How is the weather?

"what is the weather"用于直接询问天气状况，期望得到具体的答案；而"how is the weather"则用于询问对天气的评估或描述，期望得到一个主观的回答。两者在语法结构上有所区别，一个后接名词短语，一个后接形容词短语。在使用环境上，"what is the weather"常出现在天气相关的场景，而"how is the weather"则更多用于日常闲谈和询问他人现在感受的情境中。它们在释义、用法、使用环境、影响范围和形象上存在一些区别，具体内容如下所示。1. 释义区别："what is the weather"是一个直接询问天气状况的问题。例句：What is the weather like today?（今天天气如何？）"how is the weather"则是询问对天气状况的评估或描述。例句：How is the weather today?（今天天气如何？）2. 语法区别："what is the weather"是一个由疑问词"what"引导的陈述句，后接"be"动词和名词短语。例句：What is the weather forecast for this weekend?（这个周末的天气预报是怎样的？）"how is the weather"则是一个由疑问词"how"引导的陈述句，后接"be"动词和形容词短语。例句：How is the weather outside?（外面的天气怎么样？）3. 用法区别："what is the weather"通常用于直接询问天气状况，期望得到具体的答案。例句：What is the weather like in Paris in the summer?（夏天巴黎的天气如何？）"how is the weather"则用于询问对天气的评估或描述，期望得到一个主观的回答。例句：How is the weather today? Is it sunny and warm?（今天的天气怎么样？是晴天和暖和吗？）4. 使用环境区别："what is the weather"常用于日常对话、天气预报、旅行规划等场景。例句：What is the weather like in Hawaii?（夏威夷的天气怎么样？）"how is the weather"通常出现在朋友间的闲聊、询问他人现在的感受等情境中。例句：I"m planning a picnic. How is the weather there?（我正在计划野餐。你那边的天气怎样？）

How"s the weather? 天气怎么样？

好 is the 微（人儿）儿话音

weather是不可数名词只能用单数，要么is一般现在时，要么用was一般过去时要么将来时用will be。

原则上皆可,都没语病,选择的标准取决于提问者. it is raining为现在进行时,用于陈述即时天气状况---正在下雨. it is rainy为一般陈述句,rainy阴雨天,既可陈述即时天气状况,也可作为一段时期内的天气状况的概述.例如---这几天都是阴雨天---it is rainy recent days. 如果提问者是了解现在的天气,用it is raining和it is rainy都可以,如果是一段时期的天气,只能用it is rainy.

网页链接

天气怎么样

夏天天气怎么样

今天天气如何

全部都得大写，我记得在标题中除了介词外其他的首字母都要大写。

How is the weather today? 今天的天气咋样？相当于 What"s the weather like today?只要记住就好了。祝开心！

Ever since I was a child, I"ve not tolerated the hot weather. Thinking of those days, I can"t remember we had such a sweltering summer. Back then, the weather was much cooler in the summer. Now, everything has changed. We are experiencing much warmer weather each year, aren"t we? Don"t you think we are responsible for the climate change? We clear forests, and emit more greenhouse gases into atmosphere, don"t we? We should admit that our activities cause global warming. A question strikes me what will the weather be like in June 2050? Must be horrible!

How is the weather?天气怎么样？同义句是What"s the weather like？

首先你要知道 weather这个单词是个名词， 而英语中名词一般不能单独以单数出现，使用时前面要加the，a, an这些冠词。其次weather单独用时是个不可数名词，因此前面应该用定冠词（也就是the）

It is fine.

原则上皆可，都没语病，选择的标准取决于提问者。itisraining为现在进行时，用于陈述即时天气状况---正在下雨。itisrainy为一般陈述句，rainy阴雨天，既可陈述即时天气状况，也可作为一段时期内的天气状况的概述.例如---这几天都是阴雨天---itisrainyrecentdays.如果提问者是了解现在的天气，用itisraining和itisrainy都可以，如果是一段时期的天气，只能用itisrainy.

哈哈哈 天气怎么样呢

How is the weather？（写同义句）What"s the weather like?天气怎么样？

天气是什么天气如何

你说的是正确的。

HowistheWeather英语文章标题大小写原则]1.题目的第一个单词要大写；2.冠词都不需要大写；3.字母多于三个(不含三个)的介词、连词首字母要大写；(另一种说法:满五字母的虚词可以大写，不满五字母的不得大写、满七个字母的虚词（through）则在标题或条标中必须大写。)(PS.这两种说法不矛盾,相互参照使用.)4.名词、动词、形容词、副词、代词、感叹词首字母；5.大写所有英语中要求大写的单词。如月份、人名、地名等等。这几条原则的优先性是递减的，也就是说，如果几条原则之间出现了矛盾的情况，应优先实用前面的原则。如：如果题目的第一个单词是冠词或不多于二个字母的介词时也应该大写。

句子结构：主 系 表 状the weather 主语is 系动词how 表语today 状语

what...like(...怎么样)=how How is the weather?=What is the weather like ?

what‘s the weather like ?How is the weather?what疑问代词how副词

1第一题你说的很正确这是英语中的固定搭配背下来就是了没有什么为什么2楼主很聪明你说的都是对的不用在多说了没错的

What will the weather be like How will the weather be?

