德国的同性恋者）。在美国，紧接着二战结束后的几年就有了一些同性恋权利运动的步伐。在这段时间里，阿尔佛雷德·金塞发表了《男性性行为》（""Sexual Behavior in the Human Male""）一书，这是第一本以科学眼光研究性主题的著作。金塞通过大量的研究发表了一个惊人论断：总人口中大约有10%的人是同性恋者，直接向当时流行的观念提出了质疑。在这本著作发表以前，同性恋通常不会成为讨论作的主题，但是在它发表之后，同性恋话题开始出现在一些刊物中，甚至是像《时代杂志》（""Time Magazine""）、《生活杂志》（""Life Magazine""）等中。虽然同性恋话题进入了主流杂志的讨论中，但是直到20世纪60年代以前，社会的意识或法律都没有多少的改变。直到60年代的“性革命”。这是一段很多社会领域放生巨变的时期，包括性方面。这些著作，连同二战后开始的向城市的大量移民，同性恋社区开始在市中心形成，而同性恋者也开始意识到他们是作为社会少数族群而不是一些少数的“性别颠倒”的孤岛而存在。虽然在20世纪早期，同性恋酒吧就已经存在，但是数量仍然很小。 20世纪50年到到60年代，随着同性恋社区的发展，同性恋酒吧的普及，以及同性恋身份认同的加深，同性恋开始对他们的作为社会“流浪者”和“犯罪者”的地位日益不满。然而，在60年代晚期以前，他们仍然只有很少的社会力量。1969年的石墙骚乱被认为是现代同性恋运动的出发点。当时所有相关的秘密变化都达到了转折点。同性恋者开始大规模的组织起来要求合法的地位、社会认同和平等。石墙骚动的一个后果是“同性恋解放阵线”的建立（Gay Liberation Front，GLF，建立于纽约市）。这个组织的“一个同性恋者的宣言”（A Gay Manifesto）为刚刚形成的同性恋运动设立了目标。阵线的分支开始遍及全美。这些组织成为全球各种争取同性恋平等权利的组织创立的基础。今天，保卫同性恋者免受憎恨、暴力和其他形式的歧视是美国同性恋权利的主要议题，他们把这些描述为人权的本质。确实，在美国最有影响力的同性恋权利组织之一就称为“人权战线”（Human Rights Campaign）。其他的同性恋权利组织包括“全国男女同性恋工作组织”（National Gay and Lesbian Task force，NGLTF），“同性恋的双亲和朋友”（Parents and Friends of Lesbians and Gays，PFLAG）和“反诽谤男女同性恋联盟”（Gay and Lesbian Alliance Against Defamation，GLAAD）。同性恋运动在一些地区取得了成效。鸡奸法在美国很多州都于20世纪被取代或推翻（根据2003年的劳伦斯对决德克萨斯州的案件中，所有的鸡奸法都被判为是违宪的）。很多公司和地方政府都在他们的非歧视规定中增加禁止基于性取向的歧视。在一些地区，对同性恋的暴力被视为是仇恨罪行，并会受到严厉的惩罚。美国的佛蒙特州，加拿大的 魁北克省和新斯科舍省、欧洲的一些国家为婚姻提供了另一种选择：公民结合（civil union）。荷兰和比利时允许同性婚姻；加拿大承认两个同性间的共同法婚姻（common-law marriages）。最近的安大略省法院和魁北克最高法院要求联邦政府在未来两年内为同性恋者提供完全的权利。同性恋在一些地区可以领养子女，虽然只有很少的地方允许他们可以与伴侣一起领养子女。在文化方面，相似的变化正在进行着。正面和写实的同性恋角色在电视和电影上开始增多。在美国，同性恋权利运动发展的主要阻力通常是基督教权利和其他保守人士，通常是受到共和党的支持。在美国，在私营企业中，没有防止雇员因为性取向受到就业歧视的联邦法律。但是，大多数美国的跨国大公司（例如IBM、微软、福特汽车、可口可乐、波音、迪士尼、AOL等），都制定了公司内部的基于性倾向的反歧视政策，适用于公司内部的就业、福利、升职、工作环境和公司文化、公司决策等各方面。并且，在14个州，包括哥伦比亚特区，以及超过140个城市中都有禁止歧视的禁令。直到2003年7月，颁布有在私营企业中禁止机遇性取向的歧视的地方有加利福尼亚州、康涅狄格州、夏威夷州、马里兰州、马萨诸塞州、明尼苏达州、内华达州、新罕布什尔州、新泽西州、新墨西哥州、纽约、罗得岛州、佛蒙特州和威斯康星州。这些禁令也包含了很多的其他方面，例如住房或公共设施。一个禁止全美范围内反同性恋就业歧视的议案已经交给美国国会讨论，也就是所谓的《就业非歧视法案》（Employment Nondiscrimination Act，ENDA）。但是在当前由共和党控制的国会中通过该法案的前景并不明朗。1998年3月4日，美国最高法院在对""Oncale v. Sundowner Offshore Services""的判决中表示,联邦法律对发生在工作中的性骚扰，无论双方是异性还是同性同样适用。但是，较低级的法院关于这个判决是否适用于有反同性恋意图的骚扰仍存在分歧。

