阿啵呲嘚-
1．1用基因枪法获得的转基因小麦 1992年对利用现代生物技术改良小麦而言是具有历史意义的一年。Vasil等以长期培养的胚性愈伤组织为外植体，通过基因枪将GUS/Bar基因导入小麦品种“Pavon”，获得对除草剂Basta具有抗性再生植株(T0)及其后一下（T1），从而宣告世界上第一株转基因小麦问世。一年后，同一研究组又对基因方法进行了优化，以未成熟胚及其愈伤组织为外植体，在3个小麦基因型(Pavon、Bobwhite和RH770019)上获得成功，并且将获得转基因小麦植株的时间由15个月缩短至7-9个月。在这一年，Weeks等也报道以品种“Bobwhite”的未成熟胚为外植体通过基因枪法获得转基因小麦植株。两个独立的实验室用同一品种(Bobwhite)的相同组织（未成熟胚）和相同的方法（基因枪法）都得到相同或相似的结果（获得转基因植株），表明所用的转基因方法是可靠的。此后，以未成熟胚（或称为“幼胚”）及其衍生物为外植体，通过基因枪法获得转基因小麦的报道与日俱增，已经成为迄今为止小麦基因转导的主要方法。值得一提的是，以小麦胚顶端分生组织、营养体顶端分生组织和花序分生组织为目标，用“手持式”基因枪射击也获得外源基因的瞬时表达和转基因植株。这一方法能绕过全能性细胞数量的问题，在小麦基因转导上具有一定的潜力。
1．2用花粉管通道法获得的转基因小麦 利用花粉管通道法转导小麦的工作主要集中在前5年（1990-1995），而且主要集中在我国。周文麟等报道，将C4作物的DNA通过花粉管导入春小麦，获得具有C4若干性状的转“基因”小麦及其后代。成卓敏等称获得转小麦黄矮病毒CP基因的小麦，曾君祉等刘根齐等也报道了花粉管通道法转基因小麦的获得。遗憾的是，当时这些报道都缺乏外源基因（或DNA）在转基因小麦植株及其后代中整全和表达的分子生物学证据。最近，Zeng（曾君祉）和Wu等对1990-1994期间通过花粉管通道法获得的转基因小麦的后代进行了外源“基因”表达的分析，包括分子生物学方法的分析，证明了外源基因的整合和表达，从而证明通过花粉管通道法可以获得转基因小麦。周文麟、倪建福等（个人通信）用我们构建的eMS/Bar嵌合基因转导小麦，获得具有除草剂抗性和雄性不育性状的植株，其后代仍然表现出对除草剂的抗性。花粉管通道法避免了复杂的组织培养、植株再生过程，在小麦上是很有潜力的基因转导方法。
1．3其它直接法获得的转基因小麦 其它直接法，如显微注射、激光微束穿刺、PEG介导和电激等对小麦的转化近乎无效。尽管已经有众多的研究证明外源基因在用这些直接法处理后的原生质体和细胞中能瞬时表达乃至能在产生的愈伤组织中的稳定表达，但获得转基因小麦植株的报道仅有一例。He等以品种“Hartog”的原生质体为受体，通过电激法获得具有除草剂（PPT）抗性的绿色转基因植株，但这些植株未能结籽。小麦原生质体或单细胞植株再生的困难可能是电激法、PEG法和显微注射法等直接法在小麦转基因上失败的主要原因。正是由于这些困难，使以原生质体或单细胞为受体的直接法在小麦基因转导上的前景变得十分黯淡。
1．4农杆菌介导法获得的转基因小麦 自1983年第一株农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转基因植株问世一来，农杆菌介导法很快就成为双子叶植物基因转导的主导方法。这一方法操作容易、成本低、转化效率高、单拷贝基因整合率高而且外源基因在转基因植株后代中比较稳定。能否将这一方法引入包括小麦在内的单子叶植物的基因转导成为90年代前后讨论与研究的热点。当时，一种倾向性的观点是认为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，利用农杆菌介导转化单子叶植物几乎不可能或没有可能性。这种观点的代表人物是曾在小麦等禾谷类作物组织培养与基因枪转导方面卓有建树的瑞士科学家Potrykus，他在国际权威杂志“Bio/Technology”和“Nature”都发表了他的悲观论点。农杆菌介导的石刁柏转基因植株的获得，特别是农杆菌介导的转基因水稻和转基因玉米的获得，不仅改变了单子叶植物不是农杆菌的天然寄主的看法，而且证明农杆菌介导法完全可以用于禾谷类作物的遗传转化。
在小麦上，虽然有人早在1988年就证明农杆菌能侵染并进行遗传转化，随后又有人证明农杆菌能附着到经部分酶解和未酶解的小麦幼胚细胞，但多年来一直没有得到转基因植株。Hess等报道，直接将农杆菌接种到小穗获得具有抗生素性和经Southern Blot杂交证明的转基因当代植株，外源基因部分在F1和F2中却未能检测到外源基因的存在。在人工授粉后再用携带有共合载体（pCV2260和pSIR42）的农杆菌（株系C158）处理雌蕊，Pukhal"skii获得经过PCR和Southern Blot杂交证明的F1植株，并由此获得具有外源基因的F2植株。这种简单的基因转化方法，结合了花粉通道与农杆菌侵染的优势，如果能够被其它实验室所证实，将在小麦等的基因转化上发挥主导作用。
在农杆菌介导小麦基因转导方面，Cheng等于1997打破了十几年的沉默，首次获得的正常的转基因小麦植株。2年后，我国科学工作者夏光敏等报道获得农杆菌介导的转基因小麦植株，笔者的研究组也同样成功地获得农杆菌介导的转基因小麦植株(待发表)。这种成功意味着，小麦也能象双子叶植物一样享受农杆菌介导基因转化的所有优点。
结合农杆菌介导与基因枪法的“Agrolistic”法，或通过微弹造成的微孔来帮助农杆菌附着及其所含质粒向受体细胞的转移，或把分别携带有 VirDl、VirD2和T-DNA的边界序列加外源片段的三个质粒导入受体，通过VirDl和VirD2在受体中的正常表达促使外源目标片段采用T-DNA边界序列以较低的拷贝数插入受体的基因组中，已经在小麦的基因转化上崭露头角。超声波辅助的农杆菌介导法(Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation ，SAAT)通过超声波在受体细胞上产生的微孔来帮助农杆菌附着及其所含质粒向受体细胞的转移，使外源基因在小麦受体细胞的瞬时表达强度相对纯农杆菌法增加至少100倍。Singh和Chawla和Serik等还利用碳化硅纤维(silicon carbide fibeers)来辅助农杆菌转基因。此外，还有结合农杆菌与病毒的“Agroinfection ”法等。这些方法目前虽然还不成熟，但在小麦基因转导方面具有很大的潜力。
2、小麦基因转化的受体
作为基因转化的受体取决于所用的转基因方法，而受体操作的难易程度又决定了转基因方法的成败。
小麦胚性悬浮细胞及其分离出的原生质体多用作电激法、PEG法和显微注射法等直接转基因法的受体。正是由于原生质体和悬浮细胞再生植株的困难，使电激法等直接法在小麦的基因转化方面没有多少“用武之地”。小麦的胚性愈伤组织，特别是幼胚及其愈伤组织和幼胚盾片及其愈伤组织具有较强的植株再生能力 (有人认为它们具有较大比例的全能性细胞)，无论作为基因枪法的受体还是作为农杆菌介导法的受体都能再生出转基因植株，从而成为迄今为止小麦基因转化的主要受体，同时也使基因枪法成为目前小麦的主要转基因方法，也有可能使农杆菌介导法成为今后小麦基因转化的主要方法。笔者研究组近年的实验结果 (待发表)表明，小麦花药愈伤组织的再生能力很强，经基因枪轰击后比较容易获得转基因植株，因而也是小麦转基因的良好受体。小麦的各种分生组织作为“手持式”基因枪的受体具有较大的利用潜力，但这一潜力的发挥还有待这种基因枪本身的完善和经济可利用性。雌蕊，作为花粉管通道法及农杆菌一花粉通道法的唯一受体，随着这些转基因方法的完善将在小麦转基因方面发挥越来越重要的作用，有可能发挥主导作用。小孢子、花粉、大孢子和叶基作为小麦转基因的受体可能得到进一步的开发，但在不久的将来，不可能成为主要受体。幼穗可能是进行小麦基因转化一个很好的受体。陈梁鸿在比较幼穗和幼胚为受体的转化试验中观察到，幼穗的转化效果优于幼胚。
3、小麦基因转化的目标基因和选择
标志基因到目前为止，在双子叶植物基因转化中常用的选择基因和报告基因仍然多作为小麦遗传转化的目标基因兼选择基因，这些基因主要有报告基因类的GUS、CAT和LUC;抗抗生素类的NptII、Hpt和抗除草剂类的Bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX。这些基因在小麦上利用主要是为了建立有效的遗传转化系统。随着小麦遗传转化体系的建立和完善，旨在改良小麦性状的真正的目标基因的利用不断增多。迄今为止，已经导入小麦并在转基因植株中得到表达的目标基因主要有：①改良小麦加工品质方面的基因：高分子量谷蛋白亚基(HMW Glutenin subunit)基因lAxl、lDx5和lDxl0和重组高分子量谷蛋白亚基基因。②抗病基因：病毒外壳蛋白基因(Coat protein genes，CP)、类萌芽素蛋白(germin-like proteins，GLPs)基因、水稻thaumatin-like 蛋白基因TLP、藜芦醇合成酶(stilbene synthase )基因、大麦种子核糖滞活蛋白（ribosom-inactivating protein，RIP）基因和玉米Ds转座子; ③嵌合雄性不育类基因：核糖核酸酶类基因Barnase、细胞骨架蛋白基因等;④抗除草剂类基因：Bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX。