What is the weather like?

你的说法也是对的.我们常按语法来翻译. How will the weather be tomorrow?=What will the weather be like tomorrow? 现在教材上出现了How is the weather tomorrow?这句话也是对的.

你好，正确答案:B---How.....?---It"s____.(此处有提示it"s=itis,有is,那么is+doing或is+todo)所以A.snow是错误的;B.snowing符合正确(正在下雪)C.snows也错误D.tosnow，虽然语法正确，但是istodo表示将来时态，且表示有计划、有安排的发生。老天爷下雪，不会有计划、有安排的下雪吧。老天爷，那也对自己的未来太有规划了故D错误。--------------------所以正确答案:B.(正在下雪)

第一个填was因为yesterday表示过去式，be动词的过去式是was和were然后第二个空后面的词是today是今天的意思，所以填be动词的一般现在时，即is

这是问天气的用语。回答为：It is sunny today.今天是个晴天。

how怎样like看起来

B 一般现在时

How+is+the+weather?的宾语从句是什么这句话是个简单句 没有宾语从句。I dont know how is the weather? 这句里面才是宾语从句

今天天气怎样？

Howistheweatherlike?意思是:(那里)气候怎么样?楼上的各位别咬文嚼字了，how"stheweatherlike没问题的

错误

how will be the weather 但是这种说法怪怪的。。。

it"s very pleasant.it is warm and wet.

how is the weather? how is the temperature?

错的.询问天气有两种方法： 1.what is the weather like today? 2.How is the weather today? 祝楼主更上一层楼

thehowiswater

上海天气怎么样

应该是what is the weather like用how没有like希望对你有帮助

“今天是什么天气”用英语有两种说法，分别是：1、What"s the weather like today?2、How is the weather today?weather是一个英语单词，可以用作名词和动词，可以翻译为天气、气象，等等。

jawaソフトウェアエンジニア jia wa so fu to we a en ji ni a

Elisa Kit使用方法（以人IL-4 ELISA KIT为例）：检测原理:本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可 通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。试剂盒组成：1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6）2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支）3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml）4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支）5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支）7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）8．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml）9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）11．封板胶纸（6/3 张）12．产品说明书（1 份）标本收集:1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。注意事项:1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻 融。5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试 验结果。9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。 检测前准备工作:1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。3. 标准品: 加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。复溶标准品原液（1000 pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的标准品请废弃。4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化 抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓 缩酶结合物(1:30) 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足， 可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号） 洗涤方法:1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔15－30秒。洗板5次。2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。操作步骤:1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。4．洗板5次。5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。7．洗板5次。8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。10．洗板5次。11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。结果判断:1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。灵敏度、特异性和重复性:● 灵敏度：最小可测人IL-4达7pg/ml。● 特异性：不与IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反应。● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。IL-4简介：IL-4是一种由活化的T细胞产生的细胞因子，以往称为B细胞生长因子1。在B细胞生长的早期活化B细胞，并使被抗原、抗IgM或脂多糖活化的B细胞进入细胞周期G1期。IL-4增强MHCII类抗原的表达和CD23（FceRII）在B细胞上的表达，诱导同种型（isotype）转换，如促使小鼠B细胞从分泌IgM、IgG3、 IgG2b转变成分泌IgG1、IgG2a、IgA和IgE。也增强单个核吞噬细胞表达MHCII类抗原，但对炎症性细胞因子（如IL-1,TNF,IL-8）的释放和这些细胞的杀菌活性有抑制作用。IL-4 也活化细胞毒性 T细胞，它被认为是典型的由TH2细胞产生的细胞因子，对于T,B淋巴细胞的发育以及驱动体液免疫反应和抗体产生都是十分重要的。

影响系统运行计算机操作系统运行速度减慢或经常死机win7系统运行缓慢通常是计莽机的资源被大量消耗。有些病毒可以通过运行自己，强行占用大量内存资源，导致正常的系 统程序无资源可用，进而操作系统运行速度减慢或死机。系统无法启动系统无法启动具体症状表现为开机有 启动文件丢失错误信息提示或直接黑屏。主要原因是病毐修改硬盘的引导信或删除了某些启动文件。以“系统启动文件丢失 错误提示”为例介绍，计算机启动之后会就出现。文件打不开或被更改图标很多病毐可以直接感染文件，修改文件格式或文件链接位置，让文件无法正常使用一时的“熊猫烧香”病毒就属于这一类，它可以让所有的程序文件图标变成一只烧香的熊猫图标。提示硬盘空间不足在硬盘空间很充足的情况下，如果还弹出提示硬盘空间不足，很可能是中了相关的病毒。但是打开硬盘查看并没有多少数据。这一般是病毒复制了大量的病毒文件在磁盘中，而且很多病毒可以将这些复制的病毒文件隐藏。数据丢失有时候用户杳看刚保存的文件时，会突然发现文件找不到了。这一般是被病毒强行删除或隐藏。这类病毒中，最近儿年最常见的是“U盘文件夹病毒”。感染这种病毒后，U盘中的所有文件夹会被隐藏，并会自动创建出一个新的同名文件夹，新文件夹 的名字后而会多一个“.exe”的后缀。当用户双击新出现的病毒文件夹时，用户的数据会被删除掉，所以在没有还原用户的文件前，不要点击病毒文件夹。计算机屏幕上出现异常显示计算机屏幕会出现的异常显示有很多， 包括悬浮广告、异常图片等。以中奖广告为例进行介绍，计算机屏幕上会出现广告对话框。请参考：http://jingyan.baidu.com/article/148a192161668a4d71c3b1a1.html——————————————————————————————————