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LS的就这么简单？为何不给完全版？偶晚上发完全版的。

还有其他歌词吗？信息太少了

你好，直接用翻译软件不就可以了吗，翻译软件如灵格斯，金山快译，等，要是你不想下载，你也可以在线使用谷歌翻译http://www.hao123.com/ss/fy.htm，希望能够帮助到你，还有问题的话，可以在hi我，希望能够帮助到你....

Anda

endA 是endonuclease（核酸内切酶）的意思,+表示这个菌的外切核酸酶没有发生缺失,-表示发生缺失.所以对于endA＋菌,就需要用WB洗一下,尽可能把分泌的外切核酸酶洗掉。

b z d

歌曲名称：《叙情诗》歌曲演唱：彩虹乐队作词：hyde作曲：ken／L"Arc～en～Ciel编曲：HajimeOkano日文歌词：季节は色を変えて几度巡ろうともこの気持ちは枯れない花のように揺らめいて君を想う奏で合う言叶は心地良い旋律君が傍に居るだけでいい微笑んだ瞳を失さない为ならたとえ星の瞬きが见えない夜も降り注ぐ木漏れ日のように君を包むそれは仆の强く変わらぬ誓い梦なら梦のままでかまわない爱する辉きに溢れ明日へ向かう喜びは真実だからThelovetoyouisaliveinme.wo-everydayforlove.Youareasideofmewo-everyday.残されて悲しい记忆さえそっと君はやわらげてくれるよはしゃぐように懐いた柔らかな风に吹かれてなびく鲜やかな君が仆を夺う季节は色を変えて几度巡ろうともこの気持ちは枯れない花のように梦なら梦のままでかまわない爱する辉きに溢れ胸を染めるいつまでも君を想いThelovetoyouisaliveinme.wo-everydayforlove.Youareasideofmewo-everyday.罗马音歌词：kisetsuwairowokaeteikudomeguroudomokonokimochiwakarenaihananoyouniyurameitekimiwoomoukanadeaukotobawakokochiyoisenritsukimigasobaniirudakedeiihohoendahitomiwonakusanaitamenaratatoehoshinomabatakigamienaiyorumofurisosogukomorebinoyounikimiwotsutsumusorewabokunotsuyokukawaranuchigaiyumenarayumenomamadekamawanaiaisurukagayakiniafureasuemugauyorokobiwashinjitsudakaraThelovetoyouisaliveinme.wo-everydayforlove.Youareasideofmewo-everyday.nokosaretekanashiikiokusaesttokimiwayawaraketekureruyohashaguyouninatsuitayawarakanakazenifukaretenabikuazayakanakimigabokuwoubaukisetsuwairowokaeteikudomeguroutomokonokimochiwakarenaihananoyouniyumenarayumenomamadekamawanaiaisurukagayakiniafuremunewosomeruitsumademokimiwoomoiThelovetoyouisaliveinme.wo-everydayforlove.Youareasideofmewo-everyday.中文大意：季节改变色彩已几度轮回心情似永不枯萎的花般摇曳想念着你合奏的言语是心中的旋律只要你在身边就好为了不失去你那微笑的双瞳即使在看不见星光闪烁的夜里如透过枝叶罅隙洒下的日光般将你围绕那是我坚定不变的誓言如果是梦一直在梦中也好满心喜悦迎向满溢爱的光辉的明日因为这是真实的Thelovetoyouisaliveinme.wo-everydayforlove.Youareasideofmewo-everyday.残留的悲伤记忆被你温柔融化你像柔和的风吹拂下飘荡的艳丽色彩吸引了我季节改变色彩已几度轮回心情似永不枯萎的花如果是梦一直在梦中也好爱的光辉染满胸臆永远想念着你Thelovetoyouisaliveinme.wo-everydayforlove.Youareasideofmewo-everyday.

