itc

1.点击"Download or claim"(下载或领取)2.点击"No tha3.点击"Claim game" 4.领取成功 简单介绍一下itch.io平台：itch.io最基本的属性是一个专注于独立游戏内容的数字商店。跟大家熟知的Steam、Origin等平台有类似的部分，开发者可以在这里上传自己的游戏售卖，玩家可以在这里找到自己喜欢的产品。itch.io上的买家可以给游戏定价，卖家可以决定自己与平台的分账比例。

我也感觉是itchy耶

itch是瘙痒，tickle是搔痒，同时还可用tickling和介词搭配表示某物合你意

B itch ==> B 痒 ==> 婊子 ==>Bitch。。。

当一个字可以表达更多含义的时候，这不是语言的缺陷，反而是语言高度发达的表现。如果你不认同的话，可以用这个字组合一个词，会得到更精准的解释。例如，如果你要去分itch和tickle，那就是“刺痒”和“呵痒”。

itch英音：[it06]美音：[01t06] 1. 痒[S]I have an itch on my left hand. 我左手很痒。 2. 【医】疥疮[the S] 3. 渴望;欲望[S][(+for)][+to-v]They have an itch to travel abroad. 他们渴望去国外旅行。 不及物动词 vi. 1. 发痒I itch all over. 我浑身发痒。 2. 渴望,热望[(+for)][+to-V]The boys were itching to let off their fireworks. 男孩子们急着想放烟火。 及物动词 vt. 1. 使发痒His wool shirt always itches him. 他那件羊毛衫老是弄得他身上发痒。 2. 使烦恼;使恼怒His remarks itched her. 他的话惹她生了气。 3. 【口】搔 bitch英音：[bit06]美音：[b01t06] 名词 n. 1. 母狗;母狼 2. 泼妇;令人生厌的女人That bitch is always quarreling. 那个泼妇成天跟人吵架。 3. 牢骚事不及物动词 vi. 1. 【俚】发牢骚Stop bitching and get back to work. 别牢骚满腹,工作要紧。 及物动词 vt. 1. 弄糟,糟蹋以下结果来自互联网网络释义 bitch1. 雌狗雅思分类词汇：家畜词汇_出国资讯直通车_留...bitch 雌狗2. 母狗 （美俚）婊子英语动物“男女老幼”谈--冰冰乓乓bitch 母狗 （美俚）婊子3. 母狗【转帖】动物词汇 - Lemon Tree...母狗 bitch

itch读音：英 [u026atu0283]，美 [u026atu0283]。名词：痒；搔痒；强烈愿望；渴望；疥疮。动词：发痒；渴望；热望。复数： itches。第三人称单数： itches。现在分词： itching。过去式： itched。过去分词： itched。Brown was depressed; the jungle ulcers on his feet had begun to itch and smart .布朗闷闷不乐；脚上的“丛林疮”又痛又痒。Her hands itched to put everything in order which came so naturally to her .她忍不住非要把一切都收拾得有条不紊，这已成了她的天性。At very high intensities, nuclear radiations cause itching and tingling of the skin .当核辐射强度很高时，它能使皮肤感到发痒和刺痛。It was a foolish risk, taken in a lost cause, but he was itching to get to it .这是一次愚蠢的冒险行动，是注定要失败的，然而他却迫不及待地想去试一试。I have as well as she, if the itch of play came in, i might soon lose that, and all the rest of what i had got .我和她一样明白，假使我赌上瘾来，我会失掉这些钱同我所有的一切款子。

疼痛,痒等的意思 , 动词

ITC是In the canal的缩写，是耳道式助听器的意思。CIC是Complete in the canal的简写，是完全耳道式助听器的意思，也有叫深耳道式助听器的。ITE是In the ear的简写，是耳内式助听器的意思。耳道式助听器由麦克风、数字处理器（DSP)、受话器、编程接口、存储器等组成。耳内式助听器的基本结构与耳道式助听器基本相同，都是由外壳、麦克风、集成电路放大器、电位器、授话器等构成。耳道式助听器佩戴方便，但是外露不太美观。耳内式助听器佩戴美观，但是需定期更换比较不方便。扩展资料耳内式助听器根据其在耳内的位置，可分为位于整个耳甲腔内的耳甲腔式（ITE-full shell)、位于部分耳甲腔内的半耳甲腔式（ITE-half shell ）和小耳甲腔式（ITE-low shell）三种类型。耳内式助听器多数属于目前使用最广泛的定制式助听器，它需要根据不同患者的耳道模型定做不同的外壳。也有部分耳甲腔式助听器为成品助听器，它的外形大小是固定的，佩戴者要另做一个佩戴的耳模，再将助听器嵌在耳模里一起佩戴在耳内。参考资料:百度百科-耳道式助听器百度百科-耳内式助听器

真特么的对！！让那婊子去死吧。 God damn right !!!!! Let that bitch go to hell.

we have bandages on the top shelf in the kitchen

IVR按键输入的一个核心能力的处理DTMF。 Freeswitch自身有处理DTMF的能力。 FS共支持三种DTMF处理方式，分别为inband、rfc2833、sipinfo 1.1.INBAND INBAND为带内检测方式，而且与普通的RTP语音包混在一起传送。 1.2.RFC2833 RFC2833即识别一种特殊RTP报文，报文格式如下，其中Event ID表示按键值，同一个DTMF按键通常会对应多个RTP包，这些RTP数据包的时间戳均相同，此可以作为识别同一个按键的判断依据，最后一包RTP数据包的end标志置1表示DTMF数据结束。 另外，很多SIP UA默认的TeleponeEvent都为101，但可以人为修改，这时要求在进行RFC2833 DTMF检测之前需事先获取SDP协商的TeleponeEvent参数； 1.3.SIPINFO SIPINFO为带外检测方式，通过SIP信令通道传输DTMF数据。这种方式甚至比RFC2833更有效。但是由于SIP信令和RTP收发采用的是不同的端口，所以可能会造成收到DTMF和实际的声音不同步。 配置文件conf/sip_profile/internal.xml和external.xml internal和external是单独配置的，关于DTMF都有相同的配置项 <param name="dtmf-type" value="rfc2833"/> 这个值默认好像是注释的。注释的默认为inband。 value的值可以是none或者rfc2833。 使用rfc2833的情况下，FS只需要解析RTP流程中的event事件即可。 不过使用rfc2833要求线路或者对端支持这种方式，如果不支持，可以使用inband方式交给FS处理。 某些语音网关可以处理inband的DTMF，然后生成rfc2833rtp event。但是一些设备会存在准确率的问题 FS内部使用了一个队列dtmf_inqueue存储了dtmf结构体。 所有从rtp中获取的dtmf事件压入到该队列。 然后供需要使用的地方从队列中弹出 FS处理inband的DTMF需要调用两个APP。 start_dtmf/stop_dtmf。 在dialplan里直接调用这两个APP即可。网上大部分的教程是通过dialplan的。 如果使用命令，在发起呼叫的时候可以通过originate的参数带上。如下 start_dtmf/stop_dtmf是默认的mod_dptool里的,于此类似的还有一个模块 mod_spandsp 也提供了两个APP：spandsp_start_dtmf/spandsp_stop_dtmf 个人感觉这个效果会更好一点。 如果使用inband的方式的话请注意几点： 存在一些场景，在一条腿上获取到了dtmf事件，但是需要转给其他腿。特别是在bridge的时候。 FS在bridge的时候，默认会处理这种情况。 它会把腿1的dtmf都传给腿2. 如果不想传的话，设置参数bridge_filter_dtmf。