在双子叶植物上广泛作为选择基因的抗抗生素类基因，如NptII和Hpt等，在小麦转基因上应用较少。其主要原因有两个:第一是小麦对Kan具有较高的天然抗性，第二是,人们对小麦含抗生素基因的安全性的忧虑。到目前为止，在转基因小麦中应用得最多的选择基因是抗除草剂基因Bar。
报告基因GUS、CAT和LUC曾为小麦基因转化体系的建立作出重大贡献。但在小麦转基因体系基本成熟的今天，人们已经开始寻求其它的基因以代替上述单纯的报告基因或者根本不再利用报告基因。值得一提的是外观可见报告基因(visual marker)。McCormac等和Mentewab等用花色素苷生物合成促进基因(anthocyanin biosynthesis stimulatory genes)，如Cl/Lc，作为报告基因，通过对转化受体及其细胞的颜色来选择转化子。这是一种具有广泛应用价值的报告基因。另外，合成的绿色荧光蛋白基因(SGFP-S65T)也已用于报告小麦的基因转化。
4、外源基因在转基因小麦中的表达与表达分析
广泛应用于在转基因植物中组成型表达外源基因的启动子CaMV 35s在谷物类中的作用较弱。为了增强外源基因在转基因小麦中的表达，人们或利用双CaMV35s序列，或加入单子叶植物基因的插入子(如玉米Adhl基因的插入子)，或转而利用单子叶植物基因的启动子，如水稻的Actl基因的启动子和玉米Ubil基因的启动子。Actl和Ubil启动子是目前在小麦转基因中应用最普遍的组成型启动子。另外，人工重组的组成型启动子pEmuGN启动外源基因在转基因小麦等的表达强度比CaMV35s高至少10倍。这类重组启动子在小麦遗传转化上将大有作为。
组织和/或器官特异性表达启动子的应用在小麦转基因上是一个巨大的进步。特别值得一提的是花药花粉特异性启动子的利用。De Block等以水稻花药绒毡层特异性启动子ca驱动核糖核酸酶基因Barnse在转基因小麦中表达，从而在世界上创造出第一株基因工程雄性不育小麦。笔者的研究组利用烟草花药绒毡层特异性启动子TA29也创造出基因工程雄性不育小麦。基因工程雄性不育小麦的完善与配套，将彻底改变目前杂交小麦制种难的状况。另外，化学诱导性启动子在转基因小麦上也具有巨大的应用潜力。
近年来，对外源基因在转基因小麦上的整合、表达方式已经有一定的研究，包括分子方面的研究。一般认为，外源基因在转基因小麦上的整合方式与所用的转基因方法有关，但无论是用基因枪还是农杆菌介导法，低拷贝与简单的整合仍然是占优势的整合方式；导入基因的遗传在大多数转基因系法后代中呈孟德尔遗传。Bieri等的实验证明，与MARs(matrix-associated regions)的目标基因(RIP)在转基因小麦的后4代仍然非常稳定，但Alvarez等观察到在T2代有极少数植株丧失了整合的外源基因。据Uze等报道，外源基因无论以单链还是双链，无论是以线形还是以环形，都可以整合到小麦的基因组，但线形基因的转化效率更高。Zupan等观察到，农杆菌VirE2蛋白能在转基因植物细胞中协调细胞核吸取单链DNA。Srivastava等报道了“位点特异性重组” (site-specific recombination)方法，他们利用这一方法成功地将4个4拷贝插入基因位点转化成单拷贝基因。
此外，Pederson等还利用荧光原位杂交(FlSH)研究了基因枪法导入的基因在转基因小麦染色体上定位。他们观察到，同一品种 (Florida)的不同转基因株系，外源基因的插入位点不同，例如，一个株系的插入点在染色体6B，而另一株系的插入点在染色体2A。这类研究的深入，将有助于了解插入基因的“位置效应”，从而更好地了解外源基因在转基因小麦中的表达及其稳定性。
5、小麦基因转化存在的主要问题
尽管转基因小麦的研究近年来进展很快，但与双子叶植物相比，甚至与同为谷物类的水稻和玉米相比，仍然有较大的差距。最明显的差距是，转基因双子叶作物已经有几十个种类的120多个品种已经用于生产实践或已经被批准进入大田实验，转基因水稻和玉米有若干品种也已经用于生产实践，而转基因小麦基本还处在建立和优化转基因体系阶段。笔者认为，造成这种差异的主要原因或在小麦转基因方面存在如下的问题：
第一，也是最主要的，小麦组织培养技术问题。小麦组织培养中植株再生率低和基因型依赖性很强的问题是限制转基因成功及大幅度提高转基因小麦数量的瓶颈。植株再生性强的小麦品种，如Bobwhite等，无论用基因枪法还是农杆菌法都己经得到转基因植株，而再生性差的品种则用基因枪也无法得到转基因植株。也正是由于品种的再生问题，使全世界的转基因小麦都集中在少数几个基因型，而这些基因型又并非生产实践所需要的或在生产实践中的应用很有限。
第二，基因转化的受体比较单一。未成熟胚及其衍生物是小麦转基因的主导受体，而在世界发展中国家，有条件周年提供小麦未成熟胚者寥寥无几。
第三，过份依獭基因枪法。目前转基因小麦90%以上是用基因枪法获得的，而基因枪法转基因的缺点在双子叶植物上已经表现得很明显，在此毋须多言。其实，这两个原因在本质上是由第一个原因所引起的。另外，基因枪昂贵的价格也是附带因素。
第四，对农杆菌转化单子叶植物，特别是转化小麦的机理缺乏系统而深入的研究。目前人们已经认识到，不同种类的农杆菌对同一种单子叶植物的侵染能力不同，甚至同一菌株在不同的培养条件下侵染能力也有明显差异。而包括小麦在内的一些单子叶植物本身也存在着一些不利于农杆菌侵染的因素，如，细胞壁的果胶多糖的高度酯化而缺乏农杆菌的附着位点;分泌的愈伤诱导物少或缺乏或与双子叶植物存在明显的差异，不利于农杆菌的转化等。正是由于这些了解，人们通过选用适宜的农杆菌菌株和植物表达载体、提高侵染时农杆菌的浓度和延长侵染时间、在共培养时加入vir基因活化剂 (如AS，OH-AS，双子叶植物伤流等)以及选用合适的受体基因型、外植体和培养基等，使农杆菌转化小麦有了重大突破，成功地获得转基因植株。
第五，小麦本身为异源6倍体，基因组较大而复杂，导入的外源基因的沉默与修饰更为严重。
第六，对转基因小麦分子生物学证据作用的过分依赖。这在某中意义上曾扼制了极有优势的花粉管通道法在小麦转基因上的应用。
6、转基因小麦的展望
随着小麦多种基因转化体系的建立或初步建立，小麦的转基因研究的进展在今后5年将会更快。但这种进展将以更高效的植株再生体系的建立和完善为基础。以基因枪为主体的转基因研究将转向以农杆菌介导法为主体转基因研究，这一研究将会优化或完善农杆菌介导的小麦转基因体系。同时，基因枪法转化小麦将从研究阶段进入应用阶段，因而将有少量转基因小麦品系或品种进入大田试验或作为品系、品种释放。花粉管通道法，特别是它与农杆菌结合的方法将被人们普遍接受并广泛用于小麦转基因的实践。各种辅助农杆菌介导的方法将走向成熟。抗抗生素基因作为选择基因将基本在小麦转基因上消失，代之而来的将是不同的抗除草剂基因、不同糖类和激素类基因。明显易见而又对小麦有益的报告基因，如花色素基因等将会得到较普遍的应用，因而转化子的选择效率将大为提高。更多的优良农业性状基因将被导入和表达，特别是提高面粉，营养价值、改良面粉加工性状的品质基因、提高植株抗病性的基因、提高植株抗旱性的基因和促进植株氮的有效利用基因。更高强度的启动子和组织、器官特异性启动子将会被普遍利用，化学剂可调控启动子也将在部分先进的实验室利用，象 “位点特异性重组”等单拷贝插入技术将更加完善并得到应用。基因工程雄性不育体系将会得到完善，并初步用于杂交种子的生产。抗除草剂基因也将用于控制杂种的纯度。另外，对外源基因的插入位点和插入方式将有比较清楚的了解，从而对外源基因的表达与沉默将有更清楚的了解。同时，反义基因技术将初步用于对小麦功能基因的研究。
或
一、植物的遗传转化
20世纪70年代末80年代初，人们用野生型Ri和Ti质粒转化烟草和马铃薯细胞获得再生植株后，以Ti质粒为载体的植物遗传转化技术随之被建立。近年来植物的遗传转化技术得到了迅速发展，建立了多种转化系统。按照基因引入受体植物细胞的方法，植物遗传转化技术大体可分为两类：以载体为媒介的基因转移和基因或DNA的直接转移。所谓以载体为媒介的基因转移就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将外源基因转入植物细胞的技术。DNA的直接转移是指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术。
（一）载体法转化 农杆菌介导的转化是最主要的一种载体转化方法。利用经过改造的农杆菌Ti质粒为载体可以高效地转移外源基因。所获得的转化植物有两种基本方法：一种是1979年Marton等以植物原生质为受体的共培养法（ocultivation）；一种是1985年Horsch等人建立的叶盘法（leaf disc cocultivation）。
共培养法是把农杆菌与植物原生质体共同培养以实现转化的方法。其程序包括农杆菌对初生细胞壁的原生质体的转化、转化细胞的筛选和诱导转化细胞分化并再生植株。
叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。
农杆菌介导的遗传转化是大多数双子叶植物转化中常采用的方法，但由于农杆菌具有宿主局限性，极少能感染单子叶植物，特别是一些重要的农作物如水稻、小麦、玉米等对农杆菌不敏感，难于应用此法进行遗传转化。