最佳答案 回答者：匿名用户 时间:2009-08-28 去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛？>>> pET-28（a）+质粒的拷贝数在细菌里本身就是很低，所以和其他质粒相比量会少一些，你可以多摇一段时间，16-18h都没有问题。 略微提高抗生素的浓度，有助于提高拷贝数。还有就是不要用BL21等表达菌提质粒，表达菌多没有endA－突变，质粒的完整性和保真性都不如DH5alpha，TOP10等菌，提取的质量也不高，因为碱裂解时会有大量的多糖干扰，质和量都不如DH5α和TOP10。 铺较高抗生素浓度的板子，重新划线，挑个大点的菌落再摇。培养时候也加大抗生素浓度。

中川翔子 - 続く世界作词∶meg rock作曲∶藤末树どれほど时间が経てば止むのだろう？dorehodojikangatatebatomunodarou冻えてもぅ动けないkogoetemouugokenai頬を伝う雨hoowotutauame息をする度にikiwosurutabini远ざかっていくtoozakatteikuかけがえない世界kakegaenaisekaiさよならさえ云えないままsayonarasaekumoenaimamaこぼれ落ちる君のすべてkoboreoqirukiminosubete放さぬ様に握りしめたhousanuyouninigirishimetaこの痛みもそのぬくもりもkonoitamimosononukumorimoどれほど叫べば 君に届くのだろう？dorehodosakebeba kiminitodokunodarou想いはただ降り続くomoiwatadafurituduku叶うあてもなくkanauatemonaku全部ひきかえにしてもzenbuhikikaenishitemo构わないkamawanai一目逢えるのならiqimokuaerunonaraさよならさえ云えないままsayonarasaekumoenaimamaこぼれ落ちる君のすべてkoboreoqirukiminosubete话さぬ程よみがえるよhanashisanuhodoyomigaeruyo君の声も仆らの日々もkiminokoemobokuranohibimoもしかしてあの时moshikahsiteanotokiこんな気持ちでいたの？konnakimoqideitano今 仆の隣 君が微笑んだima bokunodonari kimigahohoendaきっといつまでもkittoitumademoさよならさえ云えないままsayonarasaekumoenaimamaこぼれ落ちる仆のすべてkoboreoqirubokunosubete放さぬ様に握りしめたhousanuyouninigirishimetaこの痛みもそのぬくもりもkonoitamimosononukumorimo

我在那一角落患过伤风演唱:陈崎贞专辑:只能谈情,不能说爱dalendalendalendalendalendalendaladalendalendalendalendalendadalendalendalendalendalendalendalendadalendalendalendalendalendadalendalendadalendalendalendalendadendalenladalendadalendadadalenlendadalendalendadadadadalendalendadadadadalendadalendadaladendalenladalendadalendadadalenlendadalendalendadadadadalendadalendaladalendadalendalendalendalenhahahadalendaha

逢いたくて逢いたくてaitakute aitakuteこの胸のささやきがkono mune no sasayaki gaあなたを探しているanata wo sagashiteiruあなたを呼んでいるanata wo yondeiruいとしさの花itoshisa no hana抱えては微笑んだdaete wa hohoendaあなたを见つめてたanata wo mitsumeteta远い春の日日tooi haru no hibiやさしさを纺いでyasashisa wo tsumuide织り上げた恋の羽根oriageta koi no hane绿の风が吹くmidori no kaze ga fuku丘によりそってoka ni yorisotteやがて时はゆき过ぎyagate toki wa yukisugi几度目かの春の日kidomeka no haru no nichiあなたは眠る样にanata wa nemuruyouni空へと旅立ったsorae to tabidattaいつまでもいつまでもitsumademo itsumademo侧にいると言ってたsobaniiru to ittetaあなたは嘘つきだねanata wa usotsuki daneわたしを置き去りにwatashi wo okizari ni木兰のつぼみがkiran no tsubomi ga开くのを见るたびにsakuno wo miru tabiniあふれだす泪はafuredasu namida wa梦のあとさきにyume no atosakiniあなたが来たがってたanata ga kita gattetaこの丘にひとりきりkono oka ni hitorikiriさよならと言いかけてsayonara to iikakete何度も振り返るnandomo furikaeru逢いたくて逢いたくてaitakute aitakuteこの胸のささやきがkono mune no sasayaki gaあなたを探しているanata wo sagashiteiruあなたを呼んでいるanata wo yondeiruいつまでもいつまでもitsumademo itsumademo侧にいると言ってたsobaniiruto itsuttetaあなたは嘘つきだねanata wa usotsuki daneわたしを置き去りにwatashi wo okizari ni望采纳~