参考资料 https://freeswitch.org/confluence/display/FREESWITCH/mod_conference 例子 confname++flags{endconf|moderator} . kick 和 hup 区别，hup不播放提示音。 conference <confname> kick <member_id>|all|last|non_moderator conference <confname> hup <member_id>|all|last|non_moderator 设置成员密码 设置主席密码 清除密码 通道变量·conference_moderator_pin·设置主席密码。 通道变量 supplied_pin = X-ConfPin=pin ,可以用来验证密码。 通过API，或者配置来对会议进行录音。 多次执行录音命令，可以录音到多个文件。 record 对应 recording start ， norecord 对应 recording stop ， chkrecord 对应 recording check ， pause 对应 recording pause ， resume 对应 recording resume 它们功能完全一样。 例子 conference 8000 play test.wav 就是会议成员加入，离开等提示音。 桥接会议，就是连接2会议。 You can subscribe to the following to receive conference events: conference::maintenance The "suppress-events" parameter can be added to the conference profile to prevent events from firing. e.g. if you"re not interested in start or stop talking events: The events that can be suppressed are: add-member, del-member, energy-level, volume-level, gain-level, dtmf, stop-talking, start-talking, mute-member, unmute-member, kick-member, dtmf-member, energy-level-member, volume-in-member, volume-out-member, play-file, play-file-member, speak-text, speak-text-member, lock, unlock, transfer, bgdial-result and floor-change. 配置会议控制按键，profile通过 <param name="caller-controls" value="none"/> 设置管理的caller-controls。none就是不使用控制按键，不设置时会使用default组。 Caller controls are used to modify the state of the conference, such as lowering the volume, mute a participant, and such. Below are the commands that can be assigned to digits and executed during a conference. The "moderator-controls" group provides additional controls for participants who enter the conference with the moderator flag set. See below. Reserved Control Group Names 例子： 详细配置

tactile 英[?t?kta?l] 美[?t?ktl] adj. 触觉的; 触觉感知的; 能触知的; 有形的; [网络] 触觉的,有触觉的; 触觉; 有触觉的; [例句]Another popular class of robotic sensing is tactile, or touch-based, done with a bump and feeler sensor.另一类常见的机器人感知是触觉的，或基于触摸的，用碰撞和触角来完成。[其他] 形近词： factice fictile ductile

kitchen的读音是：英["k_t__n]。kitchen的读音是：英["k_t__n]。kitchen的例句是用作名词(n.)Ihavetomopthekitchenflooratleastonceaday.我每天至少要把厨房地板擦洗一次。kitchen的意思是n.厨房；灶间；(全套)炊具。一、详尽释义点此查看kitchen的详细内容n.(名词)厨房炊事人员灶间炊具（全套）炊具“厨房”（俄罗斯研制的一种空对舰导弹代号AS-4）adj.(形容词)厨房的在厨房工作的粗俗的不雅的.二、双解释义n.(名词)[C]厨房roomorbuildinginwhichmealsarecookedorprepared三、英英释义Noun:aroomequippedforpreparingmeals四、例句Ihavetomopthekitchenflooratleastonceaday.我每天至少要把厨房地板擦洗一次。Iguesstherearemiceinthekitchen.我猜想厨房里有老鼠。Iwascookinginthekitchenwhenthetelephonerang.电话铃响的时候我正在厨房里做饭。Everythinginthekitchenisingoodorder.厨房里的每样东西都井然有序。ShehelpedthemtomoveAdolphintothekitchen.她帮着他们把阿道夫抬到灶间去。Thisisanarmyfieldkitchen.这是军用野外炊具。Somekitchengadgetsaremoreofahindrancethanahelp.有些小炊具非但没有用处反而碍事。Shestabbedhiminthelegwithakitchenknife.她拿菜刀捅伤了他的腿。五、常见句型用作名词(n.)Janeiscryingforsomemorecakeinthekitchen.简正在厨房里哭,她还想要一些蛋糕。Youmadeagoodjobofpaintingthekitchenveryprofessional.你厨房刷得很好,很内行。Theapartmenthasacompactbutwell-equippedkitchen.这套房间有一个虽小巧但设备完善的厨房。Adeliciousmouthwateringsmelldriftedfromthekitchen.一种使人垂涎的香味自厨房飘来。Hewentintothekitchenandopenedtherefrigerator.他走进厨房,打开冰箱。Mymotherispreparingdinnerinthekitchen.我妈妈正在厨房做饭。Hishotpancakesaredelicious,youbuythemstraightfromthekitchentoeatinyourhands.他卖的热煎饼味道真好,你直接从厨房里买来用手拿着吃。TherestauranthasafineItaliankitchen.这家饭店有很好的意大利菜厨师。六、词汇搭配用作名词(n.)动词+～gointokitchen走进厨房paintkitchen粉刷厨房形容词+～cleankitchen干净的厨房dirtykitchen肮脏的厨房oldkitchen旧厨房名词+～fieldkitchen野外用的全套炊具soupkitchen(救济贫民、灾民等的)施粥所～+名词kitchengarden家庭菜园kitchenhelp厨房帮手kitchenknife菜刀kitchentable餐桌kitchenunit厨房设备介词+～inakitchen在厨房里七、词语用法n.(名词)kitchen的基本意思是指用来煮、烹调、做饭菜的房间,即“厨房”。引申可指“厨师”。kitchen还可指“所有的东西”,此时多用于everythingbutthekitchensink句型。kitchen常可用于另一名词前作定语。kitchen的相关近义词bakery、scullery、pantry、kitchenette、galley、caboose、cookhouse、cookroom、local、provincial、cookery、cuisine、unliterary、regional、bakehouse、board、substandard、informal、inferiorkitchen的相关临近词kite、kit、kitcheny、Kitchens、kitchener、kitchenet、Kitchenko、kitchenless、KitchenGod、kitchenmaid、kitchenmiad、kitchencar点此查看更多关于kitchen的详细信息

1、Witch Girl游戏是一款非常不错的魔女打怪游戏，在这里有非常绅士的游戏玩法，魔女在游戏中打怪会出现各种危机，不断的有怪兽前来不小心的话就会出现意外的情况哦。 2、作为腿控，必须跪舔的游戏。 3、说一下游戏直接撸的密码 4、在PASS的文字框内输入 goodjob 开启H模式 5、接着再输入girl开启 第二个H模式（懒的话随意开不开不影响全局H）。

A Aladdin - 阿拉丁 Ariel - 爱丽儿 B Belle - 贝儿 Buzz Lightyear - 巴斯光年 C Christopher Robin - 克利斯多夫罗宾 D Donald Duck - 唐老鸭/唐纳德 E Esmeralda - 爱斯梅达 F Fates - 命运三女神 Flounder - 比目鱼 G Goofy - 高飞 H Hades - 凯帝斯 Hera - 海娜 Hercules - 海格力斯 I N/A - 暂无 J Jane - 珍妮 New!!! Jasmine - 茉莉 K Kairi - 凯丽 New!!! Kala - 卡娜 New!!! Kuzco - 库斯德 L Lilo - 莉萝 Lumpy - 嘟嘟 M Meg|Megara - 蜜儿|蜜格拉 Mickey Mouse - 米奇/米老鼠 Milo - 迈罗 Minnie Mouse - 米妮 Mulan - 木兰/花木兰 Muses - 缪斯女神 Mushu - 木须 N Nemo - 尼莫 O Owl - 猫头鹰 P Pain and Panic - 痛苦和慌张 Pegasus - 柏格斯 Penny - 潘妮 Peter Pan - 小飞侠彼得潘 Philoctetes/Phil - 菲洛斯/阿菲 Pluto - 布鲁托 Pongo - 彭哥 Q Quasimodo - 加西莫多 R Rabbit - 瑞比 Riku - 利库 New!!! S Simba - 辛巴 Snow White - 白雪公主 Sora - 索拉 New!!! Stitch - 史迪奇（星际宝贝） T Tantor - 丹丹 New!!! Tarzan - 泰山 Terk - 托托 New!!! Titans - 泰坦巨魔 Tinker Bell - 小叮当 Tramp - 长云（流浪汉） New!!! U N/A - 暂无 V N/A - 暂无 W Winnie the Pooh - 小熊维尼 X N/A - 暂无 Y Yzma - 伊斯玛 Z Zazu - 沙祖 New!!! Zeus - 宙斯

学习中，等待高人回答

如果你在职业棒球联盟投球，你应该每局使两个击球员上垒。

pitch和campaign的区别是：1、pitch这个词来源于棒球运动，指的是头球手将球投掷到本垒以开始比赛的过程。这个词后来用到了商业。2、campaign是指广告主在一段明确的期间里(如一年)，推出一系列拥有共同主题或讯息的广告，以期建立广告讯息的累积效果，塑造品牌与企业一致的形象，并给予目标。

是助听器的定制机的3款机型

请在切换到目镜前选择对象(是不是object?)...

