ELISA 方法中,封闭剂如何选择

这是两种可降解塑料，原料不同

看看下边你就清楚啦

TBST是TBS+Tween的缩写，生物实验中提到的PBST是指PBS溶液加上Tween-20。那么tbst与pbst都有上面区别呢？ tbst与pbst的区别： 1、TBST的pH值随温度变化大一点，而PBST似乎容易有沉淀，若稀释抗体后需要反复使用的话建议使用TBST溶解。 2、两种洗液用起来没有什么区别，都是提供一个缓冲的PH值环境，加上吐温20有助于蛋白的洗脱。PBST的磷酸盐缓冲液加Tween-20，而TBST是Tris缓冲液加Tween-20。 PBS溶液是指磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution)，渗透压近似于生理条件又有很强的pH缓冲能力，常用来洗细胞（不易涨裂）和作为细胞培养的基础液(pH缓冲)。 TBS缓冲液是生物学中常使用的等渗缓冲盐溶液，主要用于免疫组化和原位杂交，酶联免疫等实验中，清洗免疫印迹实验中非特异性结合的抗体等。由 Tris-HCl 构成稳定的 PH 缓冲体系，NaCl 提供等渗条件. TBST的配置 先称量NaCl40g，倒入烧杯中； 加DDW蒸馏水400ml,再称量NaCl?47.6g；倒入刚才的那个烧杯中（PS：由于NaCl的量太多，一次称量不方便，所以分两次称量，且易于溶解）； 往烧杯中加入Tris—HCl缓冲液100ml； 最后加（吐温20）5ml； 转入1000ml容量瓶中，在定容，转移即可。

PBS是缓冲液，缓冲液能够维持稳定的PH值，用来洗膜，不会破坏掉膜上蛋白质和抗体的稳定性及二者的免疫结合。PBST中的T是指Tween,是一种非离子型去污剂，作用是在不破坏蛋白的情况下，洗脱非特异性结合的抗体。

生物实验中提到的PBST是指PBS溶液加上Tween-20 PBS溶液是指磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution),渗透压近似于生理条件又有很强的pH缓冲能力,常用来洗细胞（不易涨裂）和作为细胞培养的基础液(pH缓冲). Tween-20为一种非离子表面活性剂,对细胞生长可产生影响. 不知你的是什么生化实验,根据物质基本性质和实验目的及步骤不难推测出其作用:)

硬酯酸铅

磷酸盐吐温缓冲液

PBS中加入Twen-20是PBST缓冲液,为了有更好的洗涤效果，可以说是一种去污剂。1× 2×是缓冲液浓度的意思。1×PBST缓冲液可以直接使用，2×PBST缓冲液需要稀释成1×PBST缓冲液之后使用。也就是说一半的2×PBST缓冲液加另一半的水就是1×PBST缓冲液。

一般直接用pbs或者pbst就可以了，pbsm应该是封闭液吧，理论上也可以。但有没有差别，不好说，只有自己试过才知道，因为牛奶成份复杂，一般的指标是没有影响的，但不能保证所有指标都适用。商品化的elisa抗体稀释液应该还含有一些稳定剂。但如果不存放，现配现用，与pbs或者pbst应该是没有差别的。

洗涤缓冲液一般为含0.05% Tween20的中性PBS（即PBST），Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的。

1L 1*PBS + 500ul Tween-20，混匀后室温保存

网页链接从这个网站上来看的话是加入吐温20的量为0.05~2%，比较推荐0.05%。

不一样,不过功能相近而且一般可以互换。不同的地方仅仅是前者有Tris，后者有磷酸。

tween 和triton 都是做组化或者western时经常用到的试剂。tween可以增加一抗、二抗的抗原特异性，所以PBST中一般洗抗体时是加入tween，BSA试剂稀释抗体的时候也是加入tween;triton是可以增加细胞膜的通透性，简单的说就是“打孔”的作用，做组化之前一般是用PBS中加有triton，可以用来打孔。

TBST中含有 Tris-Hcl， NaCl，tween20 这三种物质，是做WESTERN BLOT中常用的一种缓冲溶液。TBST是TBS+Tween的缩写,TBS是Tris-HCl缓冲盐溶液,为等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液用1N HC1调pH至7.4,Tween为一种非离子型去污剂,有复性抗原的作用,可提高特异性的识别能力。拓展资料：PBS和PBST 差别：PBST中由PBS 加入了Tween 20, Tween 20 是非离子型 去污剂。因为western 中所用的膜可以与蛋白质结合，这样的话孵育过程中，抗体是能够与膜非特异性结合的，为了防止以后曝光造成胶片背景太高，在孵育抗体后，混有Tween 2的PBS 能够将非特异性结合的抗体洗掉，增加特异性。在抗体的保存中，抗体往往是以极高浓度保存在甘油之中的，使用的时候按照一定的比例去稀释，TBST 跟TBS 都可以用来稀释抗体，以做孵育抗体之用。