叙情诗(jyojyoushi) words:hyde music:kenkisetsu wa iro wo kaete ikudo meguroudomokono kimochi wa karenai hana no youni yurameitekimi wo omoukanade au kotoba wa kokochi yoi senritsukimiga sobani iru dakedeiihohoenda hitomi wo nakusa nai tamenaratatoe hoshi no mabata kiga mienai yorumofuri sosogu komorebi no youni kimiwo tsutsumusorewa boku no tsuyoku kawaranu chigaiyumenara yume no mamade kamawanaiaisuru kagayakini afure asue mugau yorokobiwashinjitsu dakaraThe love to you is alive in me.wo-every day for love.You are aside of me wo-every day.nokosarete kanashii kiokusae sttokimiwa yawarakete kureruyohashagu youni natsuita yawarakana kazeni fukaretenabiku azayakana kimiga boku wo ubaukisetsu wa iro wo kaete ikudo meguroutomokono kimochi wa karenai hana no youniyumenara yume no mamade kamawanaiaisuru kagayakini afure mune wo someruitsumademo kimi wo omoiThe love to you is alive in me.wo-every day for love.You are aside of me wo-every day.建议：亲，以后找彩虹的资料、歌词啥的可以去“虹御所-资料库”嘛，那里什么都有，是个好地方所http://www.kisslarc.com/data/news.htm

su be te wo ka ke te i donn dama ke wo si ta ta me te sa ke bua no hi mo ka si ka tunn de taha wa no re te bu za ma da ttako ko ro no na ka de na yann desu ga ru yo u ni o wa ri no zonn da a no hi no ko to ba ki zann de nn daann ta no ko to ba i tu da tteo ri tu gu ta i yo u hi ka ri no yo u nia ra so i no na ka de ka ga ya i teya ti ru: na ku go to mo na ku hi ru mo na kua sa mo ka ku tte a ka ku tena ma e mo na ku te i tu da ttese ka i wa o wa ru ha zu da ttaa ma i o ka si mo hi ru ne moha na no ni o i ya na ni yo rina ma e ga ku re ta a na ta gase ka i no su be te so u su be teha re wa ta ru ha ru no hi no ka ze no yo u ni ta ta ka i no na ka de sa sa ya i teso ra ni ma u si ro i ku mo no ka zu hi to rio mo i da si kyou mo ho ho e nn da 剣八:su be te wo ka ke te ko wa re teta no si na tte a sonndemu tya ku tya ya tte ta o re te moso re de mo i ki te rya i i sao re ra wa i tu mo i tu de mota no si mi na ga ra ta ta ka uo re ra wa i tu mo i tu de mota ta ka u ko to mo ta no si muo ri tu gu ta i yo u hi ka ri no yo u nia ra so i wo ka ra da de kann ji roha re wa ta ru ha ru no hi no ka ze no you nita ta ka i wo ka ra da de yo ro ko beso ra ni ma u si ro i ku mo no ka zu hi to tuo mo i da su ka ra de ka ke da seku ri ka e su ma i ni ti wo su ki na you nii ki te ya re su ki ni i ki te ya re

这首歌最傻～！开头就是 白 白 白不白 白 伯不伯！

agenda高中四级六级考研雅思托福GRE反馈议程常用释义英/u0259u02c8du0292endu0259 /美/u0259u02c8du0292endu0259 /常用牛津高考四级六级考研影视原声n.议程 ; 约会簿 ; 日程表 ; 备忘录 ; 潜在意图高考四级六级考研近6年出现4次重要程度100%n.日程; 安排必背考点真题例句近义词变形原形agendum复数agendas短语on the agenda列入会议议程的；可能要处理的；需要处理的hidden agenda秘密议程；不可告人的目的set the agenda制定议程；影响（或决定）行动计划例句Playing cards was on the agenda, as well as learning to play mahjong (麻将).扑克牌已列入日程，同时也要学习打麻将。助记ag-加强-enda应...之事-a复数后缀影视原声Not if I get it on the agenda. No. Especially if you get it on the agenda.除非我给提上议程。不，特别是你将它提上议程。—《纸牌屋 第二季》