GitcoinGrants2.0将解决什么问题，近期对于web3还有虚拟币圈子中的信息都是非常的多的，不少人不知道Gitcoin是什么也不知道GitcoinGrants2.0将解决什么问题，下面跟着小编一起来看看吧。GitcoinGrants2.0将解决什么问题Gitcoin是一个由社区管理的开源项目资助平台，其使命是构建和资助数字公共产品，并于2021年5月发布了治理代币GTC，用于治理GitcoinGrants和GitcoinDAO。本文将主要介绍Gitcoin最有影响力的产品GitcoinGrants，也是Web3最大的公共物品募捐池。GitcoinGrants每季度运行一次，为使用Python、Rust、Ruby、JavaScript、Solidity、HTML、CSS、Design等开源软件构建的的公共物品提供寻求资金的平台和获得资金的机会，帮助公共物品与愿意资助该项目的人建立联系。除GitcoinGrants外，Gitcoin也还有很多值得探索的有趣的产品，包括支持Web3的社交网络集市TownSquare、托管在其Discord上的GitcoinChat、约每月举行一次的GitcoinHackathon、致谢勋章Kudos、开源协作赏金、Web3创业奖学金计划、开发人员匹配引擎、Web3知识游戏化问答平台GitcoinQuests，这些产品都可在Gitcoin网站上找到并使用。二次方融资Gitcoin的关键价值是「公平」和「可信中立」，为了在资金分配上更加的公平，Gitcoin采用二次方融资的方式，根据贡献者的数量从匹配池中将额外资金分配给最具影响力的项目，Gitcoin也是最早采用这种方式的平台之一，目前二次方融资已被推广应用于多个平台。在二次方融资的捐赠逻辑中贡献者的数量比资助的资金数量更重要。二次方融资简而言之就是项目最终获得的资金是贡献者捐献资金的「平方根之和的平方」，超过个人筹集者捐赠部分由Gitcoin奖池里的资金进行配捐。在二次方融资中一个贡献者捐赠了NDAI的配赠收益小于N个人每人捐赠1DAI，以此鼓励更多以小量资金捐赠的人参与，并且也提高了为配赠更多资金而作弊的成本。GitcoinGrants2.0在以往几轮的捐赠中，不少项目方把Gitcoin的捐赠者视为对社区有贡献的成员，并发放奖励空投，于是近几轮捐赠中这种「刷捐赠」的现象越来越频繁，也就是我们说的女巫攻击（SybilAttacks），指Sybil攻击者创建许多帐户，并使用它们绕过声誉和帐户系统规则以获得不成比例的奖励或空投。「女巫防御」已是Gitcoin的最大优先事项之一。据官网统计的数据，在GR14中，44886个贡献者中有16073个被检测为Sybil帐户。Gitcoin团队在对Sybil防御机制进行大量思考后构建了GitcoinGrants2.0。团队表示：「GitcoinGrants1.0是中心化的，远没有我们希望的那样可信中立。此外，由于Grants1.0的中心化性质，Gitcoin必须维护一个包含GitcoinGrants参与者的「个人身份信息」（PII）的赠款数据库。」这也是为什么GitcoinGrants必须进化的原因。Grants2.0将包括一个「生态系统」和一个「平台」。生态系统可视为一套开源资金和治理机制，平台由dApp、通用项目注册表前端GrantsHub、资助轮管理器RoundManager等组成，让任何社区都能启动和管理他们自己的自托管资助轮。GitcoinPassport是众多Grants2.0工具中的一个，可简化Gitcoin赠款的Sybil防御，GitcoinPassport是一种建立在Ceramic网络上的身份验证协议，在Grants2.0中它旨在主动验证参与资助轮次的人员的身份，以防止Sybil攻击，可实现欺诈识别、出处识别、保护隐私、可验证凭证。Passport的Beta版本已被用于第14轮资助（GR14）活动中，在GR14期间，近1.5万人设置了他们的GitcoinPassportID。

绿茶婊——GREEN TEA BITCH。特指那些装纯的婊子，总是长发飘飘、清汤寡面、貌似素面朝天但暗地里化了妆，特质是装出人畜无害、心碎了无痕、岁月静好的多病多灾模样，其实野心比谁都大。

bitch，口语里经常表示婊子，用来骂女人的

应该是手砂，赤耳,洗水,猫须，denim。

歌曲名:Carey歌手:Joni Mitchell专辑:Miles Of AislesJoni Mitchell - CareyThe wind is in from africaLast night i couldn"t sleepOh, you know it sure is hard to leave here careyBut it"s really not my homeMy fingernails are filthy, i got beach tar on my feetAnd i miss my clean white linen and my fancy french cologneOh carey get out your caneAnd i"ll put on some silverOh you"re a mean old daddy, but i like you fineCome on down to the mermaid cafe and i will buy you a bottle of wineAnd we"ll laugh and toast to nothing and smash our empty glasses downLet"s have a round for these freaks and these soldiersA round for these friends of mineLet"s have another round for the bright red devilWho keeps me in this tourist townCome on, carey, get out your caneI"ll put on some silverOh you"re a mean old daddy, but i like you~~~Maybe i"ll go to amsterdamOr maybe i"ll go to romeAnd rent me a grand piano and put some flowers "round my roomBut let"s not talk about fare-thee-welis nowThe night is a starry dome.And they"re playin" that scratchy rock and rollBeneath the matalla moonCome on, carey, get out your caneAnd i"ll put on some silverYou"re a mean old daddy, but i like youThe wind is in from africaLast night i couldn"t sleepOh, you know it sure is hard to leave hereBut, it"s really not my homeMaybe it"s been too long a timeSince i was scramblin" down in the streetNow they got me used to that clean white linenAnd that fancy french cologneOh carey, get out your caneI"ll put on my finest silverWe"ll go to the mermaid cafeHave fun tonightI said, oh, you"re a mean old daddy, but you"re out of sighthttp://music.baidu.com/song/2177318

歌曲名:Carey歌手:Joni Mitchell专辑:Dreamland - The Very Best OfJoni Mitchell - CareyThe wind is in from africaLast night i couldn"t sleepOh, you know it sure is hard to leave here careyBut it"s really not my homeMy fingernails are filthy, i got beach tar on my feetAnd i miss my clean white linen and my fancy french cologneOh carey get out your caneAnd i"ll put on some silverOh you"re a mean old daddy, but i like you fineCome on down to the mermaid cafe and i will buy you a bottle of wineAnd we"ll laugh and toast to nothing and smash our empty glasses downLet"s have a round for these freaks and these soldiersA round for these friends of mineLet"s have another round for the bright red devilWho keeps me in this tourist townCome on, carey, get out your caneI"ll put on some silverOh you"re a mean old daddy, but i like you~~~Maybe i"ll go to amsterdamOr maybe i"ll go to romeAnd rent me a grand piano and put some flowers "round my roomBut let"s not talk about fare-thee-welis nowThe night is a starry dome.And they"re playin" that scratchy rock and rollBeneath the matalla moonCome on, carey, get out your caneAnd i"ll put on some silverYou"re a mean old daddy, but i like youThe wind is in from africaLast night i couldn"t sleepOh, you know it sure is hard to leave hereBut, it"s really not my homeMaybe it"s been too long a timeSince i was scramblin" down in the streetNow they got me used to that clean white linenAnd that fancy french cologneOh carey, get out your caneI"ll put on my finest silverWe"ll go to the mermaid cafeHave fun tonightI said, oh, you"re a mean old daddy, but you"re out of sighthttp://music.baidu.com/song/2177248

壁炉 fireplace 厕所 toilet 地下室 basement 露台 terrace 花园 garden 阁楼 attic 车房 garage 餐厅 dining room 厨房 kitchen 酒窖 wine cellar 起居室 living room 卧室 bedroom 浴室 bathroom 书房 study room

