用pcDNA3.1在哺乳动物细胞里表达蛋白,从转染开始算,多长时间可以表达出目的蛋白呢~
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火空火图 共回答了13个问题
|采纳率84.6%- 既然你是做瞬转的话,一般24h就已经有很多表达了,48h就基本上是表达的最大值了.我们一般就只做到48h就可以收了.
- 1年前
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酶切了hindⅢ和EcoRⅠ,安洁蓝_6201年前1
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51jackok 共回答了16个问题
|采纳率87.5%pcDNA3.1本身就有抗性,可以用抗性培养基进行初步筛选,然后长出来的克隆筛选,一般为三种:
1.设计扩增外源基因片段的引物,进行菌液PCR
2.提取质粒,做质粒双酶切--Hind Ⅲ和EcoRⅠ(这个最为准确)
3.设计引物做测序1年前查看全部
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顺便想问酶切后的质粒要与目的片段连接,是否需要进行胶回收纯化呢.查有篇文献构建该质粒时并没提到胶回收纯化,新手很多问题都不大懂,感谢大家关注shaoshao1231年前1
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不长回家 共回答了10个问题
|采纳率90%首先明确一个问题,你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗,也就是说你只想把这个质粒切开吗?看你的结果好象这种可能性大些,那样我觉得最有可能是梅切不完全,即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近.
建议:首先电泳时要有原质粒作对照,这样你就可以确定跑得快的带是不是未完全切开的质粒了.其次想酶切完全,可延长梅切时间,看你的体系酶的量足够了,而且酶的量本身也不应大于1/10;只是不知梅切的时间.最后若是可以确定两条带中有一条是切开的,则可以利用胶回收纯化的方法得到所需的这一载体,在和目的片段连接,注意这时凝胶回收是必要的,但若两条带太相近,则可能切的时候难分离;若是改变实验条件最终完全梅切(只一条带,且和原质粒位置有差异),则可以用加热65度20分钟的(对于37度酶)方法将酶灭活直接用作连接载体即可,不用回收.
以上是假设你的载体这个酶切位点唯一的情况,若不是则会切下一小段片段,并且一定要凝胶回收才可得到连接载体.1年前查看全部
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肆舞忌淡 共回答了8个问题
|采纳率100%不知道你没杂出条带是因为什么原因,还有你杂交的抗体是目的蛋白的抗体吗?你杂杂标签蛋白试试,看看有没有条带啊?我这么说是因为,膜蛋白确实不好提取,而且提取后可能空间构想改变了,你的抗体可能识别不了了,而标签蛋白是多肽,构象不会受影响,只要不被你的目的蛋白档上就行,所以你可以用标签蛋白的抗体杂交下,试试.一般最好把标签和目的蛋白融合表达一下1年前查看全部
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