isa

临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于elisa试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性

该法由种类和变化可分为以下几种：（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA

抗原与抗体的特异性反应

1、ELISA是酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的简称。它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 2、原理如下： （1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 （2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

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　　酶联免疫吸附剂测定　　enzyme linked immunosorbent assay，ELISA。指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。　　基本原理　　1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。　　方法类型和操作步骤　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。　　（一）双抗体夹心法　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：　　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。　　（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。　　（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。　　（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。　　（二）双位点一步法　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。　　在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。　　（三）间接法测抗体　　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：　　（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。　　（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。　　（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。　　（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。　　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。　　（四）竞争法　　竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：　　（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。　　（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。　　（五）捕获法测IgM抗体　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：　　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。　　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。　　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。　　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。　　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。　　（六）应用亲和素和生物素的ELISA　　亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。　　亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。　　ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.

ELISA的英文全称是enzyme-linked immunosorbent assays 即酶联免疫吸附测定。顾名思义，该方法涉及到用酶标记（联接）抗体或抗原和免疫吸附（一般指抗原抗体的反应）过程。该方法可以广泛地用于测定各种生物分子。

　　常见的ELISA试剂盒都有:一、食品安全检验ELISA试剂盒是指食品中的激素、药物、霉菌毒素、过敏原残留、转基因产品的检测试剂盒，以及微生物、维生素等的检测产品。包括植物病毒、细菌、真菌、植物激素和转基因作物的农业诊断试剂盒，以及动植物疾病诊断类如猪、牛、羊、马等家畜和禽类以及宠物类检测试剂盒。二、生物原装ELISA试剂盒以及各类国产ELISA试剂盒1、细胞因子检测试剂盒：如白介素、选择素、集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素，转化生长因子，趋化因子，细胞因子受体，粘附分子，生长因子，凋亡因子等等2、心肌梗塞检测ELISA试剂盒如肌钙蛋白，肌红蛋白，C-反应蛋白等等3、内分泌检测ELISA试剂盒如甲状腺，胰腺，性激素，孕酮，睾酮，生长激素，生长抑素，内皮素，皮质醇，骨钙素，催乳素，促肾上腺皮质激素，促卵泡素，雌二醇，雌三醇，5-羟色胺，17-羟孕酮等等4、肝纤维化检测ELISA试剂盒如纤维连接蛋白，透明质酸，胶原，基质金属蛋白酶抑制因子，基质金属蛋白酶，层粘蛋白等等5、自身免疫检测ELISA试剂盒如甲状腺，盐水可提取核抗原抗体(ENA)，抗核抗体，DNA，抗心磷脂抗体，类风湿因子，循环免疫复合物，抗胰岛细胞抗体，胰蛋白酶原，Sm，大疱性类疱疮，蛋白酶，短膜虫法，肝-肾，肝-肾-胃，肌内膜抗体，角蛋白抗体，抗核抗体，抗核糖体蛋白抗体，抗聚角蛋白微丝蛋白抗体，抗链O，抗卵巢抗体，抗平滑肌抗体，抗线粒体抗体，等等7、优生优育检测ELISA试剂盒如早早孕，新生儿TSH，胎膜早破检测，抗子宫内膜抗体，抗心磷脂抗体，抗透明带抗体，抗卵细胞透明带抗体，抗卵巢抗体，抗精子抗体，巨细胞病毒，弓形体，风疹病毒，分娩预测，单核白细胞增多症，单纯疱疹病毒，促卵泡素，促黄体生成素，便隐血试纸，HCG等等8、传染病检测ELISA试剂盒如幽门螺杆菌，乙脑，乙肝，丙肝，丁肝，戊肝，庚肝，衣原体，性病，腺病毒，微小病毒B19，天疱疮，水痘-带状疱疹病毒，生殖支原体，伤寒，沙眼，腮腺炎，人型支原体，麻疹，轮状病毒，流行性出血热，淋球菌，莱姆病，柯萨奇，抗解尿支原体，军团菌，结核，胶原，尖锐湿疣，甲肝，脊髓灰质炎，急性胰腺炎尿胰蛋白酶，霍乱，呼吸道合胞病毒，肝吸虫，副流感，肺炎，带状疱疹，传染性单核细胞增多症，层粘蛋白，布鲁氏杆菌，百日咳，白喉，艾柯病毒，EB 病毒，A族链球菌等等9、特种蛋白检测ELISA试剂盒如免疫球蛋白，抗链O-aso，类风湿因子RF，C反应蛋白，微量白蛋白，β-2微球蛋白human，铁蛋白，转铁蛋白transferrin等等10、肿瘤标志物检测ELISA试剂盒如肿瘤标志物，组织多肽抗原，肿瘤相关因子，胰腺癌，直肠癌，细胞角蛋白片段，胃肠癌，铁蛋白，糖链抗原，神经特异性稀醇化酶，上皮膜抗原，乳腺癌，人抗小鼠抗体，前列腺，甲胎蛋白，肝癌，大肠癌，肺癌，大小便隐血检测，癌胚抗原，β-2微球蛋白等等

enzyme linked immunosorbent assay,ELISA.指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反应的定性和定量方法.这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性.在测定时,把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例.加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析.由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度. 聚合酶链式反应,简称PCR.聚合酶链式反应,其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点.它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术.