古民家で书物整理 Kominkade shomotsu seiri 鸣り响いた黒电话 Nari hibiita kuro denwa はらり舞った纸一枚 Harari matta kami ichimai 埃と落ちゆく Hokori to ochi yuku 长い话を済ませて戻る、日溜まりの廊下 Nagai hanashi wo sumasete modoru, hidamari no rouka 开けかけた袄の先见えた Ake kaketa fusuma no saki mieta 景色に心、夺われた Keshiki ni kokoro, ubawareta 锖びた蓄音机とレコード Sabita chikuonki to REKOODO 此方に笑颜をくだしゃんせ Kocchi ni egao wo kudashanse おやまあ、まだお昼前かね Oya maa, mada ohiru mae ka ne もう何にも入らんの Mou nani ni mo hairan no 歪んだ硝子のカンテラと Yuganda garasu no KANTERA to 此方に笑颜をくだしゃんせ Kocchi ni egao wo kudashanse 一寸(ちょっと)やそっとじゃ崩れない其の笑颜をくだしゃんせ Chotto ya sotto ja kuzurenai sono egao wo kudashanse 心と身体は乖离 Kokoro to karada wa kairi 春故に気もそぞろ Haru yue ni ki mo sozoro 言わぬが花と云うが Iwanu ga hana to iu ga 话谭を纽解く Watan wo himotoku 庭先ふと目が合った慎ましい风待草 Niwasaki futo me ga atta tsutsumashii kaze machigusa お前は全て见てきたのだろう Omae wa subete mite kita no darou 「教えてあげなよ」と微笑んだ "Oshiete age na yo" to hohoenda 葡萄农园で昼食を Budou nouen de chuushoku wo 此方に笑颜をくだしゃんせ Kocchi ni egao wo kudashanse 出かけた言の叶饮み込んだ Dekaketa koto no ha nomikonda もう何にも言えないの Mou nani ni mo ienai no 16mmフィルムで投影を Juu-roku MIRI FIRUMU de touei wo 此方に笑颜をくだしゃんせ Kocchi ni egao wo kudashanse 一寸やそっとじゃ崩れない其の笑颜をくだしゃんせ Chotto ya sotto ja kuzurenai sono egao wo kudashanse 古い记忆まだ2歳 Furui kioku mada ni-sai 半缠に包(くる)まれては Hanten ni kurumarete wa 笑った君とその人 Waratta kimi to sono hito 忆えてはいないのだろう Oboete wa inai no darou 洗练されたバイオリンと Senrensareta BAIORIN to 此方に笑颜をくだしゃんせ Kocchi ni egao wo kudashanse 此方に向かう事などない其の笑颜をくだしゃんせ、无常 Kochira ni mukau koto nado nai sono egao wo kudashanse, mujou 座布団座って手を合わせ Zabuton suwatte te wo awase 祈りを捧げて目を开けて Inori wo sasagete me wo akete その人はほら、すぐ目の前 Sono hito wa hora, sugu me no mae 额の中笑ってるの Gaku no naka waratteru no 君は何にも知らないの Kimi wa nani ni mo shiranai no 仆だけが知ってるの Boku dake ga shitteru no

中文： 回首看看 有你跟着的道路 抬头看看 将铺创出未来喔 当为坚强努力而身心俱惫之时 就看着天空 流流泪吧 吹抚脸颊的风儿 一定会这么说 「就算跌倒也罢 你就是你最棒」 对未受创的人而言 是看不到蓝天的 每每彷徨迷走之时 生命即会闪耀 不知用何种笑容包给你 你的悲痛才会愈合呢 从云隙中看得到的太阳 正开始照耀着 那坦直的眼神 注视看看 在逆风的那边 持续描绘的未来 正等着你 走向前吧 因为那边有天空 对未受创的人而言 是看不到蓝天的 每每彷徨迷走之时 生命即会闪耀 回首看看 有你跟着的道路 抬头看看 将铺创出未来喔

1、星空极速是专门的拨号软件，目的是把你的用户名或密码加密。比如你的宽带用户名是ABCD密码是123456，但经过加密后用户名实际是0000ABCD。这样路由器用ABCD这样的用户名是没法登陆的。破解办法：用嗅探软件sniffer，搜索登录过程的真实用户名和密码，找到后填入路由器。路由器连接过程：1、电信宽带接入路由器wan口。2、两台电脑用网线接入路由器四口中的任意两个口。3、登录路由器设置界面一般是192.168.0.1，用户和密码都是admin详细请看路由器说明书。设置宽带pppOe拨号，用户名和密码。4、两台电脑，设置成自动获取IP这样设置后，两台电脑开机就自动在线。