除上述以Ti质粒为载体的基因转化外，还可以用脂质体（liposome）为载体进行遗传转化。脂质体是由磷脂组成的膜状结构，因此可将DNA分子包装在脂质体内以避免受体细胞DNase的降解，把DNA分子导入到植物的原生质体中去。
（二）基因直接转移的方法 这是指既不依赖于农杆菌，也不依赖其他载体或媒介的一些基因转移方法。
1．电激和电注射法 电脉冲能改变细胞膜的透性。通过高压电脉冲的电激穿孔作用把外源DNA引入植物原生质体的方法就称为电激法（electroporation）。这种方法现已较广泛地应用于单子叶和双子叶植物以及动物的基因转移，如20世纪80年代末用此法将新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因转入玉米自交系的原生质体，已再生成植株。
通过电激技术把基因直接引入完整的植物细胞或组织的方法，称作电注射（electroinjection）。这种方法可避免原生质体培养和再生成植株的繁杂操作与困难，因而具有巨大的应用潜力。
2．基因枪法 基因枪法又称粒子轰击技术（particle bombardment）。这一方法是用粒子枪把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速地射进植物细胞或组织。由于此法快速简便，不受宿主范围限制，而受体植物细胞不需去除细胞壁，转化率又高，被转化的细胞或组织容易再生成植株，因而颇受关注。
3．微注射法 微注射法（microinjection）是利用显微注射仪等，通过机械的方法将外源基因或DNA直接注入细胞核或细胞质。与其他方法相比，这个方法对外源遗传物质的导入更为直接和有效。
微注射法除用于植物细胞外，近些年还发展到用于直接注射植物子房，这样更有利于外源遗传物质对幼胚的转化。这方面的工作我国于20世纪70年代即已进行了理论与实践的探索，并已获得抗枯萎病的棉花转化植株抗虫棉等。
二、转基因动物技术及其应用
（一）转基因动物的概念 借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物（transgenic animal）。转入的目的基因称为转基因（transgene），这种转移目的基因的过程称为转基因作用（transgenesis）。关于“转基因”的概念，通常只限于动、植物中经基因工程技术进行的基因转移，因此品种间不论有性或无性杂交获得新基因的途径都不属此范畴。
（二）转基因动物技术 转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物技术，它克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。根据外源基因导入的方法和对象的不同，至今主要有3种途径可以产生转基因动物，即显微注射法、反转录病毒法和胚胎干细胞法。反转录病毒转移基因的基本方法在前面已有简介，这里只介绍显微注射法和胚胎干细胞法两种。
1．受精卵原核显微注射法 显微注射技术是从动物胚胎学研究移核实验的基础上发展而来。20世纪80年代初期人们利用这一方法向动物生殖细胞转移外源基因，成功地建立了转基因小鼠。1985年转基因绵羊和转基因猪问世，以后转基因大鼠、兔、鸡、牛、鱼等都已陆续取得成功，可见显微注射法是迄今应用得较为普遍而又最有成效的一种获得转基因动物的技术。
本方法是在显微镜下，用直径约为1μm的玻璃管直接插入受精卵的雄原核内，将毛细管内所带有的外源基因的DNA注入原核，然后将其移植到假孕母体输卵管或子宫内并发育成子代个体。为了解转基因的整合情况，可酌情应用斑点杂交、多聚酶链式反应或Southern印迹杂交等方法对子代个体DNA进行检测。
显微注射法的优点是导入的外源基因片段可长达50 kb，且无需载体，外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高。其不足之处是外源基因的整合是随机的，因而难以控制其整合率；再者，对外源基因能否稳定整合于受体基因组的检测，必须等到子一代个体出生后经过选择才能确定，不利于在生育期长、产仔少的大家畜中应用。
2．胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。20世纪80年代中期人们开始研究利用ES细胞获得转基因动物的方法。这个途径是将外源基因直接导入ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体ES细胞。在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引入的外源基因传递下去。
在以胚胎干细胞为媒介获得转基因动物的技术中，既可以用多种方法将外源基因导入ES细胞，且细胞的鉴定、筛选比较方便，又可预先在细胞水平上测定外源基因的拷贝数、定位和表达的水平以及插入的稳定性等，而且将ES细胞注入囊胚的操作较易进行，整合率相对较高。只是建立ES细胞系本身就是一项难度极高的工作，目前小鼠ES细胞系虽已建立，但在猪、羊中还未能得到真正稳定的ES细胞株。
（三）转基因动物的应用 转基因动物的研究内容非常广泛，20世纪80～90年代以来从基础理论到应用技术在深度和广度上都有了很大发展，并已日渐由实验室走向生产实践。
1．在基因表达调控研究方面的应用 利用转基因动物可作为在体内研究外源基因表达调控的“反应器”，下面仅就DNA顺式调控元件和基因在发育中的时空调节为例予以介绍。
（1）顺式调控元件的研究 异常的脂蛋白水平与动脉粥样硬化等疾病有关。人类有5种脂蛋白，各自含有不同的载脂蛋白。现已发现约有17种载脂蛋白，它们的编码基因已测序，是用于研究心血管疾病的候选基因。把载脂蛋白基因转入小鼠，可用来研究人脂蛋白代谢、调控以及动脉粥样硬化。在研究载脂蛋白基因组织特异性表达的顺式调控元件时，发现有两簇载脂蛋白基因凋节的组织特异性表达（图19-15）。一簇包括A－Ⅰ、C-Ⅲ和 A-Ⅳ基因，定位于人11号染色体长臂2区3带（11q23），是按A－Ⅰ、C－Ⅲ、A－Ⅳ的顺序组成。C－Ⅲ的转录方向与其他两个基因相反。 A-Ⅰ和C-Ⅲ主要在肝和小肠中表达，A-Ⅳ主要在小肠表达。在 C-Ⅲ基因的-0.2～-1.4bp之间是调节 A－Ⅰ基因在小肠中表达的区域。这个区域也是 C－Ⅲ和A－Ⅳ基因在小肠表达的凋控元件，表明这一元件可以调节整个载脂蛋白基因簇在小肠的表达。另一基因簇定位于19号染色体长臂1区3带（19q13），包含有E、C－Ⅰ和C-Ⅱ基因，它们按E、C－Ⅰ、C－Ⅱ顺序排列。E基因主要在肝脏和大部分身体组织中表达，但表达水平低。以后发现在C－Ⅰ基因和C－Ⅱ基因之间有
S笔记-
1、 已经获得的转基因小麦
1．1用基因枪法获得的转基因小麦 1992年对利用现代生物技术改良小麦而言是具有历史意义的一年。Vasil等以长期培养的胚性愈伤组织为外植体，通过基因枪将GUS/Bar基因导入小麦品种“Pavon”，获得对除草剂Basta具有抗性再生植株(T0)及其后一下（T1），从而宣告世界上第一株转基因小麦问世。一年后，同一研究组又对基因方法进行了优化，以未成熟胚及其愈伤组织为外植体，在3个小麦基因型(Pavon、Bobwhite和RH770019)上获得成功，并且将获得转基因小麦植株的时间由15个月缩短至7-9个月。在这一年，Weeks等也报道以品种“Bobwhite”的未成熟胚为外植体通过基因枪法获得转基因小麦植株。两个独立的实验室用同一品种(Bobwhite)的相同组织（未成熟胚）和相同的方法（基因枪法）都得到相同或相似的结果（获得转基因植株），表明所用的转基因方法是可靠的。此后，以未成熟胚（或称为“幼胚”）及其衍生物为外植体，通过基因枪法获得转基因小麦的报道与日俱增，已经成为迄今为止小麦基因转导的主要方法。值得一提的是，以小麦胚顶端分生组织、营养体顶端分生组织和花序分生组织为目标，用“手持式”基因枪射击也获得外源基因的瞬时表达和转基因植株。这一方法能绕过全能性细胞数量的问题，在小麦基因转导上具有一定的潜力。
1．2用花粉管通道法获得的转基因小麦 利用花粉管通道法转导小麦的工作主要集中在前5年（1990-1995），而且主要集中在我国。周文麟等报道，将C4作物的DNA通过花粉管导入春小麦，获得具有C4若干性状的转“基因”小麦及其后代。成卓敏等称获得转小麦黄矮病毒CP基因的小麦，曾君祉等刘根齐等也报道了花粉管通道法转基因小麦的获得。遗憾的是，当时这些报道都缺乏外源基因（或DNA）在转基因小麦植株及其后代中整全和表达的分子生物学证据。最近，Zeng（曾君祉）和Wu等对1990-1994期间通过花粉管通道法获得的转基因小麦的后代进行了外源“基因”表达的分析，包括分子生物学方法的分析，证明了外源基因的整合和表达，从而证明通过花粉管通道法可以获得转基因小麦。周文麟、倪建福等（个人通信）用我们构建的eMS/Bar嵌合基因转导小麦，获得具有除草剂抗性和雄性不育性状的植株，其后代仍然表现出对除草剂的抗性。花粉管通道法避免了复杂的组织培养、植株再生过程，在小麦上是很有潜力的基因转导方法。
1．3其它直接法获得的转基因小麦 其它直接法，如显微注射、激光微束穿刺、PEG介导和电激等对小麦的转化近乎无效。尽管已经有众多的研究证明外源基因在用这些直接法处理后的原生质体和细胞中能瞬时表达乃至能在产生的愈伤组织中的稳定表达，但获得转基因小麦植株的报道仅有一例。He等以品种“Hartog”的原生质体为受体，通过电激法获得具有除草剂（PPT）抗性的绿色转基因植株，但这些植株未能结籽。小麦原生质体或单细胞植株再生的困难可能是电激法、PEG法和显微注射法等直接法在小麦转基因上失败的主要原因。正是由于这些困难，使以原生质体或单细胞为受体的直接法在小麦基因转导上的前景变得十分黯淡。