1、包被的浓度：高浓度或低浓度会产生不一样的结果； 2、封闭：封闭的好与不好决定显色后底色会不会有，或者有多少； 3、孵育时间和温度：不同的孵育时间和温度出现的结果也会不同； 4、显色时间和温度：不同的显色时间和温度会造成不一样的结果； 5、整个缓冲液体系的配方：有的缓冲液能起到减少底色的作用。

临床上疾病的辅助诊断手段采用ELISA方法：HBsAg HBeAg HBcAb-IgG HBcAg-IgM HBeAb HBsAb AFP、hCG

　　在国内生物研究蓬勃发展的现在，假冒无视科学研究的严谨性和严肃性，让广大的科研工作者被动造假，严重破坏了科研氛围，扰乱了市场秩序，联科生物整理了一些鉴别这些假冒伪劣ELISA试剂盒的方法，供广大的科研工作者和用户参考，让希望对广大科研工作者有所帮助。　　购买前　　【方法一】向厂家索要或从其网站下载说明书，查找ELISA的性能指标：准确度(加标回收率、稀释线性)、精密度(板内差、板间差)、灵敏度、样本值、特异性、校准。一般来说，除了校准不一定每份说明书都有外，其余的指标一般都需要罗列(部分样本需要高倍稀释的，可能没有准确度这个指标)。如果无法提供这些性能指标，则说明该试剂盒可能是假货，或者试剂盒开发过程不够科学严谨，有可能无法检测出真实的样本值。　　【方法二】对于夸大ELISA涵盖的指标的范围，尤其是不常见的种属，可先去国际知名ELISA试剂盒供应商(如eBioscience、R&D)网站上搜索，如果搜索不到该种属的ELISA试剂盒，则有可能是假货，需要小心谨慎。　　【方法三】将“厂家名”、“ELISA”和“假货”等关键词在网上搜索，有的网站或论坛如丁香园等会有打假曝光台。　　购买后　　【方法一】检查说明书、包装盒的质量，通常假冒伪劣产品为了降低成本，印刷的质量会比较差。其次仔细阅读说明书，如上所示查找ELISA的性能指标。　　【方法二】　　Ⅰ.利用干扰实验即可鉴别ELISA试剂盒是否检测目的抗原，方法如下：　　(1)将针对试剂盒特异性的重组蛋白抗原和试剂盒中的检测抗体配置成antibody:antigen=1:2的混合孵育液　　(2)37℃孵育15分钟后，代替原试剂盒中的检测抗体　　(3)后续操作按照试剂盒说明书进行，加检测抗体、酶复合物和底物　　(4)实验完毕后，检测其标准曲线，如果标准曲线良好则说明加入的目的抗原和试剂盒抗体不匹配，试剂盒检测抗体针对的是非目的抗原，该试剂盒为伪劣假造ELISA试剂盒。　　(5)如果标准曲线无线性，则说明试剂盒检测抗体已被目的抗原中和或干扰，影响了其实际试剂盒抗体的检测作用，则该试剂盒检测抗体针对的是目的抗原。　　Ⅱ.如果购买了两盒同一公司的ELISA试剂盒A和B，利用交叉实验即可鉴别ELISA试剂盒是否造假，方法如下：　　(1)取出购买的试剂盒A的包被板两条。　　(2)一条包被板加试剂盒A的标准品做标准曲线。　　(3)另一条包被板加试剂盒B的标准品做标准曲线。　　(4)后续操作按照试剂盒说明书进行，加检测抗体、酶复合物和底物。　　(5)实验完毕后，检测两条标准曲线，如果两条标准曲线一致则说明两个ELISA试剂盒检测的同一个指标而非A和B，即该试剂盒为伪劣假造ELISA试剂盒。　　(6)如果两条标准曲线不一致则说明两个ELISA试剂盒检测的不同指标，试剂盒A只能检测A，不能检测B，即该试剂盒为正常的ELISA试剂盒。

Elisa Kit使用方法（以人IL-4 ELISA KIT为例）：检测原理:本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可 通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。试剂盒组成：1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6）2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支）3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml）4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支）5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支）7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）8．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml）9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）11．封板胶纸（6/3 张）12．产品说明书（1 份）标本收集:1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。注意事项:1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻 融。5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试 验结果。9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。 检测前准备工作:1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。3. 标准品: 加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。复溶标准品原液（1000 pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的标准品请废弃。4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化 抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓 缩酶结合物(1:30) 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足， 可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号） 洗涤方法:1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔15－30秒。洗板5次。2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。操作步骤:1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。4．洗板5次。5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。7．洗板5次。8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。10．洗板5次。11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。结果判断:1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。灵敏度、特异性和重复性:● 灵敏度：最小可测人IL-4达7pg/ml。● 特异性：不与IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反应。● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。IL-4简介：IL-4是一种由活化的T细胞产生的细胞因子，以往称为B细胞生长因子1。在B细胞生长的早期活化B细胞，并使被抗原、抗IgM或脂多糖活化的B细胞进入细胞周期G1期。IL-4增强MHCII类抗原的表达和CD23（FceRII）在B细胞上的表达，诱导同种型（isotype）转换，如促使小鼠B细胞从分泌IgM、IgG3、 IgG2b转变成分泌IgG1、IgG2a、IgA和IgE。也增强单个核吞噬细胞表达MHCII类抗原，但对炎症性细胞因子（如IL-1,TNF,IL-8）的释放和这些细胞的杀菌活性有抑制作用。IL-4 也活化细胞毒性 T细胞，它被认为是典型的由TH2细胞产生的细胞因子，对于T,B淋巴细胞的发育以及驱动体液免疫反应和抗体产生都是十分重要的。