临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下。 一.临床标本的收集和保存 用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面： （1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 （2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 （3）血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。 （4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 （5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 二、试剂准备 在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。 三、加血清样本及反应试剂 在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。 四、温育 温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。 温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点： （1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间，在做HBsAg测定的室内质控中，测定由卫生部临床检验中心供应的1 ng/ml弱阳性样本时，总是测不出来，不知原因为何？这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证37℃下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。 （2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如2～8℃下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。 （3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。 总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。 五、洗板 固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。 在临床实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，使用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。在特定临床实验室所使用的洗板机，到底洗多少次能达到要求，可进行下面这个简单的实验：选择4×8 HBsAgELISA包被板条，每2×8孔分别加入相同一份弱阳性和一份阴性样本，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育后，洗板孔时按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物显色测定，如洗3次后，显色不再改变，即洗3次的板孔比色测定与4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，阳性/阴性值保持最大不变，则可以认定该实验室所用洗板机3次洗板即可达到要求。 六、显色 在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15～30分钟。从理论上说，37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。 此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。以OPD为底物，配好后应为无色，否则就不能使用。以TMB为底物，整个显色反应过程无需避光，而以OPD为底物，则需避光进行。关于TMB和OPD的显色反应特点及注意点可参考前面有关章节内容。显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。 七、比色 ELISA的比色测定由酶标仪进行，有的同行可能会认为，既然由酶标仪进行，那么此时便可以万事大吉了，其实不然，因为当代较为先进的酶标仪器仪表，均有较多的功能，使用不当，会得到令人难以理解的结果。如使用酶标仪比色测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等等。这主要是没有正确地理解和使用酶标仪所致。至于如何正确理解和使用酶标仪详见后面有关章节。此处，只是强调下面两点： （1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。由于有的临床实验室在进行ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。 （2）单波长或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不必设空白孔。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。 八、结果判定 临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。目前国内在临床上应用的ELISA试剂盒绝大部份是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部份用于αFP、hCG、细胞因子等的定量测定。ELISA定性测定的“阳性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值（Cut-off）。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线（又称标准曲线）。有关ELISA定性和定量测定结果的数据处理后面将有专门章节讨论。本处只想强调的一点是，ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”结果的判定依据只能是试剂盒本身所确定的Cut-off值，而不能以卫生部临床检验中心供应弱阳性定值质控血清。为什么要强调这一点呢？主要是因为以前有很多基层实验室均使用部中心供应的弱阳性定值质控血清（以前也称“临界值”血清）的测定吸光度来判定结果，高于其判为阳性，反之为阴性，而不管试剂盒Cut-off值为何。到目前为止，仍有一些实验室在坚持这种错误的做法。试剂盒的Cut-off值的设立是建立在一系列科学试验及统计学研究的基础上的（详见后述），而部中心供应的弱阳性定值质控血清主要是供临床实验室进行室内质控时使用。 下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写。 （1）S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。 （2）S/N或P/N：其中S同（1），N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或P/N≥2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut-off值而已。 九、结果报告及解释 临床ELISA测定结果的报告较为简单。定性测定报阴性或阳性即可；定量测定则报出具体的数值。结果解释比较起来要复杂的多，它要求实验室技术人员对所测定的项目有较为全面的知识基础。例如，对乙肝“两对半”结果的解释，不但要求检验者要知道不同的结果模式的临床意义，而且必须对乙肝病毒的分子生物学、分子的变异及其对表型的影响有更深层次的了解。现在，检验不再是单纯的实验室测定，而已成为一门临床医学学科，即检验医学，这就要求从事医学检验工作的检验医师，对所做的测定项目除了知其然，还要知其所以然，否则就难免为时代所淘汰。 综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因问 题可能的原因（非试剂盒本身的原因）1．弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题2．测定的重复性差（相同样本两次测定结果不一致）这是典型的由测定操作引起的问题，包括（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；（2）加样过快，孔间发生污染；（3）加错样本；（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；（5）不同批号试剂盒中组分混用；（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；（7）孔内污染杂物；（8）酶标仪滤光片不正确；（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。3．白板（阳性对照不显色）（1）漏加酶结合物；（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。（3）漏加显色剂A或B；（4）终止剂当显色剂使用。4．全部板孔均有显色（1）洗板不干净；（2）显色液变质；（3）加底物的吸光受酶污染；（4）洗板液受酶等污染。摘自《检验诊断与实验室自动化》2004年第4期

三衢道中曾几梅子黄时日日晴，小溪泛尽却山行。绿阴不减来时路，添得黄鹂四五声。