Beyonce 的 Single Ladies有好多 哦哦哦哦哦哦 哦哦哦哦哦哦哦somebady fa ya 这种发音 有点像 Missy Elliot 的歌，算是女说唱了。

stitches这首歌的意义是：表达了创作者对于爱情的迷茫与困苦之情。《Stitches》这首歌有毒，因为他太好听又洗脑，当年一经推出便荣登UK单曲榜第二。听完歌曲后，特别洗脑，这是一首失恋也能听的歌，优美的曲调和朗朗上口的旋律，加上非常温暖的歌词，让整首歌非常受广东道网友的喜爱。歌词SHAWN MENDES LYRICS"Stitches"I thought that I"d been hurt beforeBut no one"s ever left me quite this soreYour words cut deeper than a knifeNow I need someone to breathe me back to lifeGot a feeling that I"m going underBut I know that I"ll make it out aliveIf I quit calling you my loverMove onYou watch me bleed until I can"t breatheShaking, falling onto my kneesAnd now that I"m without your kissesI"ll be needing stitchesTripping over myselfAching, begging you to come helpAnd now that I"m without your kissesI"ll be needing stitchesJust like a moth drawn to a flameOh, you lured me in, I couldn"t sense the painYour bitter heart cold to the touchNow I"m gonna reap what I sowI"m left seeing red on my ownGot a feeling that I"m going underBut I know that I"ll make it out aliveIf I quit calling you my loverMove onYou watch me bleed until I can"t breatheShaking, falling onto my kneesAnd now that I"m without your kissesI"ll be needing stitchesTripping over myself,Aching, begging you to come helpAnd now that I"m without your kissesI"ll be needing stitches[x3:]Needle and the thread,Gotta get you out of my headNeedle and the thread,Gonna wind up deadNeedle and the thread,Gotta get you out of my head, get you out of my headYou watch me bleed until I can"t breatheShaking, falling onto my knees (falling on my knees)And now that I"m without your kissesI"ll be needing stitches (and I"ll be needing stitches)Tripping over myself,Aching, begging you to come help (begging, "Baby, please.")And now that I"m without your kissesI"ll be needing stitches(And now that)I"m without your kissesI"ll be needing stitches(And now that)I"m without your kissesI"ll be needing stitches

确实不行，你要的应该是CD4+CD25+的细胞，如果都用FITC标记，那么CD4+CD25-的细胞也被选上了，同一个标记走的是同一个通道。

要用紫外光看如果对产品起疑，不放心的话，自己检测一下就好。最简单的方法就是晚上用紫外光照射一下，泛蓝就说明有荧光剂。紫外光可以用验钞笔发出的蓝色光就可以了，当然其它紫外检测灯也可以。

【答案】：E直接法是用特异荧光抗体直接滴加在标本上使之与抗原发生特异性结合的方法；间接法由针对抗原的第一抗体和用荧光标记针对第一抗体的第二抗体相继作用的方法；补体结合法是在抗原和抗体反应时加入豚鼠血清，用荧光标记的抗补体抗体示踪的方法；双标记法是用FITC和RB200标记不同的抗体，对同一标本作荧光染色，同时可见到橙红和黄绿两种荧光色彩的方法。

我还是觉得采用激光共聚焦的顺序扫描应该可以完全解决串色干扰的问题。至于颜色，可以自己调节。如果你的共聚焦显微镜的荧光染料库里没有你所用给的染料，简单的办法就是选择跟你的染料的最接近的染料，而不是随便就选择一个。如果共聚焦显微镜的配置有光谱拆分的话，就更不用担心干扰的问题，因为这个拆分可以把发射光谱非常接近的荧光也可以被清楚分离。如果还解决不了问题的话，可以(推荐使用）直接跟共聚焦的厂家的工程师联系（官网上肯定有联系方式的），他们会很乐意帮助你的饿，而且可以很快的解决问题。ps：你的共聚焦是什么牌子和型号的啊？