1．4农杆菌介导法获得的转基因小麦 自1983年第一株农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转基因植株问世一来，农杆菌介导法很快就成为双子叶植物基因转导的主导方法。这一方法操作容易、成本低、转化效率高、单拷贝基因整合率高而且外源基因在转基因植株后代中比较稳定。能否将这一方法引入包括小麦在内的单子叶植物的基因转导成为90年代前后讨论与研究的热点。当时，一种倾向性的观点是认为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，利用农杆菌介导转化单子叶植物几乎不可能或没有可能性。这种观点的代表人物是曾在小麦等禾谷类作物组织培养与基因枪转导方面卓有建树的瑞士科学家Potrykus，他在国际权威杂志“Bio/Technology”和“Nature”都发表了他的悲观论点。农杆菌介导的石刁柏转基因植株的获得，特别是农杆菌介导的转基因水稻和转基因玉米的获得，不仅改变了单子叶植物不是农杆菌的天然寄主的看法，而且证明农杆菌介导法完全可以用于禾谷类作物的遗传转化。
在小麦上，虽然有人早在1988年就证明农杆菌能侵染并进行遗传转化，随后又有人证明农杆菌能附着到经部分酶解和未酶解的小麦幼胚细胞，但多年来一直没有得到转基因植株。Hess等报道，直接将农杆菌接种到小穗获得具有抗生素性和经Southern Blot杂交证明的转基因当代植株，外源基因部分在F1和F2中却未能检测到外源基因的存在。在人工授粉后再用携带有共合载体（pCV2260和pSIR42）的农杆菌（株系C158）处理雌蕊，Pukhal"skii获得经过PCR和Southern Blot杂交证明的F1植株，并由此获得具有外源基因的F2植株。这种简单的基因转化方法，结合了花粉通道与农杆菌侵染的优势，如果能够被其它实验室所证实，将在小麦等的基因转化上发挥主导作用。
在农杆菌介导小麦基因转导方面，Cheng等于1997打破了十几年的沉默，首次获得的正常的转基因小麦植株。2年后，我国科学工作者夏光敏等报道获得农杆菌介导的转基因小麦植株，笔者的研究组也同样成功地获得农杆菌介导的转基因小麦植株(待发表)。这种成功意味着，小麦也能象双子叶植物一样享受农杆菌介导基因转化的所有优点。
结合农杆菌介导与基因枪法的“Agrolistic”法，或通过微弹造成的微孔来帮助农杆菌附着及其所含质粒向受体细胞的转移，或把分别携带有 VirDl、VirD2和T-DNA的边界序列加外源片段的三个质粒导入受体，通过VirDl和VirD2在受体中的正常表达促使外源目标片段采用T-DNA边界序列以较低的拷贝数插入受体的基因组中，已经在小麦的基因转化上崭露头角。超声波辅助的农杆菌介导法(Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation ，SAAT)通过超声波在受体细胞上产生的微孔来帮助农杆菌附着及其所含质粒向受体细胞的转移，使外源基因在小麦受体细胞的瞬时表达强度相对纯农杆菌法增加至少100倍。Singh和Chawla和Serik等还利用碳化硅纤维(silicon carbide fibeers)来辅助农杆菌转基因。此外，还有结合农杆菌与病毒的“Agroinfection ”法等。这些方法目前虽然还不成熟，但在小麦基因转导方面具有很大的潜力。
2、小麦基因转化的受体
作为基因转化的受体取决于所用的转基因方法，而受体操作的难易程度又决定了转基因方法的成败。
小麦胚性悬浮细胞及其分离出的原生质体多用作电激法、PEG法和显微注射法等直接转基因法的受体。正是由于原生质体和悬浮细胞再生植株的困难，使电激法等直接法在小麦的基因转化方面没有多少“用武之地”。小麦的胚性愈伤组织，特别是幼胚及其愈伤组织和幼胚盾片及其愈伤组织具有较强的植株再生能力 (有人认为它们具有较大比例的全能性细胞)，无论作为基因枪法的受体还是作为农杆菌介导法的受体都能再生出转基因植株，从而成为迄今为止小麦基因转化的主要受体，同时也使基因枪法成为目前小麦的主要转基因方法，也有可能使农杆菌介导法成为今后小麦基因转化的主要方法。笔者研究组近年的实验结果 (待发表)表明，小麦花药愈伤组织的再生能力很强，经基因枪轰击后比较容易获得转基因植株，因而也是小麦转基因的良好受体。小麦的各种分生组织作为“手持式”基因枪的受体具有较大的利用潜力，但这一潜力的发挥还有待这种基因枪本身的完善和经济可利用性。雌蕊，作为花粉管通道法及农杆菌一花粉通道法的唯一受体，随着这些转基因方法的完善将在小麦转基因方面发挥越来越重要的作用，有可能发挥主导作用。小孢子、花粉、大孢子和叶基作为小麦转基因的受体可能得到进一步的开发，但在不久的将来，不可能成为主要受体。幼穗可能是进行小麦基因转化一个很好的受体。陈梁鸿在比较幼穗和幼胚为受体的转化试验中观察到，幼穗的转化效果优于幼胚。
3、小麦基因转化的目标基因和选择
标志基因到目前为止，在双子叶植物基因转化中常用的选择基因和报告基因仍然多作为小麦遗传转化的目标基因兼选择基因，这些基因主要有报告基因类的GUS、CAT和LUC;抗抗生素类的NptII、Hpt和抗除草剂类的Bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX。这些基因在小麦上利用主要是为了建立有效的遗传转化系统。随着小麦遗传转化体系的建立和完善，旨在改良小麦性状的真正的目标基因的利用不断增多。迄今为止，已经导入小麦并在转基因植株中得到表达的目标基因主要有：①改良小麦加工品质方面的基因：高分子量谷蛋白亚基(HMW Glutenin subunit)基因lAxl、lDx5和lDxl0和重组高分子量谷蛋白亚基基因。②抗病基因：病毒外壳蛋白基因(Coat protein genes，CP)、类萌芽素蛋白(germin-like proteins，GLPs)基因、水稻thaumatin-like 蛋白基因TLP、藜芦醇合成酶(stilbene synthase )基因、大麦种子核糖滞活蛋白（ribosom-inactivating protein，RIP）基因和玉米Ds转座子; ③嵌合雄性不育类基因：核糖核酸酶类基因Barnase、细胞骨架蛋白基因等;④抗除草剂类基因：Bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX。
在双子叶植物上广泛作为选择基因的抗抗生素类基因，如NptII和Hpt等，在小麦转基因上应用较少。其主要原因有两个:第一是小麦对Kan具有较高的天然抗性，第二是,人们对小麦含抗生素基因的安全性的忧虑。到目前为止，在转基因小麦中应用得最多的选择基因是抗除草剂基因Bar。
报告基因GUS、CAT和LUC曾为小麦基因转化体系的建立作出重大贡献。但在小麦转基因体系基本成熟的今天，人们已经开始寻求其它的基因以代替上述单纯的报告基因或者根本不再利用报告基因。值得一提的是外观可见报告基因(visual marker)。McCormac等和Mentewab等用花色素苷生物合成促进基因(anthocyanin biosynthesis stimulatory genes)，如Cl/Lc，作为报告基因，通过对转化受体及其细胞的颜色来选择转化子。这是一种具有广泛应用价值的报告基因。另外，合成的绿色荧光蛋白基因(SGFP-S65T)也已用于报告小麦的基因转化。
4、外源基因在转基因小麦中的表达与表达分析
广泛应用于在转基因植物中组成型表达外源基因的启动子CaMV 35s在谷物类中的作用较弱。为了增强外源基因在转基因小麦中的表达，人们或利用双CaMV35s序列，或加入单子叶植物基因的插入子(如玉米Adhl基因的插入子)，或转而利用单子叶植物基因的启动子，如水稻的Actl基因的启动子和玉米Ubil基因的启动子。Actl和Ubil启动子是目前在小麦转基因中应用最普遍的组成型启动子。另外，人工重组的组成型启动子pEmuGN启动外源基因在转基因小麦等的表达强度比CaMV35s高至少10倍。这类重组启动子在小麦遗传转化上将大有作为。
组织和/或器官特异性表达启动子的应用在小麦转基因上是一个巨大的进步。特别值得一提的是花药花粉特异性启动子的利用。De Block等以水稻花药绒毡层特异性启动子ca驱动核糖核酸酶基因Barnse在转基因小麦中表达，从而在世界上创造出第一株基因工程雄性不育小麦。笔者的研究组利用烟草花药绒毡层特异性启动子TA29也创造出基因工程雄性不育小麦。基因工程雄性不育小麦的完善与配套，将彻底改变目前杂交小麦制种难的状况。另外，化学诱导性启动子在转基因小麦上也具有巨大的应用潜力。