要看这个酒是否属于储藏类，如果是，要看他是否每7年换过瓶塞。如果按正常方式保存到现在，市场价格可在3000-4000欧元，如果保存不当，就可直接扔到垃圾桶了。

歌手:SoulJa/青山テルマ 歌名;ここにいるよ 女:Baby boy 私(わたし)はここにいるよ どこもいかずに待(ま)ってるよ 宝贝，男孩，我在这里，哪儿都不去地等待 Baby boy watashi ha koko ni iru yo doko mo ika zu ni matteru yo You know dat I love you だからこそ 心配(しんぱい)しなくていいんだよ 你知道我是爱你的 所以 不用担心也可以(不用担心就好) You know that I love you da kara koso shinpai shi naku teiin da yo どんなに远(とお)くにいても 変(か)わらないよこの心(こころ). 言(い)いたい事(こと)わかるでしょ? 不管有多远，我的心不变。我想说的事情你知道吧？ donnani ? kuni i te mo kawara nai yo kono kokoro ii tai koto wakaru desho ? あなたのこと待(ま)ってるよ 我一直在等你哟 anata no koto matteru yo 男:不器用(ぶきよう)な俺(おれ) 远(とお)くにいる君(きみ) 总出差错的我， 在远方的你 bukiyou na ore tooku niiru kimi 伝(つた)えたい気持(きも)ちそのまま言(い)えずに 君(きみ)は行(い)っちまった 想传达的心情还没来得及说出口你就走了 tsutae tai kimochi sonomama ie zuni kimi ha icchi matta いまじゃ残(のこ)された君(きみ)はアルバムの中(なか) 如今只有留在相簿中的你 imaja nokosa reta kimi ha arubamu no naka 电波(でんぱ)でしか会(あ)えない日(ひ)々 だけど见(み)えないぜ君(きみ)の微笑(ほほえ)み 在只能通话，不能见面的日子里，只是看不到你的微笑 denpa deshika ae nai hibi dakedo mi e naize kimi no hohoemi 君(きみ)のぬくもり 髪(かみ)の香(かお)り こののどの渇(かわ)きはそのまま満(み)たされずに 你的温暖和头发的香味，使我喉咙干渴得不到满足 kimi nonukumori kami no kaori kononodono kawaki hasonomama mita sarezuni 过(す)ぎてく日(ひ)々の中(なか) なんだか君(きみ)の面影(おもかげ)ひたすら探(さが)した 在过去的日子里，不知不觉地只寻找你的样子 sugiteku hibi no nakana ndaka kimi no omokage hitasura sagashi ta 君(きみ)とよく歩(ある)いたあの道(みち)は 今俺(いまおれ)だけの足音(あしおと)が响(ひび)いていた 和你走过很多次的那条小路，现在只响着我的脚步声 kimi toyoku arui taano michi ha ima ore dakeno ashioto ga hibii teita んなことよりお前(まえ)の方(かた)は元気(げんき)か? ちゃんと饭食(meshiku)ってるか? 你现在身体好吗？ 一直好好吃饭吗？ nnakotoyorio mae no kataha genki ka ? chanto meshikutte ruka ? ちくしょう、やっぱ言(い)えねぇや 可恶，还是说不出口阿 Chikushou, yabba ieneeya また今度送(こんどおく)るよ 俺(おれ)からのLetter 下次我会寄信的 mata kondo okuru yo ore kara no Letter 女:Baby boy 私(わたし)はここにいるよ どこもいかずに待(ま)ってるよ 宝贝，男孩，我在这里，哪儿都不去地等待 Baby boy watashi ha koko ni iru yo doko mo ika zu ni matteru yo You know dat I love you だからこそ 心配(しんぱい)しなくていいんだよ 你知道我是爱你的 正因为这样不用担心也可以 You know that I love you da kara koso shinpai shi naku te ii n da yo どんなに远(とお)くにいても 変(か)わらないよこの心(こころ). 言(い)いたい事(こと)わかるでしょ? 不管有多远，我的心不变。我想说的事情你知道吧？ donnani tooku niitemo kawa ranaiyokono kokoro ii tai koto wakarudesho ? あなたのこと待(ま)ってるよ 我一直在等你哟 anatanokoto matte ruyo 男:镰仓(かまくら)の砂浜(すなはま)で见(み)た君(きみ)の姿(すがた) 波(なみ)にのまれた君(きみ)に言(い)いたい言叶(ことば) 廉仓的沙滩上看见你的身影，被波浪覆盖的你想说的话 kamakura no sunahama de mi ta kimi no sugata nami ninomareta kimi ni ii tai gen kanou なんだかマジせつねぇ 男(おとこ)なのになんで…言叶出(げんかのうで)てこねぇや 总觉得没面子，明明是男人，却说不出口 nandaka maji setsunee otoko nanoninande ... gen kanou dete koneeya 覚(おぼ)えてますか?君(きみ)と行(い)ったカラオケの中(なか) 还记得吗？在和你一起去的卡拉ok里 oboe temasuka ? kimi to itta karaoke no naka 俺(おれ)が入(い)れた曲(きょく)の言叶(ことば) モニターに浮(う)かんだまま ほんとは君(きみ)に伝(つた)えたかった 我加在歌曲中的话，和广播中传出的一样，那些真的是想说给你听的 ore ga ire ta kyoku no kotoba monita^ ni uka ndamama hontoha kimi ni tsutae takatta 君(きみ)と二人(ふたり)きりで初(はじ)めて待(ま)ち合(あ)わせをしたあの日(ひ) 和你第一次约会的那一天 kimi to futari kiride hajimete machiawase woshitaano nichi まるで偶然(ぐうぜん)に会(あ)ったかのようにはしゃぎ 微笑(ほほえ)む君(きみ)が忘(わす)れられないって 那个好像偶然遇到的那样开心的微笑的你令我难以忘却 marude guuzen ni atta kanoyounihashagi hohoemu kimi ga wasure rarenaitte 话(はなし)かなりそれちまったがわかるよな?