洗涤缓冲液一般为含0.05% Tween20的中性PBS（即PBST），Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，应该关系不大，仅供参考哈

洗是用浸泡的.背景颜色深不一定是洗得不干净.原因有几点：1）材料自身荧光；2）一抗,二抗的浓度,时间；3）激光共聚焦显微镜的问题,我是指显微镜的好坏,confogo(好像是这样拼写的- -）的显微镜就可以滤去背景荧光. 你说的抗体我没用过,我做过的免疫组化是用的拟南芥和贯叶连翘的愈伤组织,自身激发荧光很强,一抗是58K和Pin1,浓度都是1：250稀释的,二抗是FITC和Cy3,1：50和1:250.一抗4度过夜,二抗2小时.我做的是双标,二抗后先BSA洗1遍,再PBS 3遍.背景每次都还好,对照组的背景也不强.

一抗孵育完了要用PBST或TBST洗掉未结合抗原的一抗，一抗不洗干净显色以后背景会很重。

简称PBST 磷酸盐吐温缓冲液Phosphate buffer solution (PBS) ：指的是磷酸盐缓冲液；PBS中加入吐温（tween)后即为PBST。配制方法请见百度文库http://wenku.baidu.com/view/331e9729bd64783e09122bb9.html

1. 5ml的10*PBS，加450ml水，得500ml的1*PBS。2. 10ml的10*PBS，加950ml水，得1000ml的0.1*PBS。3. 取第二问中已配好的0.1*PBS 500ml，加0.025ml triton X-100（0.5%。的比例）。

Western blot (蛋白印迹) WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。 其基本流程如下： 前面·我们已经介绍过SDS-PAGE，电泳完成后如果要进行western blot则需要转膜 转膜：转膜有湿转和半干转两种不同方法。我用的是半干转移法，膜覆盖住胶，膜用balance buffer润湿（甲醇溶液）,盖子分别用top buffer和bottom buffer润湿后盖住，转膜10min。注意： 1：膜大小合适，防止浪费. 2：盖好膜和凝胶后，凝胶、膜 推平，否则会导致转膜不完全。 3：注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。 封闭：降低背景，占据膜上剩余的结合位点，使抗体只能与膜上的抗原特异性结合，一般用的是5%的脱脂奶粉，但值得注意的是对于磷酸化的抗体或生物素标记的抗体不能用脱脂奶粉，只能用5%的BSA。封闭时间室温1-2h。 一抗孵育：封闭结束后，用PBST稍微洗膜后倒掉，再加入PBST摇10min，反复洗三次后加入0.5%一抗+3%奶粉进行孵育2h，一般5mL，但上次我用10mL。一抗孵育时，要注意一抗的种属来源，我用的his标签，所以一抗是anti-his。一抗可以反复使用2-3次。 PBST 溶液  PBS 溶液中加入 0.1%吐温 洗膜：用PBST进行洗膜，10min/次，洗3-4次即可。 二抗孵育：洗膜结束后，后加入0.3%二抗+3%奶粉5mL孵育1h，再次洗膜。注意二抗的种属要与一抗的来源相对应，例如我的一抗是鼠抗，我的二抗是羊抗鼠。 检测：按 1：1 比例吸取显影液中的 A 液和 B 液于 1.5 mL EP 管中混合，一块胶100μL，后将混合液均匀滴加在 PVDF 膜上，用塑封袋将 PVDF 膜封好，放入显影仪中进行显影 (速度要快，尽量减少底物消耗)。

BSA是牛血清制品，有可能会残留一些过氧化物酶的活性，但是我们长期以来使用的各种BSA从来没有出过问题的。如果您PBST没有问题，是不是也要考虑2%BSA溶液被污染了，重新配一些试试，用干净的容器和试验过的PBST。

PBS 与PBST的区别是PBST含有Tween-20成分，PBS 不含有。PBS，全称Phosphate Buffered Saline。在医学词汇中表示磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养，pH=7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。PBST是指PBS溶液加上Tween-20，Tween-20为一种非离子表面活性剂，对细胞生长可产生影响。