近年来，对外源基因在转基因小麦上的整合、表达方式已经有一定的研究，包括分子方面的研究。一般认为，外源基因在转基因小麦上的整合方式与所用的转基因方法有关，但无论是用基因枪还是农杆菌介导法，低拷贝与简单的整合仍然是占优势的整合方式；导入基因的遗传在大多数转基因系法后代中呈孟德尔遗传。Bieri等的实验证明，与MARs(matrix-associated regions)的目标基因(RIP)在转基因小麦的后4代仍然非常稳定，但Alvarez等观察到在T2代有极少数植株丧失了整合的外源基因。据Uze等报道，外源基因无论以单链还是双链，无论是以线形还是以环形，都可以整合到小麦的基因组，但线形基因的转化效率更高。Zupan等观察到，农杆菌VirE2蛋白能在转基因植物细胞中协调细胞核吸取单链DNA。Srivastava等报道了“位点特异性重组” (site-specific recombination)方法，他们利用这一方法成功地将4个4拷贝插入基因位点转化成单拷贝基因。
此外，Pederson等还利用荧光原位杂交(FlSH)研究了基因枪法导入的基因在转基因小麦染色体上定位。他们观察到，同一品种 (Florida)的不同转基因株系，外源基因的插入位点不同，例如，一个株系的插入点在染色体6B，而另一株系的插入点在染色体2A。这类研究的深入，将有助于了解插入基因的“位置效应”，从而更好地了解外源基因在转基因小麦中的表达及其稳定性。
5、小麦基因转化存在的主要问题
尽管转基因小麦的研究近年来进展很快，但与双子叶植物相比，甚至与同为谷物类的水稻和玉米相比，仍然有较大的差距。最明显的差距是，转基因双子叶作物已经有几十个种类的120多个品种已经用于生产实践或已经被批准进入大田实验，转基因水稻和玉米有若干品种也已经用于生产实践，而转基因小麦基本还处在建立和优化转基因体系阶段。笔者认为，造成这种差异的主要原因或在小麦转基因方面存在如下的问题：
第一，也是最主要的，小麦组织培养技术问题。小麦组织培养中植株再生率低和基因型依赖性很强的问题是限制转基因成功及大幅度提高转基因小麦数量的瓶颈。植株再生性强的小麦品种，如Bobwhite等，无论用基因枪法还是农杆菌法都己经得到转基因植株，而再生性差的品种则用基因枪也无法得到转基因植株。也正是由于品种的再生问题，使全世界的转基因小麦都集中在少数几个基因型，而这些基因型又并非生产实践所需要的或在生产实践中的应用很有限。
第二，基因转化的受体比较单一。未成熟胚及其衍生物是小麦转基因的主导受体，而在世界发展中国家，有条件周年提供小麦未成熟胚者寥寥无几。
第三，过份依獭基因枪法。目前转基因小麦90%以上是用基因枪法获得的，而基因枪法转基因的缺点在双子叶植物上已经表现得很明显，在此毋须多言。其实，这两个原因在本质上是由第一个原因所引起的。另外，基因枪昂贵的价格也是附带因素。
第四，对农杆菌转化单子叶植物，特别是转化小麦的机理缺乏系统而深入的研究。目前人们已经认识到，不同种类的农杆菌对同一种单子叶植物的侵染能力不同，甚至同一菌株在不同的培养条件下侵染能力也有明显差异。而包括小麦在内的一些单子叶植物本身也存在着一些不利于农杆菌侵染的因素，如，细胞壁的果胶多糖的高度酯化而缺乏农杆菌的附着位点;分泌的愈伤诱导物少或缺乏或与双子叶植物存在明显的差异，不利于农杆菌的转化等。正是由于这些了解，人们通过选用适宜的农杆菌菌株和植物表达载体、提高侵染时农杆菌的浓度和延长侵染时间、在共培养时加入vir基因活化剂 (如AS，OH-AS，双子叶植物伤流等)以及选用合适的受体基因型、外植体和培养基等，使农杆菌转化小麦有了重大突破，成功地获得转基因植株。
第五，小麦本身为异源6倍体，基因组较大而复杂，导入的外源基因的沉默与修饰更为严重。
第六，对转基因小麦分子生物学证据作用的过分依赖。这在某中意义上曾扼制了极有优势的花粉管通道法在小麦转基因上的应用。
6、转基因小麦的展望
随着小麦多种基因转化体系的建立或初步建立，小麦的转基因研究的进展在今后5年将会更快。但这种进展将以更高效的植株再生体系的建立和完善为基础。以基因枪为主体的转基因研究将转向以农杆菌介导法为主体转基因研究，这一研究将会优化或完善农杆菌介导的小麦转基因体系。同时，基因枪法转化小麦将从研究阶段进入应用阶段，因而将有少量转基因小麦品系或品种进入大田试验或作为品系、品种释放。花粉管通道法，特别是它与农杆菌结合的方法将被人们普遍接受并广泛用于小麦转基因的实践。各种辅助农杆菌介导的方法将走向成熟。抗抗生素基因作为选择基因将基本在小麦转基因上消失，代之而来的将是不同的抗除草剂基因、不同糖类和激素类基因。明显易见而又对小麦有益的报告基因，如花色素基因等将会得到较普遍的应用，因而转化子的选择效率将大为提高。更多的优良农业性状基因将被导入和表达，特别是提高面粉，营养价值、改良面粉加工性状的品质基因、提高植株抗病性的基因、提高植株抗旱性的基因和促进植株氮的有效利用基因。更高强度的启动子和组织、器官特异性启动子将会被普遍利用，化学剂可调控启动子也将在部分先进的实验室利用，象 “位点特异性重组”等单拷贝插入技术将更加完善并得到应用。基因工程雄性不育体系将会得到完善，并初步用于杂交种子的生产。抗除草剂基因也将用于控制杂种的纯度。另外，对外源基因的插入位点和插入方式将有比较清楚的了解，从而对外源基因的表达与沉默将有更清楚的了解。同时，反义基因技术将初步用于对小麦功能基因的研究。
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一、植物的遗传转化
20世纪70年代末80年代初，人们用野生型Ri和Ti质粒转化烟草和马铃薯细胞获得再生植株后，以Ti质粒为载体的植物遗传转化技术随之被建立。近年来植物的遗传转化技术得到了迅速发展，建立了多种转化系统。按照基因引入受体植物细胞的方法，植物遗传转化技术大体可分为两类：以载体为媒介的基因转移和基因或DNA的直接转移。所谓以载体为媒介的基因转移就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将外源基因转入植物细胞的技术。DNA的直接转移是指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术。
（一）载体法转化 农杆菌介导的转化是最主要的一种载体转化方法。利用经过改造的农杆菌Ti质粒为载体可以高效地转移外源基因。所获得的转化植物有两种基本方法：一种是1979年Marton等以植物原生质为受体的共培养法（ocultivation）；一种是1985年Horsch等人建立的叶盘法（leaf disc cocultivation）。
共培养法是把农杆菌与植物原生质体共同培养以实现转化的方法。其程序包括农杆菌对初生细胞壁的原生质体的转化、转化细胞的筛选和诱导转化细胞分化并再生植株。
叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。
农杆菌介导的遗传转化是大多数双子叶植物转化中常采用的方法，但由于农杆菌具有宿主局限性，极少能感染单子叶植物，特别是一些重要的农作物如水稻、小麦、玉米等对农杆菌不敏感，难于应用此法进行遗传转化。
除上述以Ti质粒为载体的基因转化外，还可以用脂质体（liposome）为载体进行遗传转化。脂质体是由磷脂组成的膜状结构，因此可将DNA分子包装在脂质体内以避免受体细胞DNase的降解，把DNA分子导入到植物的原生质体中去。
（二）基因直接转移的方法 这是指既不依赖于农杆菌，也不依赖其他载体或媒介的一些基因转移方法。
1．电激和电注射法 电脉冲能改变细胞膜的透性。通过高压电脉冲的电激穿孔作用把外源DNA引入植物原生质体的方法就称为电激法（electroporation）。这种方法现已较广泛地应用于单子叶和双子叶植物以及动物的基因转移，如20世纪80年代末用此法将新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因转入玉米自交系的原生质体，已再生成植株。
通过电激技术把基因直接引入完整的植物细胞或组织的方法，称作电注射（electroinjection）。这种方法可避免原生质体培养和再生成植株的繁杂操作与困难，因而具有巨大的应用潜力。
2．基因枪法 基因枪法又称粒子轰击技术（particle bombardment）。这一方法是用粒子枪把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速地射进植物细胞或组织。由于此法快速简便，不受宿主范围限制，而受体植物细胞不需去除细胞壁，转化率又高，被转化的细胞或组织容易再生成植株，因而颇受关注。
3．微注射法 微注射法（microinjection）是利用显微注射仪等，通过机械的方法将外源基因或DNA直接注入细胞核或细胞质。与其他方法相比，这个方法对外源遗传物质的导入更为直接和有效。
微注射法除用于植物细胞外，近些年还发展到用于直接注射植物子房，这样更有利于外源遗传物质对幼胚的转化。这方面的工作我国于20世纪70年代即已进行了理论与实践的探索，并已获得抗枯萎病的棉花转化植株抗虫棉等。
二、转基因动物技术及其应用
（一）转基因动物的概念 借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物（transgenic animal）。转入的目的基因称为转基因（transgene），这种转移目的基因的过程称为转基因作用（transgenesis）。关于“转基因”的概念，通常只限于动、植物中经基因工程技术进行的基因转移，因此品种间不论有性或无性杂交获得新基因的途径都不属此范畴。