目的：测定肿瘤组织异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITCdextran)粘附水平是否可作为肿瘤血管密度的量化指标。方法：用endolgin疫苗免疫小鼠后，在同一只小鼠上同时建立小鼠Meth A纤维肉瘤模型和藻酸盐包被肿瘤细胞试验模型，2周后将FITCdextran注射入小鼠体内，然后手术完整摘取肿瘤组织和藻酸盐颗粒，取部分肿瘤组织进行免疫组化检测血管密度的同时，将其他组织和藻酸盐颗粒匀桨并离心，取上清检测荧光强度，分析二者之间是否存在直线相关关系。结果：免疫组化和肉眼观察显示2种测定方法均有明显的血管生成效应，用FITCdextran粘附测定肿瘤组织血管相对密度和藻酸盐包被试验均能较好地量化测定抗血管生成效果，直线相关分析表示二者的疫苗免疫实验组FITCdextran的测定值之间呈明显的正性相关关系（r = 0.962，P＜0.01）。结论：和藻酸盐包被试验相比，FITCdextran测定肿瘤组织血管相对密度是一种简单有效的量化测定肿瘤组织血管生成水平的方法。 【关键词】 肿瘤；血管；动物模型；藻酸盐包被肿瘤细胞试验 Quantitative determination of relative tumor vascularity by FITCdextran adsorption TAN Guanghong， HUANG Fengying， WANG Hua， et al. ( Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Medicine, Haian Medical College， Hainan， Haikou 571101, P.R. of China) 〔ABSTRACT〕 Objective: To evaluate whether determination of FITC-dextran adsorption in tumor tissues is suitable for quantitative evaluation of tumor angiogenesis. Methods: After induction of antiangiogenic immunity in mice using xenogenic endogin protein, Meth A fibrosarcoma tumor cells were incubated in the conventional method of setting tumor model. Alginateencapsulate tumor cell assay was performed on the same mouse at the same time, and no immune mice were used as control as well. 14 days later, alginate beads and the whole tumor tissue were removed surgically and quantified the uptake of FITCdextran, and partial tumor tissues were used for immunohistochemistry determination of the vessel density, using antibody reactive to CD31. In addition, linear correlation analysis was used to evaluate the relationship. Results: The antiangiogenic effects were significantly induced in the two models respectively, and linear correlation analysis of the uptake of FITCdextran showed significant positive correlations between the two vaccineimmunized treated groups in the two models (r=0.962, P＜0.01). Conclusion: Determination of relative tumor vascularity in the tumor tissue using FITCdextran adsorption can be used as an antiangiogenic model in vivo. 〔KEY WORDS〕 Tumor; Blood vessel, Animal model， Alginateencapsulate tumor cell assay 肿瘤的发生、发展和转移与血管生成（angiogenesis）密切相关。我们在研究实验中发现〔1，2〕，如果抗肿瘤血管生成的治疗方案确实有效，除了表现为肿瘤体积较小，生存时间延长外，在肿瘤的组织切片中也表现为血管密度明显减少。藻酸盐包被肿瘤细胞模型是目前定量测定肿瘤血管生成的标准方法〔3〕，它的主要原理是将异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITCdextran）注射进入体内后，葡聚糖就会粘附于内皮细胞表面、部分可能被内皮细胞吸收而滞留于血管腔中。通过测定藻酸盐颗粒中的葡聚糖的荧光强度并和标准曲线相比较，就可得到量化的结果。因此我们设想，如果肿瘤组织中血管密度相对较少，肿瘤组织的血管粘附、吸收和滞留葡聚糖的数量也应该相应减少，通过比较不同肿瘤组织吸收FITCdextran相对荧光强度，就能够量化了解不同肿瘤组织的血管密度。本研究将FITCdextran注射于活体荷瘤小鼠中，然后测定肿瘤组织FITCdextran水平并和藻酸盐包被模型相比较，了解二者之间是否存在相关关系。 1 材料与方法 1.1 实验材料 FITCdextran购自Sigma Chemical公司，藻酸钠(Alginic Acid，Sodium Salt)购自Sigma Chemical 公司，苯巴比妥钠购自上海新亚药业有限公司，RPMI1640培养基和胎牛血清(FCS)购自美国GibicoBRL公司。重组猪endoglin蛋白为作者构建表达并纯化〔1〕。6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自四川大学动物中心，小鼠Meth A 纤维肉癌（Meth A）细胞株由生物治疗国家重点实验室（四川大学）赠送。大鼠抗小鼠CD31(PECAM1)单克隆抗体购自BD Pharmingen公司，VECTASTAIN Elite ABC Kit 购自Vector Laboratories公司。荧光酶标仪Microplate Fluorescence Reader，FL600，为BioTek公司产品。 1.2 实验方法 1.2.1 免疫方法 将重组endoglin蛋白冻干粉剂于无菌条件下称量，溶于无菌的生理盐水(NS)中，与灭菌的氢氧化铝凝胶佐剂〔A〕(OH)3按4∶1(V/V)混匀（氢氧化铝终浓度约为2 mg/mL），室温下放置30～60 min。然后将实验小鼠随机分两组，每组各10只。实验组小鼠每只背部皮下注射上述混合好的endgolin蛋白疫苗每次10 μg(100 μL)。对照组每只小鼠注射NS:佐剂为4∶1的混合液100 μL。每组注射均为1周1次，共4次。 1.2.2 细胞培养 从液氮中取出冻存保种的Meth A细胞，迅速置于37 ℃水浴复温融化，在超净工作台内用培养基洗涤1次。然后用完全培养基于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。收集对数生长期细胞，1 500 rpm离心3 min，细胞沉淀用无抗生素无血清的培养基洗涤1次，计数细胞数量后用无抗生素无血清的培养基调整细胞浓度至1×107/mL。 1.2.3 藻酸盐包被模型的建立 按文献进行〔3〕，略加改进。无菌条件下，首先将藻酸钠溶于无菌生理盐水，终浓度为1.5% (W/V)；并将收集培养的肿瘤细胞重悬于1.5%藻酸钠溶液中，然后用1 mL加样枪将细胞和藻酸盐混合液缓慢滴入磁力搅拌的250 mM CaCl2溶液中，形成乳白色的小珠。实验前进行预实验，使每个小珠约含有2×105个细胞。继续静置于250 mM CaCl2中30 min即可使用。此后将第4次免疫7 d后的小鼠用苯巴比妥钠0.1 mL (100 mg/kg)腹腔注射麻醉。小鼠麻醉后置于解剖台上，切开背部皮肤，在切口左侧下方上下不同部位各植入1粒按上述方法制备好的藻酸盐小珠，缝合皮肤。14 d以后，从尾静脉注入100 μL(100 mg/kg) FITCdextran，30 min后断颈处死，取出藻酸盐小珠，常温下加入0.5 mL的生理盐水，混匀标本，放置1 h， 1 500 rpm离心5 min。取上清液200 μL用荧光酶标仪测定荧光强度，用不同浓度的FITCdextran制备标准曲线，得出每只小鼠的测定值。 1.2.4 小鼠肿瘤模型的建立 上述藻酸盐小珠植入小鼠体内后，同时将Meth A细胞接种到每只小鼠的右侧胁肋部皮下，每只接种2×106个细胞(0.2 mL)。14 d后断颈处死，在取出藻酸盐小珠的同时，用手术器械分离出完整的肿瘤组织，准确称重后剪碎肿瘤组织，按重量每克肿瘤组织加入生理盐水2 mL，磨碎成匀浆，在摇床上摇动1 h后1 500 rpm离心5 min，同样取上清200 μL测定荧光强度，对照相应标准曲线得出各个标本的测定值。 1.2.5 肿瘤组织血管免疫组化染色 参考文献〔1，2〕取各组新鲜肿瘤组织进行冰冻切片。抗CD31免疫组化方法按Vector Laboratories公司试剂盒操作说明书进行。肿瘤组织微血管定量也按相关文献报道方法进行〔1，2〕。 1.3 统计学分析 模型内肿瘤体积和荧光强度比较用Student"s T检验，模型间相关性用线性相关分析。 2 结果 2.1 肿瘤生长和免疫组化检测肿瘤血管密度 用重组猪的endoglin蛋白作为抗肿瘤血管生成疫苗具有明显的抑制肿瘤生长和抗血管生成的作用，疫苗免疫组肿瘤生长明显慢于非免疫对照组；疫苗免疫组和非免疫对照组肿瘤重量分别为(0.52±0.13) g和(2.37±0.31) g（P＜0.001），（图1 A）。14 d后处死小鼠，用抗CD31免疫组化染色肿瘤组织血管，和非免疫对照组相比（图1C），结果发现，疫苗免疫组肿瘤组织血管明显减少（图1D），疫苗免疫组和非免疫对照组肿瘤组织血管密度平均每高倍视野分别为(10.82±3.91)和(46.58±8.73)（P＜ 0.001）（图 1 B）。 注：A：肿瘤重量；B：微血管密度定量分析；C：疫苗免疫治疗组肿瘤组织免疫组化；D：非免疫对照组肿瘤组织免疫组化；Trea：疫苗免疫治疗组；Cont：非免疫对照组。 图1 Endoglin重组蛋白抑制肿瘤血管生成（略） 2.2 FITCdextran粘附测定肿瘤组织血管生成状况 肿瘤细胞接种14 d后处死小鼠，经尾静脉注射FITCdextran，取出肿瘤组织后测定相对的FITCdextran粘附数量，疫苗免疫组和非免疫对照组FITCdextran 的粘附量分别为(2.53±0.82) μg和(7.56±1.27) μg，统计分析表明两组间具有显著性差异（P＜0.001）（图2 A）。 2.3 藻酸盐包被实验测定肿瘤组织血管生成效应 当14 d后切开植入藻酸盐颗粒部位的皮肤后，肉眼就可看见疫苗免疫组（图 2 C）的藻酸盐颗粒表面几乎没有可见的血管，而非免疫对照组的藻酸盐颗粒（图 2 D）均见有明显的血管分布，疫苗免疫组FITCdextran 的粘附量也明显低于非免疫对照组，分别为(0.76±0.35) μg和(2.34±0.79) μg，统计分析表明两组间同样具有显著性差异（P＜0.001）（图2 B ）。 2.4 肿瘤组织FITCdextran粘附与藻酸盐包被实验测定相关性分析 将肿瘤组织与藻酸盐包被实验测定疫苗免疫实验组的FITCdextran粘附量数值进行相关性分析，将这两组数值代入直线相关公式求出相关系数r值，并进行假设检验，结果相关系数r=0.962，假设检验P＜0.001，表明二者之间呈明显的直线正相关（图3）。 注：A：肿瘤组织直接测定的FITCdextran量；B：藻酸盐包被肿瘤细胞试验测定的FITCdextran量；C：疫苗免疫治疗组藻酸盐小珠；D：非免疫对照组藻酸盐小珠；Trea：疫苗免疫治疗组；Cont：非免疫对照组。 图2 肿瘤组织直接测定FITCdextran和藻酸盐包被肿瘤细胞试验（略） 图3 肿瘤组织直接测定和藻酸盐包被肿瘤细胞试验测定的FITCdextran呈直线正相关（略） 3 讨论 Endoglin是一种细胞膜表面分子，主要表达于激活的内皮细胞表面；研究证实endoglin是肿瘤血管生成的一个新的标志〔4〕，用抗endoglin抗体在动物肿瘤模型中已取得了良好的抗血管和抑制肿瘤生长的效果〔5，6〕。本研究所应用的猪endoglin是我们从猪胚肝中克隆得到cDNA的基础上，将其构建于原核表达载体，然后诱导表达并经严格纯化得到的重组蛋白质。在以往的研究中，我们已经证实用这种重组蛋白作为小鼠endoglin的异种同源蛋白疫苗，免疫小鼠能诱导小鼠产生抗猪和鼠自身endoglin的抗体，并且在多个肿瘤模型中发现具有抗肿瘤血管生成从而明显抑制肿瘤生长的作用〔1，2〕。本研究用免疫组化和藻酸盐包被肿瘤细胞实验都发现用猪的endoglin 重组蛋白作为疫苗免疫小鼠后，确实具有抗小鼠Meth A纤维肉瘤血管生成的作用。 抗肿瘤血管生成研究是当今肿瘤研究中的一个热点，几乎每天都有新的研究成果发表于不同的学术刊物上，因此，一种简便有效而又能够定量的抗血管生成模型对肿瘤抗血管生成研究具有十分现实的意义。当前，研究中常用的抗肿瘤血管生成模型主要包括：角膜模型、鸡胚内囊膜模型和藻酸盐包被肿瘤细胞模型等，前者需要在小鼠的角膜上进行微创手术，一般实验者很难掌握，实验结果难以量化处理。而鸡胚内囊膜模型的操作也比较复杂，许多药物还不适合用于此模型，同样也难以进行量化处理。藻酸盐包被模型尽管能准确量化，并且能从外观上看出抗血管生成效果，但是需要进行麻醉和手术，在这个过程中实验小鼠很容易死亡。另外，藻酸盐浓度控制得不好或是操作过程中出错都可导致包被于藻酸盐中的肿瘤细胞死亡，影响实验结果。在本研究中，我们直接用接种2周的肿瘤组织为研究对象，因为任何有效的抗肿瘤血管生成的治疗都会抑制肿瘤血管生成，致使肿瘤生长减慢，除了表现为肿瘤体积减少和重量较轻以外，整个肿瘤组织血管密度和血管腔容积也应该相应减少。因此，当从外周把FITCdextran灌注进机体后，在相同重量的肿瘤组织中，血管密度和血管容积均减少的肿瘤组织粘附、吸收和滞留FITCdextran的量也应该相对减少，这样通过测定相同重量的不同肿瘤组织就可以量化比较出这些差异，本研究的实验结果完全支持这些观点。经相关分析，实验结果和现在文献常用的藻酸盐包被肿瘤细胞实验结果呈显著的直线正性相关关系。但是，由于直接测定肿瘤组织血管相对密度的操作方法就是常规的建立肿瘤模型的方法，具有过程简单，易于操作等优点。尽管目前文献尚未见有实际应用的报道，但是我们认为这一种直接测定肿瘤组织粘附FITCdextrane进而量化肿瘤血管相对密度的方法实用可行，具有推广应用的价值。【参考文献】 1 Tan GH, Wei YQ, Tian L, et al. Active immunotherapy of tumors with a recombinant xenogeneic endoglin as a model antigen 〔J〕. Eur J Immunol, 2004,34(7):20122021. 2 Tan GH, Tian L, Wei YQ, et al. Combination of lowdose cisplatin and recombinant xenogeneic endoglin as a vaccine induces synergistic antitumor activities〔J〕. Int J Cancer,2004,112(4):701706. 3 Hoffmann J, Schirner M, Menrad A, et al. A highly sensitive model for quantification of in vivo tumor angiogenesis induced by alginateencapsulated tumor cells 〔J〕. Cancer Res,1997,57(17):38473851. 4 Fonsatti E, Vecchio LD, Altomonte M, et al. Endoglin: an accessory component of the TGFβbinding receptorcomplex with diagnostic, prognostic, and bioimmunotherapeutic potential in human malignancies 〔J〕. J Cell Physiol,2001,188(1):17. 5 Seon BK, Matsuno F, Haruta Y, et al. Longlasting complete inhibition of human solid tumors in SCID mice by targeting endothelial cells of tumor vasculature with antihuman endoglin immunotoxin 〔J〕. Clin Cancer Res,1997，3(7): 10311044. 6 Matsuno F, Haruta Y, Kondo M, et al. Induction of lasting complete regression of preformed distinct solid tumors by targeting the tumor vasculature using two new antiendoglin monoclonal antibodies 〔J〕. Clin Cancer Res,1999,5(2):371382.