做细胞免疫荧光时，pbst中tween-20的浓度是多少所谓寄生虫是指寄居在别的生物（即宿主）体内或体外的一类生物，它们利用宿主作为食物的来源以及作为生长发育和繁殖的场所，并能使宿主生寄生虫病，给宿主带来危害甚至致其死亡。寄生虫（parasite）指一种生物，将其一生的大多数时间居住在另外一种动物，称为宿主或寄主(host)上，同时，会造成被寄生动物的危害称之。其特征为，寄生在宿主或寄主（host）体内或附著于体外以获取维持其生存、发育或者繁殖所需的营养或者庇护的一切生物。其方式称为寄生。另外在社会学领域中，寄生虫还指泛那些依靠别人，自己不肯努力的人。 寄生虫所包括的生物种类繁多，一般都为原生生物（Protista）、无脊椎动物（invertebrate）、脊椎动物（vertebrate）。

1，检查抗体是否过期，保存方法是否正确，稀释比例是否正确。 2，抗体的孵育时间、温度是否正确。 3，洗涤液中是否含有triton-100等破膜物质。 4，洗涤时间是否过长。 5，排除所有人为因素，考虑该细胞可能确实不表达该蛋白。

下次别再犯错呗 最多就是非特异性吸附多一些

TBST 是 Tris-Buffered Saline Tween-20的缩写。也就是加有吐温20的tris碱缓冲液，再加上5%的NGS

收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用（两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成） 1. 重新水化和固定1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。2） 置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5分钟3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。2. 预杂交1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。2）用等体积的HYB+取代HYB－。3）60℃水浴，预杂交4小时以上。3. 杂交1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..2）60℃ 温浴过夜。注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。 1.1）将探针回收，放于－20C保存（通常探针可重复使用十次左右）。2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。2.1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。2）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。 1） 用1ml含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT溶液置换，25分钟。2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。6）4C冰箱保存。原位杂交中溶液的配制：PBS:NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24gDEPC H2O 1LHCl 调PH值至7.4抽滤，灭菌4% 多聚甲醛：多聚甲醛 40gPBS 1L加热持续搅拌至溶液澄清。-20℃保存PBST：PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2gNaCl 175.5gDEPC H2O 至1L抽滤，灭菌SSCT：SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。HYB-：甲酰胺：20XSSC储液：DEPC水=2：1：1配制加入Tween-20使其终浓度为0.1%，-20c保存。HYB+：HYB- 20mlyeast RNA 10mgheparin 1mg。-20℃保存。MAB：maleic acid 11.6gNaCl 8.8g用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.54℃保存MABTMAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%.10% blocking reagent:blocking reagent 8gMAB 72ml1：2：7溶液：灭活羊血清：10% BM blocking reagent：MABT=1：2：7用时现配Staining buffer：Tris 12.1gpH9.5Mgcl 6H2O 10.2g,Nacl 5.85gTween-20 1ml,用之前加1M的左旋咪唑储液，使之终浓度为1mM。

一般是PBST5%的牛奶吧~

western blot显影的时候，如果背景比较高或者蛋白表达比较低会觉得背景不干净，好像是有气泡一样。解决办法：用方形的盒子，把膜放在里面，先用PBST漂洗3次（加入后晃一下就倒掉）。PBST洗5次（一抗，二抗后要洗7-10次），每次5分钟，在摇床上摇，速度越快越好（别当成摇细菌啊），以PBST不泼出来为佳。

PBS溶液配置方法：采用去离子水、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·2H₂O配制PBS溶液，按以下步骤进行：1、配制1/15mol/L KH₂PO₄，即每升水中溶解9.078克KH₂PO₄。2、配制1/15mol/LNa₂HPO₄·2H₂O，即每升水中溶解11.876克Na₂HPO₄·2H₂O。3、将18.2%（体积分数）KH₂PO₄溶液和81.8%Na₂HPO₄·2H₂O混合。磷酸缓冲盐溶液作用1、因为PBS缓冲液具有可调整的适宜pH缓冲作用和盐平衡的作用。不使用蒸馏水的原因在于水会破坏生物蛋白的结构和生物特性。不使用生理盐水的原因在于它不能够调整PH值。所以，对生物细胞进行清洗是PBS缓冲液。2、PBS缓冲液的PH值是细胞的PH值范围，而且在酸碱微量的刺激下，PH值一般也没有任何的变化。培养基的PH值时很容易变化的，对于细胞具有j大的损伤，但是PBS缓冲液可以保持细胞能在适合的PH值范围之内健康的生活活。