（二）转基因动物技术 转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物技术，它克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。根据外源基因导入的方法和对象的不同，至今主要有3种途径可以产生转基因动物，即显微注射法、反转录病毒法和胚胎干细胞法。反转录病毒转移基因的基本方法在前面已有简介，这里只介绍显微注射法和胚胎干细胞法两种。
1．受精卵原核显微注射法 显微注射技术是从动物胚胎学研究移核实验的基础上发展而来。20世纪80年代初期人们利用这一方法向动物生殖细胞转移外源基因，成功地建立了转基因小鼠。1985年转基因绵羊和转基因猪问世，以后转基因大鼠、兔、鸡、牛、鱼等都已陆续取得成功，可见显微注射法是迄今应用得较为普遍而又最有成效的一种获得转基因动物的技术。
本方法是在显微镜下，用直径约为1μm的玻璃管直接插入受精卵的雄原核内，将毛细管内所带有的外源基因的DNA注入原核，然后将其移植到假孕母体输卵管或子宫内并发育成子代个体。为了解转基因的整合情况，可酌情应用斑点杂交、多聚酶链式反应或Southern印迹杂交等方法对子代个体DNA进行检测。
显微注射法的优点是导入的外源基因片段可长达50 kb，且无需载体，外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高。其不足之处是外源基因的整合是随机的，因而难以控制其整合率；再者，对外源基因能否稳定整合于受体基因组的检测，必须等到子一代个体出生后经过选择才能确定，不利于在生育期长、产仔少的大家畜中应用。
2．胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。20世纪80年代中期人们开始研究利用ES细胞获得转基因动物的方法。这个途径是将外源基因直接导入ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体ES细胞。在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引入的外源基因传递下去。
在以胚胎干细胞为媒介获得转基因动物的技术中，既可以用多种方法将外源基因导入ES细胞，且细胞的鉴定、筛选比较方便，又可预先在细胞水平上测定外源基因的拷贝数、定位和表达的水平以及插入的稳定性等，而且将ES细胞注入囊胚的操作较易进行，整合率相对较高。只是建立ES细胞系本身就是一项难度极高的工作，目前小鼠ES细胞系虽已建立，但在猪、羊中还未能得到真正稳定的ES细胞株。
（三）转基因动物的应用 转基因动物的研究内容非常广泛，20世纪80～90年代以来从基础理论到应用技术在深度和广度上都有了很大发展，并已日渐由实验室走向生产实践。
1．在基因表达调控研究方面的应用 利用转基因动物可作为在体内研究外源基因表达调控的“反应器”，下面仅就DNA顺式调控元件和基因在发育中的时空调节为例予以介绍。
（1）顺式调控元件的研究 异常的脂蛋白水平与动脉粥样硬化等疾病有关。人类有5种脂蛋白，各自含有不同的载脂蛋白。现已发现约有17种载脂蛋白，它们的编码基因已测序，是用于研究心血管疾病的候选基因。把载脂蛋白基因转入小鼠，可用来研究人脂蛋白代谢、调控以及动脉粥样硬化。在研究载脂蛋白基因组织特异性表达的顺式调控元件时，发现有两簇载脂蛋白基因凋节的组织特异性表达（图19-15）。一簇包括A－Ⅰ、C-Ⅲ和 A-Ⅳ基因，定位于人11号染色体长臂2区3带（11q23），是按A－Ⅰ、C－Ⅲ、A－Ⅳ的顺序组成。C－Ⅲ的转录方向与其他两个基因相反。 A-Ⅰ和C-Ⅲ主要在肝和小肠中表达，A-Ⅳ主要在小肠表达。在 C-Ⅲ基因的-0.2～-1.4bp之间是调节 A－Ⅰ基因在小肠中表达的区域。这个区域也是 C－Ⅲ和A－Ⅳ基因在小肠表达的凋控元件，表明这一元件可以调节整个载脂蛋白基因簇在小肠的表达。另一基因簇定位于19号染色体长臂1区3带（19q13），包含有E、C－Ⅰ和C-Ⅱ基因，它们按E、C－Ⅰ、C－Ⅱ顺序排列。E基因主要在肝脏和大部分身体组织中表达，但表达水平低。以后发现在C－Ⅰ基因和C－Ⅱ基因之间有一调控区可使E基因在肝脏内高水平表达，该区长约154 bp。此外，还证实这个调控区也调节该座位其他两个载脂蛋白基因 C－Ⅰ和 C－Ⅱ在肝脏的表达。的表达。
（2）与发育相关基因的表达与调控 用转基因动物可研究基因在发育中的时空调控。珠蛋白基因是研究发育调控的最好例子。人类珠蛋白基因分为α、β两簇，分别定位于16号和11号染色体，各长30kb和60kb。据1993年的报道，为分析完整的β-珠蛋白基因中人的珠蛋白基因的开关调控，Peterson等把一个含有248 kb长的人β-珠蛋白基因簇的酵母人工染色体（YAC）转入小鼠。对转基因小鼠中此基因簇的表达分析表明，在成年的转基因动物中只有人β-珠蛋白表达；在子一代和子二代动物中证实YAC β座位有β样珠蛋白基因的发育开关调控，即在卵黄囊中有ε-和γ-珠蛋白基因表达，在14天的肝脏中有少量γ和大量β表达，而在成年动物中则仅有β珠蛋白基因的mRNA表达。采用先在酵母细胞内通过同源重组的方式使YAC发生突变，然后把这种突变的YAC导入小鼠，就可以详细研究整个座位上基因的调控机制，如珠蛋白基因在发育与分化中的基因表达、定点诱变的β基因对发育凋节的影响等等。
除前述有关基因表达凋控的研究外，把转基因动物用于遗传病动物模型的研制近年来发展也很快，如把pro-αⅠ胶原突变基因导入小鼠基因组，可产生类似人的骨发育不全症的转基因小鼠，这对了解人类遗传病的发病机理意义重大。
2．用于基因产品的制备
在转基因动物中，导入的目的基因表达，人们就可以从该动物的乳汁和血液里获得目的基因产物，因此，可把转基因动物看作是一种个体表达系统（whole animal expression system），以制备某种基因产物。这样的转基因动物常被称作动物生物反应器（animal bioreactor）。
1982年Palmiter把大鼠生长激素基因转入小鼠，成功地获得高效表达生长激素的小鼠，其体积明显增加，证实了用转基因动物生产外源基因产品的可行性。近年来的报道已证实在转基因家畜（如猪）的乳腺中可高效合成自身不含有的异源蛋白，如乳清蛋白等。目前，英国正在研究通过羊β-乳球蛋白启动子和乳清蛋白启动子的控制，在转基因羊体内表达人α1抗胰蛋白酶和凝血因子Ⅸ；在美国已有在转基因小鼠、乳羊和乳牛乳汁中分别表达产生tPA和促性腺素的研究报道。我国利用转基因动物为反应器生产基因制品的工作也在展开，最近有关单位已从转基因羊乳汁中获得促红细胞生成素。
3．动物品种的培育与改良
把具有优良性状的基因或抗病基因导入畜禽以培育新的品种，这是转基因动物研究中的一个极重要的方面。如已培育出抗鸡白细胞组织增生病毒的转基因鸡新品种。为增强鱼类的抗冻性，已有抗冻蛋白基因在转基因鲑鱼中表达的报道。1985年我国学者朱作岩在国际上首次将小鼠MT／hGH融合基因注入金鱼受精卵中，获得转基因金鱼，其F1比转基因鱼的同代大两倍。以后该类实验中还陆续获得其他鲫、鲤等几种转入生长激素基因的鱼。
三、转基因技术研究进展
（一）基因分离技术的发展 真核生物基因组非常大，巨遗传背景常不清楚，要从这样庞大的DNA中分离目的基因实非易事。但是由于生物化学、酶学、分子生物学等学科的迅速发展，为基因的分离提供了有效手段，如今已发展了一些新的分离目的基因的技术，如PCR、转座子标签法与基因组消减技术等。
1．转座子标签技术 基因发生转座最重要的遗传效应是引起插入突变，也就是使插入位置的基因失活并诱导产生突变型，或在插入位置上出现新基因。因此，可用转座子作探针克隆出该突变基因，再用突变基因作探针，从野生型个体中分离并克隆出野生型基因。这种用转座子来分离基因的技术称为转座子标签技术（transposon tagging）（图19－16）。这种技术的一个显著特点是可以用来分离预先不清楚表达产物的基因。目前已可利用在分子水平上研究得较为清楚的转座子系统如玉米的Ac／Ds、金鱼草的Tam3等来分离异源植物的基因。
利用转座子分离植物基因时，首先要构建含转座子与质粒载体，因为已分离得到的转座子与选择标记需整合到适当的质粒基因组中才能用于目标植物的遗传转化。当前用于构建转座子载体的质粒主要是根癌农杆菌的Ti质粒和pBR322等。其次是目标植物的遗传转化，现常用带有载体系统的根癌农杆菌进行转化。第三是转座及拷贝数的检测。最后是转座子插入突变的检测及分离。而对分离得到的突变体，还要证明其突变确系转座子的插入所引起的。
近几年，一些用传统生化方法难以分离的基因已用转座子标签法分离出来，如金鱼草中控制花瓣及雄蕊发育的基因，与花的发生、发育有关的基因，亚麻的抗锈基因等。美国、荷兰等国也分别利用转座子分离拟南芥菜种子中脂肪酸合成的基因和研究植物病原体的抗性。
2．基因组消减技术 基因组消减（genomic subtraction）技术是最近几年在PCR基础上发展起来的根据表型变异进行目的基因分离和鉴定的又一种方法，已被应用于动、植物中分离遗传背景不十分清楚的基因，如在医学研究中已将该技术用于分离和鉴定肿瘤缺失和重排基因、制备多态位点探针、分离遗传性疾病基因和基因治疗等领域。
