- 可乐
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loxp-frt-neo-frt 是一个打靶用工具载体(pL451)的主要元件。
另外,还有另一个工具载体loxp-neo-loxp(pL452)。
在条件型基因打靶时,先在需敲除的Exon一侧加入一个loxp-neo-loxp,成为exon-loxp-neo-loxp,通过阿拉伯糖诱导EL350菌表达cre酶,删除两个loxp间的片段,留下一个loxp,成为exon-loxp,再将loxp-frt-neo-frt插入在需敲除的Exon另一侧,成为loxp-frt-neo-frt-exon-loxp,从而实现对Exon 的锚定。
先说一下 neo, Cre-loxp 系统和 Flp-FRT系统
neo:
是对新霉素(neomycin)的抗药基因。细胞表达该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素,破坏卡那霉素和新霉素(原核生物)以及G418(geneticin)(在真核生物)。
该基因往往被克隆到表达载体,作为筛选基因
Cre-loxp 是一个基于传座效应的DNA片段同源重组系统。
1.Cre是一个重组酶,可以识别一段DNA序列中相邻的两个loxp片段,并将两个loxp间的DNA序列剪切,在原位点上只留下一个loxp,也可在两段都带有两个相邻loxp序列的DNA序列间介导同源重组,达到交换DNA片段的目的。
2.loxp是一个有独特结构的序列,一共34bp,它由内部8bp的中心序列以及两侧13bp的回文重复序列组成。
Flp-FRT 与 cre-loxp 系统的原理相似。
Flp 重组酶也是基因敲除中常用的一个重组酶来自酵母。Flp重组酶能将两个FRT 位点之间的片段删除。FRT与loxp的结构相同,但序列不同。
带有这个载体结构的中靶细胞能表达neo 基因,从而在筛选中活下来,
筛选基因的存在可能会对基因功能的研究产生不可预料的影响,这时就可以用 Flp-FRT 系统,将筛选基因以及FRT位点删除。
在loxp与第一个FRT 位点间一般是需敲除基因的外显子,使用cre-loxp 系统就能把两个loxp 间的片段全部删除。
把中靶细胞注射到囊胚中,再移植到假孕鼠体内,发育得到带有以上载体骨架的小鼠,再与表达cre 或者 flp重组酶工具鼠交配,就可以在后代中实现基因的敲除,也可以在中靶细胞的培养中使用cre 或 flp重组酶。
个人理解 :loxp 与 FRT在基因敲除中起到一个锚定目的基因,让核酸重组酶识别并删除的作用。
- cloud123
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这个不知道你所指的具体情况是什么。
个人认为应该是载体系统。
loxp和frt都是位点特异性重组酶,主要的用途就是载体转录(转染)的过程中将目的基因重组到基因组的特定位置。
如果你能再提供更多的资料,可能我还能给你更准确的答案。
- clou
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loxP-FRT-PGK-gb2-neo-FRT
( 英文名称:Pro- and Eukaryotic Neomycin Selection Cassette flanked by FRT-sites and one additional upstream lox)
类别:分子生物学试剂
The loxP-FRT-PGK-gb2-neo-FRT template is designed to allow kanamycin/neomycin selection in prokaryotic and eukaryotic cells, respectively.
It combines a prokaryotic promoter (gb2) for expression of kanamycin resistance in E.coli with a eukaryotic promoter (PGK) for expression of neomycin resistance in mammalian cells.
The prokaryotic promoter gb2 is a slightly modified version of the Em7 promoter. It mediates higher transcription efficiency than the generally used Tn5 promoter. The promoter of the mouse Phosphoglucokinase gene (PGK) is used as the eukaryotic promoter. A synthetic polyadenylation signal terminates the kanamycin/neomycin expression. The cassette is flanked by FRT sites for later excision by Flprecombinase.
An additional single loxP site is located at the 5" end of the cassette. Unique NotI and XhoI sites flank the cassette for convenient cloning with restriction sites.
Using the provided PCR template one can easily create a loxP-FRT-PGK-gb2-neo-FRT cassette flanked by any other restriction sites to clone the cassette
into the vector of choice. The restriction sites can be introduced by adding the corresponding sequence in the PCR primer. The template can easily be used to generate targeting constructs mediated by Red/ET Recombination.
The loxP-FRT-PGK-gb2-neo-FRT template is not linear but plasmid based (3485 bp in size). Due to its R6K origin the plasmid cannot replicate in most E.coli strains. The PCR product can therefore be used directly for downstream applications without any further purification.
At least 20 PCR reactions can be performed using 1 ul per reaction as template.