什么理论过程？就是原理呗？WesternBlot原理、显色分类及操作步骤一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。western显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。二、操作步骤：(一)配胶1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。2、封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。3、灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)(二)样品处理1．培养的细胞（定性）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。⑶100℃，1min。⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex2~3次。⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。⑹待样品恢复到室温后上样。2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。⑷12000g离心，4℃，2min。⑸取少量上清进行定量。⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。⑵12000g离心，4℃，2min。⑶取少量上清进行定量。⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。(裂解液配方：Tris-Cl(pH7.4)20mM，EDTA1mM由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF25mM）。1×loadingbuffer配方：10%甘油，50mMTris•Cl(pH6.8)，2%β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。)(三)电泳1．上样前将胶板下的气泡赶走。2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积。2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。电泳液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,0.1%SDS（10ml10%SDS）/LTris-base1.5g,glycine7.2g,0.1%SDS（5ml10%SDS）/0.5L(四)转膜1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。2．取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）3．转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。电转液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L(五)封闭及杂交1．封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。2．结合一抗：一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。3．洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。4．结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。5．洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。PBST：1×PBSTTBS：Tris-HCl20mM,pH7.4(25℃)Tween-200.01%~0.02%NaCl150mMTween-200.05%封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200mlPBST或TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。(六)发光鉴定一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。1．HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。2．AP-NBT/BICP显色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。三、注意事项：增强敏感性若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。封闭40~60min一抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。二抗杂交，37℃1h。PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。发光鉴定。若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。10．三抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。12．发光鉴定。一抗溶液中加入0.2%叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试）(七)NC膜的多次使用一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

把片子拿出来室温晾干，丙酮-20预冷后固定10min，PBST3x5min，BSA室温1h，一抗过夜PBST 3X5min，二抗室温1h，PBST 3x5min，DAPI封片

调查公司可信吗

内部ELISA发展，清晰的高结合，平底聚苯乙烯微孔板（研发系统）覆盖了1μ克/毫升的鼠抗人孤胆枪手100μL（antigenix），0.5μ克/毫升的鼠抗人血管紧张素（研发系统），2μ克/毫升的小鼠抗人DCN（研发系统）或0.5μG /毫升兔抗人SFRP1在PBS在4°C过夜，分别，倾注所有捕获的解决方案的第二天，则四次堵塞的约束力的面积有200μL 5% BSA在PBS在25°C 1小时5% BSA在PBS溶液中去除后洗盘子，EDTA血浆和系列稀释的标准的人μMDK 100 L（antigenix），Ang（研发系统），DCN（研发系统）或SFRP1（研发系统）被加入到各孔中分别放在25°C 2H。板再PBST四次0.2μ克/毫升的生物素100μ我洗标记的兔抗人MDK（antigenix），0.4μ克/毫升的生物素标记的Ang（研发系统），0.25μ克/毫升的生物素标记的鼠抗人DC（R＆D系统）或0.2μ克/毫升的羊抗人SFRP1（研发系统）0.1%牛血清白蛋PBS是添加到每个好，分别，和25°C溶液培养删除1h后以PBST洗四次。用MDK，Ang和DCN检测，100μL 1:200稀释亲和素（研发系统）0.1% BSA在PB在每个以及培养在25°C 30分钟在黑暗中添加。对于SFRP1检测，100μL 1:2000稀释辣根过氧化物酶标记兔抗山羊免疫球蛋白（Dako公司北美国）0.1% BSA在PBS中每个以及培养在25°C 1在黑暗中添加。板和PBST和底物试剂100μ我洗了四次（研发系统）是在每个以及培养在25°C在黑暗中10分钟，加入，然后终止反应中加入2 M硫酸100μL。确定光学密度（OD450）各井立即利用集到450 nm的微孔板读者。确定如下定量限：MDK。LLOQ，0.156皮克/毫升ULOQ；，20毫微克/毫升；内CV＜6.2%，批间CV＜9.2%。昂。LLOQ，78.1皮克/毫升ULOQ；，5000皮克/毫升；内CV＜5%，批间CV＜9%。DCN。LLOQ，31.25皮克/毫升ULOQ；，2000皮克/毫升；内CV＜4.3%；批间CV＜7.8%。SFRP1。LLOQ，0.195毫微克/毫升ULOQ；，25毫微克/毫升；内CV＜4.8，批间CV＜8.8%。

你好 ，我做了一次对封闭液的测试，在封闭之前用立春红染色，封闭之后再用立春红染色，然后用PBST洗三次，再用立春红染色。问题就一目了然，封闭后整个膜底色发红蛋白区略微更红，但是封闭前和封闭后PBST洗的膜只有蛋白区发红。所以你就知道封闭的原理就是防止一抗与膜的非的异性结合。