运用消减杂交技术分离缺失序列的概念最早是由Buatz提出的，他利用T4噬菌体缺失突变株的DNA来分离相应缺失区域的mRNA并获得成功。以后被许多实验室引用并加以改进。1989年D．Stuars和L．Wieland分别将PCR技术引入消减杂交方法中，使基因组消减杂交技术得以推广应用。这一技术的基本原理是先用γ射线等引起机体大片段DNA的缺失突变，然后用此突变体DNA与野生型DNA杂交，用以去除野生型中突变体的DNA。如此反复几次，在反应体系中突变体DNA所缺失的那段亲本DNA序列便被保留下来。采用生物素-亲和素-磁珠系统或HAT结合生物素-亲和素层析系统富集缺失这种序列并用PCR技术扩增。扩增的序列再用来与野生型基因文库杂交，从而克隆到对应缺失性状的基因（图19-17）。
用基因组消减杂交技术目前已从拟南芥中成功地克隆到包含赤霉素GA1位点的基因。在医学研究中也有通过基因组消减杂交技术克隆人染色体特异的基因探针的报道，如杜兴式肌营养不良（duchenne muscular dystrophy，DMD）和脉络膜缺损（choroideremia）座位的探针。
（二）基因剔除技术 基因剔除（gene knock-out）技术又称基因打靶技术（gene trageting），是20世纪80年代末发展起来的。这是利用同源重组的方法以建立基因定点灭活细胞系或获得基因定点灭活动物。这一技术近年来应用于生物学的诸多研究领域，已获得数百种基因定位缺陷小鼠。
基因剔除技术的原理首先是用基因重组方法在目的基因片段中插入一外源基因作为筛选标记基因并使目的基因失活（定点突变），再将此（灭活）基因转入胚胎多能干细胞（ES细胞）中，通过细胞内的基因同源重组使灭活基因取代染色体上原有的目的基因。经筛选和基因型鉴定后，把定点突变后的ES细胞注入宿主囊胚腔内，然后将胚胎植入假孕母体子宫，使其发育成目的基因缺陷（突变）的嵌合体，经子代自交后筛选出目的基因缺陷的纯合子即基因剔除动物。
基因剔除的具体实验步骤是：首先要进行同源重组载体的设计与构建，即选择具有一定长度（5～7kb以上）与目的基因功能区域同源的序列，并插入选择性标记基因（如新霉素抗性基因neo等），以便于筛选。在此同源序列的一端或两端还可以连接上负筛选标志基因（如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因等）。用电转染等方法将此同源重组载体转染靶细胞。通过药物抗性来筛选重组细胞克隆，并用PCR和Southern杂交等方法对重组细胞进行基因型鉴定，这时得到的就是单个等位基因被剔除的杂合子细胞。为建立等位基因双剔除的细胞系，则还要将单个等位基因剔除的细胞大量传代培养，然后在更高浓度的选择性培养基中多次重复筛选，并对最终得到的阳性克隆进行基因型鉴定。
在应用上，通过探讨目的基因突变在基因剔除动物个体发育中的时空效应以及分析体内单基因缺陷所产生的表型异常，可以研究基因功能和调控，建立疾病的动物模型和基因治疗等。因此，在细胞水平进行基因剔除研究有非常重要的意义。如近几年国外已报道建立了用于研究心血管疾病的载脂蛋白E（apoE）、低密度脂蛋白受体的基因剔除动物。
基因剔除细胞系的建立有可能直接发现特定基因剔除后的影响，阐明基因功能，制备基因缺失的细胞模型，用于发病机理或基因治疗的研究。体细胞与ES细胞同源重组有所不同，后者一般只需将同源染色体等位基因之一灭活，就能在嵌合体后代中最终获得纯合的基因剔除动物。而在体细胞水平灭活特定基因就必须把一对等位基因都灭活，否则无法研究其功能。目前采用两种方法都可成功地达到这一目的：一是用两种带有不同标记基因的同源重组载体分别对靶细胞进行两次同源重组；另一是把单个等位基因灭活的细胞系传代培养，提高标记基因产物抗药物的浓度，利用标记基因表达的累加效应，筛选出细胞系中自然发生的双等位基因被剔除的细胞克隆。
可乐-
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1 农杆菌介导玉米转基因的影响因素研究 全文快照 白云凤 王国英... 中国生态农业学报-2006年3期
2 农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究 全文快照 袁鹰 李启云... 分子植物育种-2006年2期
3 农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究进展 刘丽霞 李德全 生物技术通报-2005年6期
4 影响农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化因素的研究 农友业 何勇强... 广西植物-2005年2期
5 根癌农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展 高武军 卢龙斗... 中国农学通报-2004年6期
6 影响农杆菌介导玉米优良自交系遗传转化的因素 黄雪清 卫志明 实验生物学报-2004年5期
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农杆菌介导玉米转基因的影响因素研究白云凤 王国英 苟明月 赵晋锋 董志刚中国农业大学农业生物技术国家实验室,北京100094摘 要:研究了农杆菌介导玉米转基因过程中涉及的外植体选择、高渗和农杆菌共培养、选择培养基筛选转化体等因素对愈伤组织生长及转化效率的影响。结果表明，同一基因型玉米自交系中有少数幼穗幼胚诱导出的愈伤组织生长速度快，转化效率高；高渗和农杆菌共培养以及除草剂筛选抑制愈伤组织的生长，致使部分转基因愈伤不能分化成苗，并提出其解决途径。[著者文摘]
关键词:玉米转基因 农杆菌介导 除草剂 转化效率
分类号: S511 S513[机标]文献标识码：文章编号：栏目信息：
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Influencing factors on maize transgene process mediated by AgrobacteriumBAI Yun-Feng, WANG Guo-Ying, GOU Ming-Yue, ZHAO Jin-Feng, DONG Zhi-Gang State Key Laboratory for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094, ChinaAbstract:The effects of explant selection, high osmotic treatment, co-culture with Agrobacterium, screening of transformed plants by selecting medium on the callus growth and transformation efficiency were studied in the process of maize transformation mediated by Agrobacterium. The results show that the growth rate and transformation efficiency of immature embryos derived from a vigorous ear are higher than those from other ears. High osmotic treatment and co-culture with Agrobacteriurn and herbicide screening impede the callus growth. The solutions are put forward.[著者文摘]
ation efficiency (Received Oct．15，2004；revised Dec．30，2004) 转基因技术使我们能有效利用外源基因进行品种改良、创造突破性种质。农杆菌介导的基因转化法具有能转移较大的DNA片段、整合的外源基因重排少且多以单或寡拷贝整合l1l2 J等优点。近年来该方法在禾谷类，诸如高粱[ 、水稻[ 、玉米[ 、小麦[ ]等作物的转基因中得到了广泛应用。农杆菌介导的转基因涉及外植体选择、外植体高渗和农杆菌共培养、愈伤组织在筛选培养基上培养以及筛选转化体等步骤，其中有关每一步涉及的因素对愈伤组织生长和转化的影响程度的报道尚不多见。本实验初步探讨了农杆菌介导玉米转基因过程中的一些影响因素，结果报道如下。1 实验材料与方法供试材料为玉米自交系“综31”，农杆菌菌株LBA4404，携带质粒pBar(含标记基因bar)或pBarF(不含标记基因bar)，均由中国农业大学农业生物技术国家实验室保存。基本培养基为D培养基。
Key words:Maize transgene, Agrobacterium, Herbicide, Transformation efficiency
农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究袁鹰[1] 李启云[1] 郝文媛[1] 谭化[1] 孔祥梅[1] 张光弟[2] 刘德璞[1][1]吉林省农业科学院生物技术研究中心,公主岭136100 [2]吉林省梨树县农业技术推广站,四平136500摘 要:以东北春玉米自交系7922、340、78599、921及美围杂交种H99等幼胚愈伤组织为受体，利用农杆菌介导法转化Bt（CrylA．）基因，研究菌液预处理、愈伤组织状态、侵染培养基、侵染时间及共培养条件等因素对转化频率的影响。根据转化愈伤组织的除草剂（Basta）抗性筛选结果评估转化率，表明继代培养3-5d的愈伤组织适于转化，其中以继代5d的7922愈伤组织转化率最高，为46．6％；不同基因型对农杆菌转化率存在差异，H99的抗性愈伤组织率为34．57％，7922为26．27％、340为21．36％、78599和921抗性愈伤组织率仅为8．02％和6．78％。基因型间差异显著；浸染培养基中加入（AS100～200mg/L）抗性愈伤转化率明显提高；菌液浓度OD600 0．5～0．6、侵染时间5～10min、萸培养时间3d最佳。[著者文摘]