碳纳米管是很好的荧光淬灭剂。你实在想做，可以把碳纳米管羧基化，与氨基FITC共价连接。

当然不行了，必须是两种颜色的

　　可能出问题的地方很多：抗原（你的样品）、抗体、标记过程都可能出问题，你需要针对不同环节设置阳性对照一步一步检测。

这个是荧光激发块的技术参数，EX是激发光波长参数、DM分光波长参数 、 DA是发射光波长参数 。 对应FITC这种荧光染料EX465-495 DM505 DA515-555，配对应的激发块。

不宜溶于水，用DMSO

可以使用伤害升汞代理的786-058

目前荧光免疫产品中多数用的是荧光素还是荧光微球还是荧光染料抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法⑴荧光物质1）荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：⑴异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490--495nm，最大发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。⑵四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。⑶四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。⑵其他荧光物质1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。

鼠的某种蛋白质（比如某种细胞因子或者膜蛋白）对于羊来说是异物，所以当将鼠的这种蛋白质注入羊体内的时候羊就会产生针对该抗原的抗体，当然抗体可能有好几种，其中IgG是最主要的抗体，该抗体就称为羊抗鼠IgG抗体。羊抗兔IgG抗体同理。不过现在的技术发达了，为了大批量生产抗体，大多数都是通过单克隆技术完成的。PS：你的IGg的写法有误，应为IgG或者IgM。。。

不可以 也不需要同时看到 一般都是同一个视野分别照 然后merge到一起 不merge也可以 dapi染核只是标示细胞的作用

绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称gfp，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(ca2+)可产生交互作用。　　由水母aequoreavictoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(seapansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。　　在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reportergene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。 具体操作过程http://med.wanfangdata.com.cn/viewhtml/periodicalpaper_zxswx200901001.aspx

DAPI和FITC标记的荧光抗体可以同时在荧光显微镜下观察到DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。 CM-Dil是标记细胞膜的,而DAPI是标记细胞核的可以是活细胞,一人做兔子的膀胱肿瘤，他说在14天的时候很强，21天的时候比较弱，再长的时间就没有检测过。

这四个不是一码事，HRP和AP是酶，二抗上挂了酶，要给相应的底物才能显色，显色方式可以通过发荧光也可以不发荧光（例如给予ECL底物，其中的H2O2和鲁米诺在HRP的作用下，能在黑暗中发出荧光；也可以给予双氧水和DAB，反应产生棕色不溶于水的物质。

应该是可以的,据我了解假如你是眼睛观察的话,你可以配一个专用的荧光模块,有一种是同时接收两种波段的. 也就是说你眼睛可以同时看到DAPI和FITC,但是拍照的话就不行了,得像1楼说的那样,拍两张再合成起来. 一楼所说的激发光的问题,现在一般的汞灯都是通用的.

流式细胞仪得到的都是相对值。如果你的样本可以看到一个阳性和一个阴性群，那很容易分析，直接比较两个群的百分比就可以了。如果这个细胞样本只有一个群，比较不同样本，那需要得出这个FITC-A的几个参数来比较，可以使用的参数一般有Median Fluorescence Intensity或者Mean Fluorescence Intensity。比较不同组的这个参数进行分析

【答案】：C目前最常用间接免疫荧光法（IIF）作为总的ANA筛选试验。IIF检测在过去最常用小鼠肝切片作为抗原，目前最常用的是核质丰富的HEp2细胞作为抗原。培养HEp2细胞作为抗原固定于载玻片上，与受检血清反应，血清中ANA与核抗原结合，形成抗原抗体复合物，此时再加入FITC标记的抗人IgG，反应后，标记抗人IgG与抗原抗体复合物结合形成标记抗体-抗原抗体复合物，在荧光显微镜下可观察到抗原片上ANA荧光着染强度和免疫荧光图形。因此间接免疫荧光法是用荧光标记的抗核抗体进行检测。

做这个实验，有几个要求：第一，贴壁培养的细胞要处理的非常轻柔，不然会导致大量假阳性（Annexin V 阳性）。这个方法最好是由于悬浮培养的，比如淋巴细胞第二，从图上看，你的电压设置的过低，第一个图阴性无染色的细胞都被压倒一起，而不是位于左下象限的中间。另外，你的阳性对照的细胞，用的是已知确定凋亡死亡的细胞吗？PI的染色看起来很弱第三，Annexin V单染没有强阳性，而且这个细胞群都有右移，这个提示很可能是你处理细胞过头导致的假阳性。第四，你没有贴FSC-SSC的图。真有凋亡发生，那个图也会有变化的。第五，你的单染对照因为设置的电压过低，没有做对双色补偿，所以你这个实验数据时无效的。

Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Q2:(AnnexinV+FITC)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。资料扩展：细胞(英文名:cell)并没有统一的定义，比较普遍的提法是:细胞是生物体基本的结构和功能单位。已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，但病毒生命活动也必须在细胞中才能体现。一般来说，细菌等绝大部分微生物以及原生动物由一个细胞组成，即单细胞生物，高等植物与高等动物则是多细胞生物。细胞可分为原核细胞、真核细胞两类，但也有人提出应分为三类，即把原属于原核细胞的古核细胞独立出来作为与之并列的一类。研究细胞的学科称为细胞生物学。细胞体形极微，在显微镜下始能窥见，形状多种多样。主要由细胞核与细胞质构成，表面有细胞膜。高等植物细胞膜外有细胞壁，细胞质中常有质体，体内有叶绿体和液泡，还有线粒体。动物细胞无细胞壁，细胞质中常有中心体，而高等植物细胞中则无。

现在的机器都是自动调节，不过也要做好准备工作。我大致说一下原理。做补偿调节，需要以下的样本，无任何染色的样本，分别是FITC， PE， PerCP还有APC单染阳性的样本，所以你这里需要一共5个管子。在纯手工的年代，你需要画出这四个颜色两两配对的散点图，比如FITC-PE， FITC-PerCP， FITC-APC， PE-PerCP，PE-APC， PerCP-APC，这一共6个散点图。然后，先上未染色的样本，调节各个荧光通道的电压，是细胞都位于各个散点图的左下角。在记录前，把每个样本都先跑一边，目的是观察电压的设置是否正确。比如FITC和PE会有重叠，上FITC阳性管的时候，虽然其他通道会有些信号，但FITC通道的信号应该最强。如果发生了其他通道信号强于目的通道的情况，就要进一步调节电压，是目的通道的信号最强。这样把每一个单染的样本都过一遍，确保目的通道的信号最强。现在的仪器软件，不需要你自己画这些散点图，但是调剂电压的这一步是必须的，可以在阴性对照管的页面下完成。电压调节好以后，记录阴性对照和阳性单染样本的信号，然后机器会自动结算补偿值。如果你要手工计算，这里是原则：以FITC-PE为例。在散点图上，划分为四个象限。如果纵坐标是FITC， 横坐标是PE。调节电压后，阴性的细胞位于左下象限。这是可以得出阴性细胞横坐标（PE）和纵坐标（FITC）的平均荧光强度值。电压调好以后，上单色阳性样本。比如上牌FITC阳性，这时不要再改变电压了，而是调节补偿系数，最终目的就是让FITC阳性的细胞都位于向下象限，并且该细胞团的纵坐标（PE）荧光强度和阴性细胞团的值一致。其他颜色的两两补偿以此类推。都要计算各个象限的平均荧光强度。

与 FITC 的绿色荧光信号相比，EGFP 的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点。

这两者的设计是不同的，不能一起使用的。这个规格是不一样的。没有办法，一起放。

现在的机器都是自动调节，不过也要做好准备工作。我大致说一下原理。做补偿调节，需要以下的样本，无任何染色的样本，分别是FITC， PE， PerCP还有APC单染阳性的样本，所以你这里需要一共5个管子。在纯手工的年代，你需要画出这四个颜色两两配对的散点图，比如FITC-PE， FITC-PerCP， FITC-APC， PE-PerCP，PE-APC， PerCP-APC，这一共6个散点图。然后，先上未染色的样本，调节各个荧光通道的电压，是细胞都位于各个散点图的左下角。在记录前，把每个样本都先跑一边，目的是观察电压的设置是否正确。比如FITC和PE会有重叠，上FITC阳性管的时候，虽然其他通道会有些信号，但FITC通道的信号应该最强。如果发生了其他通道信号强于目的通道的情况，就要进一步调节电压，是目的通道的信号最强。这样把每一个单染的样本都过一遍，确保目的通道的信号最强。现在的仪器软件，不需要你自己画这些散点图，但是调剂电压的这一步是必须的，可以在阴性对照管的页面下完成。电压调节好以后，记录阴性对照和阳性单染样本的信号，然后机器会自动结算补偿值。如果你要手工计算，这里是原则：以FITC-PE为例。在散点图上，划分为四个象限。如果纵坐标是FITC， 横坐标是PE。调节电压后，阴性的细胞位于左下象限。这是可以得出阴性细胞横坐标（PE）和纵坐标（FITC）的平均荧光强度值。电压调好以后，上单色阳性样本。比如上牌FITC阳性，这时不要再改变电压了，而是调节补偿系数，最终目的就是让FITC阳性的细胞都位于向下象限，并且该细胞团的纵坐标（PE）荧光强度和阴性细胞团的值一致。其他颜色的两两补偿以此类推。

我在用，称量的时候别打喷嚏就可以，顺便问一句，FITC溶解性怎么样你知道吗，我的在水中溶解性不给力啊

cy3的fish探针是红。cy5的fish探针是白。fitc的fish探针是黄。fluos标记的fish探针是黑。扩展资料：荧光原位杂交技术的基本原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性—退火—复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

正确答案:C 解析：FITC异硫氰基能与抗体的氨基结合形成稳定化学键 。

荧光素本品诊断用药,种染料,角膜等皮能染色,能损伤角膜皮染绿色,显示角膜损伤、溃疡等病变.本品流经血管,能紫外线或蓝色光激发透较薄血管壁黏膜呈现绿色荧光,显示血管行经形态等,据供眼底血管造影循环间测定.本品几乎能透血脑屏障,结核性脑膜炎脑脊液内含量所增加,肌内注射测定脑脊液内本品含量助于结核性脑膜炎诊断鉴别诊断.供诊断眼角膜损伤、溃疡异物,眼底血管造影循环间测定.用于术显示胆囊胆管,及结核性脑膜炎辅助诊断等."滴8块钱!要交检查费!"医院价格规定.说比较贵,要身体健康,钱财乃身外物这样的提问是 没有意义的 还是自己做比较好 查阅下资料

现在的机器都是自动调节，不过也要做好准备工作。我大致说一下原理。做补偿调节，需要以下的样本，无任何染色的样本，分别是FITC，PE，PerCP还有APC单染阳性的样本，所以你这里需要一共5个管子。在纯手工的年代，你需要画出这四个颜色两两配对的散点图，比如FITC-PE，FITC-PerCP，FITC-APC，PE-PerCP，PE-APC，PerCP-APC，这一共6个散点图。然后，先上未染色的样本，调节各个荧光通道的电压，是细胞都位于各个散点图的左下角。在记录前，把每个样本都先跑一边，目的是观察电压的设置是否正确。比如FITC和PE会有重叠，上FITC阳性管的时候，虽然其他通道会有些信号，但FITC通道的信号应该最强。如果发生了其他通道信号强于目的通道的情况，就要进一步调节电压，是目的通道的信号最强。这样把每一个单染的样本都过一遍，确保目的通道的信号最强。现在的仪器软件，不需要你自己画这些散点图，但是调剂电压的这一步是必须的，可以在阴性对照管的页面下完成。电压调节好以后，记录阴性对照和阳性单染样本的信号，然后机器会自动结算补偿值。如果你要手工计算，这里是原则：以FITC-PE为例。在散点图上，划分为四个象限。如果纵坐标是FITC，横坐标是PE。调节电压后，阴性的细胞位于左下象限。这是可以得出阴性细胞横坐标（PE）和纵坐标（FITC）的平均荧光强度值。电压调好以后，上单色阳性样本。比如上牌FITC阳性，这时不要再改变电压了，而是调节补偿系数，最终目的就是让FITC阳性的细胞都位于向下象限，并且该细胞团的纵坐标（PE）荧光强度和阴性细胞团的值一致。其他颜色的两两补偿以此类推。

olympusix71绿色荧光的激发波长是460nm~550nm　　紫外:激发片波长330nm~400nm发射片波长:425nm　　紫:激发片波长395nm~415nm发射片波长:455nm　　蓝:激发片波长:420nm~485nm发射片波长:515nm　　绿:激发片波长:460nm~550nm发射片波长:590nm