梯度包被抗原，4℃过夜。PBST洗3次，每次5min1%BSA封闭，37℃，1h。PBST洗3次，每次5min加入适当浓度的抗体，37℃，1h。PBST洗3次，每次5min加入HRP标记的二抗，37℃，1h。PBST洗4次，每次5minOPD显色，20min。2M农硫酸终止显色，酶标仪读数。

western blot 一抗一般都是以原液的形式保存的，不需要用溶剂溶解western blot 一抗使用的时候一般只需要稀释，购买时厂家应该会提供一抗稀释液。如果没有一抗稀释液可以用TBST或者PBST稀释，这个要看具体使用的情况了

PBS是磷酸盐缓冲液,PBST是磷酸盐吐温缓冲液.磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，简称PBS）的是常用的用于生物学研究的一个缓冲溶液。PBS可以为三种溶液的英文缩写，分别是磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution）、磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline）及 磷酸盐缓冲钠（phosphate buffered sodium），其配制方法不同，pH值不同，发挥的生物学作用亦不完全相同。生物实验中提到的PBST是指PBS溶液加上Tween-20，Tween-20为一种非离子表面活性剂,对细胞生长可产生影响.扩展资料:主要用于一些化学实验中不影响实验反应的情况下调节pH值，以便让实验的化学反应在最佳条件下进行。部分用于食品或是饲料行业加工，如食品或者饲料真菌毒素检验中Elisa方法的洗板应用或者食品微生物检验中的稀释缓冲液。组成参考资料：磷酸盐缓冲液-百度百科

PBS是缓冲液，缓冲液能够维持稳定的PH值，用来洗膜，不会破坏掉膜上蛋白质和抗体的稳定性及二者的免疫结合。PBST中的T是指Tween, 是一种非离子型去污剂，作用是在不破坏蛋白的情况下，洗脱非特异性结合的抗体。

聚丁二酸丁二醇酯( PBS)聚丁二酸／对苯二甲酸丁二醇酯（PBST）

PBS是磷酸盐缓冲液,PBST是磷酸盐吐温缓冲液.

TBST缓冲液中含有 Tris-Hcl， NaCl，tween20 三种物质 PBST是磷酸盐吐温缓冲液

PBS中加入Twen-20是PBST缓冲液,为了有更好的洗涤效果，可以说是一种去污剂。1×2×是缓冲液浓度的意思。1×PBST缓冲液可以直接使用，2×PBST缓冲液需要稀释成1×PBST缓冲液之后使用。也就是说一半的2×PBST缓冲液加另一半的水就是1×PBST缓冲液。

PBS中加入Twen-20是PBST缓冲液,为了有更好的洗涤效果，可以说是一种去污剂。1× 2×是缓冲液浓度的意思。1×PBST缓冲液可以直接使用，2×PBST缓冲液需要稀释成1×PBST缓冲液之后使用。也就是说一半的2×PBST缓冲液加另一半的水就是1×PBST缓冲液。

tween 和triton 都是做组化或者western时经常用到的试剂。tween可以增加一抗、二抗的抗原特异性，所以PBST中一般洗抗体时是加入tween，BSA试剂稀释抗体的时候也是加入tween；triton是可以增加细胞膜的通透性，简单的说就是“打孔”的作用，做组化之前一般是用PBS中加有triton，可以用来打孔。

二楼正解

有区别,一般用PBS,PBST中的吐温有洗涤的效果.

有区别,一般用PBS,PBST中的吐温有洗涤的效果.

TBST中含有 Tris-Hcl， NaCl，tween20 这三种物质，是做WESTERN BLOT中常用的一种缓冲溶液。TBST是TBS+Tween的缩写,TBS是Tris-HCl缓冲盐溶液,为等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液用1N HC1调pH至7.4,Tween为一种非离子型去污剂,有复性抗原的作用,可提高特异性的识别能力。拓展资料：PBS和PBST 差别：PBST中由PBS 加入了Tween 20, Tween 20 是非离子型 去污剂。因为western 中所用的膜可以与蛋白质结合，这样的话孵育过程中，抗体是能够与膜非特异性结合的，为了防止以后曝光造成胶片背景太高，在孵育抗体后，混有Tween 2的PBS 能够将非特异性结合的抗体洗掉，增加特异性。在抗体的保存中，抗体往往是以极高浓度保存在甘油之中的，使用的时候按照一定的比例去稀释，TBST 跟TBS 都可以用来稀释抗体，以做孵育抗体之用。