俺(おれ)が言(い)いたい言叶(ことば) 明白我当时说的话吗？我想说的话 kanarisorechimattagawakaruyona ? ore ga ii tai gen kanou S**t残(のこ)り书(か)く场所(ばしょ)がねぇや Shit 没有空白的地方可以写了 Shit nokori kaku basho ganeeya ごめん 次(つぎ)は绝対(ぜんざい)に送(おく)るから 对不起，下次绝对会送到的(下次一定会寄给你) gomen tsugi ha 绝 tsuini okuru kara 女:Baby boy 私(わたし)はここにいるよ どこもいかずに待(ま)ってるよ 宝贝，男孩，我在这里，哪儿都不去地等待 Baby boy watashihakokoniiruyo dokomoikazuni matte ruyo You know dat I love you だからこそ 心配(しんぱい)しなくていいんだよ 你知道我是爱你的 正因为这样不用担心也可以 You know dat I love you dakarakoso shinpai shinakuteiindayo どんなに远(とお)くにいても 変(か)わらないよこの心(こころ) 言(い)いたい事(こと)わかるでしょ? 不管有多远，我的心不变。我想说的事情你知道吧？ donnani tooku niitemo kawa ranaiyokono kokoro ii tai koto wakarudesho ? あなたのこと待(ま)ってるよ 我一直在等你哟 anatanokoto matte ruyo 男:俺(おれ)がもっと金持(かねも)ちだったら もっとまともな仕事(しごと)をしてたら 我如果再有钱一点，如果有一份正经的工作 ore gamotto kanemochi dattara mottomatomona shigoto woshitetara もしもすべて犠牲(ぎせい)にできたのなら 俺(おれ)は绝対(ぜんざい)に君(きみ)を… 我如果再有钱一点，如果有一份正经的工作 那我绝对要把你..(娶回来) Moshimo subete gisei ni dekita no nara Ore ha zettai ni kimi wo... だがPlease勘违()いだけはすんな 君(きみ)に寂(さび)しい思(おも)いはさせたくねぇが 但是Please 你千万不要误会 我从没想过要让你觉得孤单 Daga Please kanchiga idakehasunna Kimi ni sabishii omoi ha sasetaku neega 忙(いそが)しい中(なか)あんま话(はなし)せねぇがbaby believeこれはall for our future 现在有点忙 不能多说了啊 baby请相信 这些都是为了我们的将来 Isoga shii naka anma hana seneega baby believe koreha all our future B But 正直(しょうじき) 今(いま)すぐ君(きみ)と会(あ)いたい 今(いま)すぐ抱(だ)きしめてやりたい But 说真的 我现在真的很想见到你 很想立刻将你拥入怀里 But shoujiki ima sugu kimi to ai tai ima sugu daki shimeteyaritai 昔(うかし) 君(きみ)が俺(おれ)の隣(となり)で座(すわ)ってた席(せき)には もう谁(だれ)もいないって… 当初 你坐在我身旁的那个座位 现在已经没有任何人了... mukashi kun ga ore no tonari de suwatte ta seki niha mou 谁 moinaitte ... まぁ そんな事(こと)はいいんだ 言(い)いたいことはそんなんじゃねぇんだ 唉 这些事情都算了 我想对你说的并不是那些 maa sonna koto haiinda ii taikotohasonnanjaneenda いまさらだが ずっと言(い)いたかった言叶(ことば)を込(こ)め 送(おく)るUnsent letter 虽然为时已晚 把我一直想说的话都写进去吧 寄出这份 UNSENT LETTER imasaradaga zutto ii takatta gen kanawo kome okuru Unsent letter 男:Baby girl 私(わたし)はここにいるよ どこもいかずに待(ま)ってるよ Baby girl 我就在这里 等候在此哪都不去 Baby girl watashihakokoniiruyo dokomoikazuni matte ruyo You know dat I love you だからこそ 心配(しんぱい)しなくていいんだよ 你知道我爱你 所以 不用担心就好 You know dat I love you dakarakoso shinpai shinakuteiindayo どんなに远(とお)くにいても 変(か)わらないよこの心(こころ). 言(い)いたい事(こと)わかるでしょ? 无论相隔有多遥远 你知道我想说的话吧 donnani tooku niitemo kawa ranaiyokono kokoro ii tai koto wakarudesho? あなたのこと待(ま)ってるよ 我一直都在等着你 anatanokoto matte ruyo 男&女:Baby boy 私(わたし)はここにいるよ どこもいかずに待(ま)ってるよ Baby boy 我就在这里 等候在此哪都不去 Baby boy watashihakokoniiruyo dokomoikazuni matte ruyo You know dat I love you だからこそ 心配(しんぱい)しなくていいんだよ 你知道我爱你 所以 不用担心就好 You know I love you dakarakoso shinpai shinakuteiindayo どんなに远(とお)くにいても 変(か)わらないよこの心(こころ). 今(いま)なら素直(すなお)に言(い)えるよ 无论相隔有多遥远 这颗心都不会因此改变 现在终于可以坦率的说了吧 donnani tooku niitemo kawa ranaiyokono kokoro ima nara sunao ni ie ruyo I don"t eva wanna let you go 我从没想过要让你离开...