他们没有异硫氰酸的后缀，不是异硫氰酸荧光素，是其他的荧光素衍生物。Fluorescein是一种化学物质，分子式C20H12O5；分子量332.306 g/mol；熔点314 - 316 °C；微溶于水。异硫氰酸是在其一个苯环上加-N=C=S基团的衍生物；Fluorescein-12-dUTP和Tetramethylrhodamine-5-dUTP是分别在12位、5位用dUTP取代的衍生物。Diethylaminocoumarin-5-dUTP是5位dUTP取代的二乙氨基香豆素，其为橙色针状结晶，熔点203~205℃，溶于甲醇、乙醇、乙二醇、苯乙醇，其溶液呈绿色荧光，是激光转化率较高、性能也比较稳定的激光染料，属绿光波段。荧光素的结构可以在维基中看到，在维基中输入fluorescein就可以找到。ITC可以表示异硫氰酸，IsoThioCyanate

fitc激发波长是460nm~550nm。发射波长：425nm。1、激发光谱可以分析在不同激发波长下，物质的特定波长荧光的强度变化。荧光激发光谱的形状与发射波长无关。2、发射光谱是固定激发波的波长，测定发射光强度与波长（有时候也测波数或者频率等）的关系，通俗而不太严谨地说，发射光谱测定的是发射光的颜色。激光波长的影响：对杂散光及信噪比的影响十分显著，当狭缝宽度不变时，用氩激光514.5nm比用488.0nm波长激发样品，杂散光要小一到二个数量级（±100cm-1范围内），并且分辨率有所提高。这一方面是由于长波长激光对仪器内少量灰尘或试样中缺陷的散射弱；另一方面由于狭缝宽度一样时，不同波长的光由出射狭缝出射时所包含的谱带宽度不一样。

fitc的最大吸收波长和最大发射波长分别如下：最大吸收光波长为490~495nm，最大发射光波长为520~530nm。1、激发光谱可以分析在不同激发波长下，物质的特定波长荧光的强度变化。荧光激发光谱的形状与发射波长无关。2、发射光谱是固定激发波的波长，测定发射光强度与波长（有时候也测波数或者频率等）的关系，通俗而不太严谨地说，发射光谱测定的是发射光的颜色。激光波长的影响：对杂散光及信噪比的影响十分显著，当狭缝宽度不变时，用氩激光514.5nm比用488.0nm波长激发样品，杂散光要小一到二个数量级（±100cm-1范围内），并且分辨率有所提高。这一方面是由于长波长激光对仪器内少量灰尘或试样中缺陷的散射弱；另一方面由于狭缝宽度一样时，不同波长的光由出射狭缝出射时所包含的谱带宽度不一样。其他荧光物质酶作用后产生荧光的物质：某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷，受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。镧系螯合物：某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。

综述：fitc的激发波长是460nm~550nm，发射光波长为520nm～530nm。发射（可见）光的物体叫做（可见）光源。太阳是人类最重要的光源。可见光源有热辐射高压光源（如白炽灯）、气体放电光源（如霓虹灯、荧光灯）等。光源有分自然光、人造光。有生命的一定是自然光，如水母、萤火虫等，没有生命的不一定是人造光，如恒星、太阳等。光波：光波，通常是指电磁波谱中的可见光。可见光通常是指频率范围在3.9×1014~7.5×1014Hz之间的电磁波，其真空中的波长约为400~760nm。光在真空中的传播速度为c=3×108m/s，是自然界中物质运动的最快速度。光波是横波，其中电场强度E和磁感应强度B（或磁场强度H）彼此相互垂直，并且都与传播方向垂直。

WB----蛋白质印迹FITC---异硫氰酸荧光素IHC-P----石蜡切片的免疫组化技术IHC---免疫组织化学

fitc医学上意思是异硫氰酸荧光素。异硫氰酸荧光橙红，异硫氰酸荧光黄，异硫氰酸荧光红，异硫氰酸荧光素异构体I，5-异硫氰酸荧光素。其形态为黄色粉末，有吸湿性，是一种生化试剂，也是医学诊断药物，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。并且它能与各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中仍有强烈绿色荧光，加酸后析出沉淀，荧光消失，微溶于丙酮、乙醚和石油醚。用途说明该品是生化试剂，也是医学诊断药物，主要用于荧光抗体技术中的荧光染料，能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光。用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。黄色粉末。有吸湿性。能与各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中仍有强烈绿色荧光，加酸后析出沉淀，荧光消失，微溶于丙酮、乙醚和石油醚。

5mmol#47。(3)抗原对照?参考见解。因未免疫动物的血清中无特异性抗体:标本直接滴加二抗:标本加同种动物的未免疫血清:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化，看是否非特异性染色，应呈阴性反应(1)你的二抗是用FITC标记的，目的是使DNA变性;2N盐酸需要使用，呈阴性反应，如果是用过氧化物酶做标记.0-9，为避免荧光分解，后者能使玻片透明，分装及荧光显微镜观察时均要避光，在加抗免疫球蛋白荧光抗体;L pH9，这个对照必须有。做间接法免疫荧光染色，目的是看自发荧光，以PBS冲洗后，如何设置对照.5的碳酸氢盐缓冲液;(3)关于免疫酶染色。(2)阴性对照，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶。(1)空白对照，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合;(2)封片最好用甘油加0

流式细胞仪的数据取决于在记录的时候设置了多少个信道。在显示散点图的时候，不管有多少个信道，一次只能是最多两种信号。至于横坐标是什么，纵坐标是什么，完全是根据想要看的指标和个人习惯，没有什么限制。是是否是FITC或者PE无关。

将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%,分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用。

EGFP为增强型绿色荧光蛋白，往往作为报告基因/蛋白，或者是细胞示踪用。FITC为荧光素在荧光激发和发射中，FITC和EGFP在很接近的范围之内，在流式细胞仪上和荧光显微镜下都使用同一个通道。樊克生物细胞凋亡试剂盒

你说的是用来标记抗体的FITC和Alexa 488的区别吧。488只是激发光（蓝色激光）的波长。FITC和Alexa 488都能在488 这个波长被激发而发出绿色激发光。Alexa488的优点是光线强度大，光褪色少，pH耐受性好

问题在于称量,对不? 那么,建议配置高浓度该溶液,比方说1M浓度,这样称量问题就解决了,之后再取5ul稀释到5ml. 或者如果溶解度有限,可以配置1L该溶液,取你需要的体积用 可能会造成浪费,如果您的药品极贵,那么可以配置高浓度,取出需要用的量后抽干再收集干粉.

FITC 标记抗体-Chadwick氏法试剂：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、pH8.0的0.01mol/L PBS、1%硫柳汞；材料：离心机及离心管、三角烧瓶（25ml）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、透析袋、玻璃棒、棉线及烧杯（500ml）等；方法与步骤：1.

FITC（异硫氰酸荧光素）FITC 保存于4℃暗处,使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取,以避免潮解。所以95度高温单论保存条件的话肯定会有影响

5mmol#47。(3)抗原对照?参考见解。因未免疫动物的血清中无特异性抗体:标本直接滴加二抗:标本加同种动物的未免疫血清:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化，看是否非特异性染色，应呈阴性反应(1)你的二抗是用FITC标记的，目的是使DNA变性;2N盐酸需要使用，呈阴性反应，如果是用过氧化物酶做标记.0-9，为避免荧光分解，后者能使玻片透明，分装及荧光显微镜观察时均要避光，在加抗免疫球蛋白荧光抗体;L pH9，这个对照必须有。做间接法免疫荧光染色，目的是看自发荧光，以PBS冲洗后，如何设置对照.5的碳酸氢盐缓冲液;(3)关于免疫酶染色。(2)阴性对照，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶。(1)空白对照，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合;(2)封片最好用甘油加0

在流式细胞术上机分析中，FITC是一种常用的荧光染料之一。如果你在流式上机界面找不到FITC，可能有以下几个原因：实验部门或相关人员没有将该荧光染料添加到实验方案中，因此在流式上机界面中找不到。FITC已经被更改名称或缩写，可能使用的是类似的替代染料名称或缩写。该设备不支持检测FITC染料，因此在流式上机界面中无法找到相关设置选项。如果你需要使用FITC染料进行流式细胞术上机分析，建议你先咨询实验室相关人员或设备供应商，确认是否支持该染料，并了解如何正确设置流式上机界面以检测该染料。

不可以。它的主要原理是利用FITC(异硫氰酸荧光素)上的N=C=S基团和蛋白质上游离的-NH2发生化学反应，而后在特定波长光源的激发下即可观测到荧光信号。