关键词:农杆菌介导法 转化频率 影响因素 抗性愈伤组织
分类号: S511 S513[机标]文献标识码：文章编号：栏目信息：研究报告
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Studies on Influencing Factors of Agrobacterium tumefaciens Mediated Maize TransformationYuan Ying, Li Qiyun, Hao Wenyuan, Tan Hua, Kong Xiangme, Zhang Guangdi, Liu Depu 1. Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling, 136100; 2. Agriculture Generalize Station of Lishu County, Siping, 136500Abstract:Maize inbred lines in Northeast （7922,340,78599 etc.） immature embryos calli were transformed by Agrobacterium tumefaciens （CrylA Bt.） in this report. Factors influencing transformation efficiency were studied, including pre-treatment, callus state, infection medium, infection time and co-cultivation et al.. Results showed that callus subculture for 3-5 days was suitable for transformation and that transformation efficiency of 7922 callus reached the highest of 46.6% after 5 days subculture. Dominant difference existed among different maize genotype on infection sensitivity and H99 was the most sensitive genotype with 34.57% resistant callus. Transformation efficiency was improved obviously with acetosyringone （AS） （100-200mg/L） appended in medium. In addition, bacterium concentration （OD600 0.5～0.6）, 5～10 minutes infection time and co-culture 3 days were the optimal conditions for Agrobacterium tumefaciens mediated maize transformation.[著者文摘]
Key words:Agrobacterium tumefaciens mediated transformation, Transformation efficiency, Influencing factors,Resistant calli
农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究进展刘丽霞 李德全山东农业大学生命科学学院、山东省作物生物学重点实验室,泰安271018摘 要:玉米（Zea mays L．）是世界上三大主要粮食作物之一，至今其遗传转化仍比较困难，目前报道有多种成功的方法，其中农杆菌（Agrobactierium tumefaciens）介导法是当前玉米遗传转化的主要方法。本文综述了农杆菌介导的玉米遗传转化研究的发展历史、存在问题和影响因素等，并对未来发展趋势进行展望。[著者文摘]
关键词:玉米 遗传转化 农杆菌
分类号: S513 S511[机标]文献标识码：文章编号：栏目信息：综述与专论
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Genetic Transformation System of Maize Mediated by Agrobactierium tumefaciens ： A ReviewLiu Lixia ,Li Dequan College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Shandong Key Laboratory of Crop Biology, Tanan 271018 Abstract:Maize （Zea mays L. ） is one of the three main crops of the world. Maize genetic transformation is still somewhat difficult at present. Many successful methods have been reported, of which the genetic transformation mediated by Agrobacterium is a major approach. In this review, recent progresses in genetic transformation of maize mediated by Agrobacterium, its problems, and influent factors et al. were discussed, and its future advances were also prospected.[著者文摘]
Key words:Maize （Zea mays L. ） Genetic transformation Agrobactierium tumefaciens
根癌农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展高武军 卢龙斗 魏开发 孙富丛河南师范大学生命科学院，河南新乡453002摘 要:对根癌农杆菌介导的玉米基因转化中包括外植体、基本培养基及其附加物、共培养温度、信号分子与vir基因的活化的几个关键因素研究进展作了论述。近年来的研究发现，大小为1～2mm的幼胚是较为理想的转化外植体．在外植体培养基本培养基一般多选用MS和N6，在基本培养基上附加有机氮和氨基酸、金属离子均有利于转化效率的提高。转化中的共培养温度一般在20℃～25℃之间．研究认为根癌农杆菌转化禾本科植物的困难在于禾本科植物缺乏酚类物质，难以诱导Vir基因活化表达．因此在转化中多采用加入外源的酚类物质如乙酰丁香酮来提高玉米转化的成功率。
关键词:根癌农杆菌 玉米 遗传转化 外植体 培养基 附加物 共培养温度
分类号: S513文献标识码：文章编号：栏目信息：农业生物技术科学
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影响农杆菌介导玉米优良自交系遗传转化的因素黄雪清 卫志明中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实验室，上海200032摘 要:以我国玉米骨干自交系9046，齐319，414，Mo17的幼胚为材料，在已经建立的农杆菌介导的玉米幼胚转化体系的基础上，研究了影响农杆菌介导玉米优良自交系遗传转化的因素，建立了优化的玉米优良自交系的遗传转化体系。研究结果表明，1．0—2．0mm的玉米幼胚是最适宜的转化受体；在感染液和共培养基中都加入乙酰丁香酮(200μmol／L)和抗坏血酸(50mg／L)，能显著提高农杆菌对玉米的侵染能力；而感染前将幼胚高渗透压预处理未能提高转化率；延迟筛选有利于提高抗性愈伤组织的存活率。应用优化后的转化体系，获得了这4个玉米优良自交系的转基因植株，PCR阳性植株率为1．71％-4．09％。转化植株叶片总DNA的PCR和Southern杂交分析表明，T-DNA上的外源基因已经整合进了玉米基因组，并且在大多数转基因植株(71．4％)中为单位点插入。这一体系的建立，为进一步将有用基因导入玉米优良自交系奠定了基础。
关键词:玉米 自交系 幼胚 农杆菌介导 转化体系 遗传转化 转基因植株 感染 PCR 阳性
北有云溪-
农杆菌转换法，基因枪法，花粉管通道法