主要政党包括：统一党、工党、共和党。（1）统一党（FINE GAEL）：议会第一大党。成立于1933年，党员约3.5万人。代表富裕农民、中产阶级和工商业资本家集团利益，系中右翼政党。对内主张削减公共开支，降低税率和私有化；对外主张经济开放，参与欧洲一体化建设。领袖为恩达·肯尼（Enda Kenny）。（2）工党（THE LABOUR PARTY）：议会第二大党。成立于1912年，党员约1万人，大多数为工会会员和天主教民族主义者。1998年12月，工党与民主左派党合并，保留工党名称。主张建立公平、民主、多元的社会，以“人生而平等”为其价值核心。政策出现向中间路线靠拢趋势。领袖为埃蒙·吉尔摩（Eamon Gilmore）。（3）共和党（FIANNA FAIL）：议会第三大党，成立于1926年，党员约10万人。历史上该党19次单独组阁或联合组阁，79年中有61年执政。2011年大选惨败。传统上较保守，对内主张减税，增加就业机会，对外主张实行中立政策，支持欧盟一体化建设。2011年1月大选前，领袖为迈克尔·马丁（Michael Martin）。 总统迈克尔·希金斯（Michael D Higgins）。1941年出生，曾就读于爱尔兰国立大学、英国曼彻斯特大学和美国印第安那大学，获社会学学士学位。1973年至1977年任参议员，1981年当选众议员，先后任戈尔韦市长、爱政府首任艺术、文化和爱尔兰语事务部长、工党主席。2011年10月作为工党候选人在总统选举中获胜，11月11日正式就任爱第9任总统。总理恩达·肯尼（Enda Kenny）。1951年4月出生，毕业于爱尔兰国立大学，曾任小学教师。24岁当选众议员，系众议院中任职最长的议员。历任教育和劳工国务部长、旅游和贸易部长。2002年出任统一党领袖，2006年当选欧洲人民党副主席。2011年大选中率统一党赢得大选并与工党联合组阁，任新政府总理。