临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下。 一.临床标本的收集和保存 用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面： （1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 （2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 （3）血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。 （4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 （5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 二、试剂准备 在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。 三、加血清样本及反应试剂 在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。 四、温育 温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。 温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点： （1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间，在做HBsAg测定的室内质控中，测定由卫生部临床检验中心供应的1 ng/ml弱阳性样本时，总是测不出来，不知原因为何？这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证37℃下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。 （2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如2～8℃下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。 （3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。 总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。 五、洗板 固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。 在临床实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，使用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。在特定临床实验室所使用的洗板机，到底洗多少次能达到要求，可进行下面这个简单的实验：选择4×8 HBsAgELISA包被板条，每2×8孔分别加入相同一份弱阳性和一份阴性样本，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育后，洗板孔时按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物显色测定，如洗3次后，显色不再改变，即洗3次的板孔比色测定与4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，阳性/阴性值保持最大不变，则可以认定该实验室所用洗板机3次洗板即可达到要求。 六、显色 在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15～30分钟。从理论上说，37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。 此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。以OPD为底物，配好后应为无色，否则就不能使用。以TMB为底物，整个显色反应过程无需避光，而以OPD为底物，则需避光进行。关于TMB和OPD的显色反应特点及注意点可参考前面有关章节内容。显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。 七、比色 ELISA的比色测定由酶标仪进行，有的同行可能会认为，既然由酶标仪进行，那么此时便可以万事大吉了，其实不然，因为当代较为先进的酶标仪器仪表，均有较多的功能，使用不当，会得到令人难以理解的结果。如使用酶标仪比色测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等等。这主要是没有正确地理解和使用酶标仪所致。至于如何正确理解和使用酶标仪详见后面有关章节。此处，只是强调下面两点： （1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。由于有的临床实验室在进行ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。 （2）单波长或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不必设空白孔。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。 八、结果判定 临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。目前国内在临床上应用的ELISA试剂盒绝大部份是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部份用于αFP、hCG、细胞因子等的定量测定。ELISA定性测定的“阳性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值（Cut-off）。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线（又称标准曲线）。有关ELISA定性和定量测定结果的数据处理后面将有专门章节讨论。本处只想强调的一点是，ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”结果的判定依据只能是试剂盒本身所确定的Cut-off值，而不能以卫生部临床检验中心供应弱阳性定值质控血清。为什么要强调这一点呢？主要是因为以前有很多基层实验室均使用部中心供应的弱阳性定值质控血清（以前也称“临界值”血清）的测定吸光度来判定结果，高于其判为阳性，反之为阴性，而不管试剂盒Cut-off值为何。到目前为止，仍有一些实验室在坚持这种错误的做法。试剂盒的Cut-off值的设立是建立在一系列科学试验及统计学研究的基础上的（详见后述），而部中心供应的弱阳性定值质控血清主要是供临床实验室进行室内质控时使用。 下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写。 （1）S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。 （2）S/N或P/N：其中S同（1），N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或P/N≥2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut-off值而已。 九、结果报告及解释 临床ELISA测定结果的报告较为简单。定性测定报阴性或阳性即可；定量测定则报出具体的数值。结果解释比较起来要复杂的多，它要求实验室技术人员对所测定的项目有较为全面的知识基础。例如，对乙肝“两对半”结果的解释，不但要求检验者要知道不同的结果模式的临床意义，而且必须对乙肝病毒的分子生物学、分子的变异及其对表型的影响有更深层次的了解。现在，检验不再是单纯的实验室测定，而已成为一门临床医学学科，即检验医学，这就要求从事医学检验工作的检验医师，对所做的测定项目除了知其然，还要知其所以然，否则就难免为时代所淘汰。 综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因问 题可能的原因（非试剂盒本身的原因）1．弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题2．测定的重复性差（相同样本两次测定结果不一致）这是典型的由测定操作引起的问题，包括（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；（2）加样过快，孔间发生污染；（3）加错样本；（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；（5）不同批号试剂盒中组分混用；（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；（7）孔内污染杂物；（8）酶标仪滤光片不正确；（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。3．白板（阳性对照不显色）（1）漏加酶结合物；（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。（3）漏加显色剂A或B；（4）终止剂当显色剂使用。4．全部板孔均有显色（1）洗板不干净；（2）显色液变质；（3）加底物的吸光受酶污染；（4）洗板液受酶等污染。摘自《检验诊断与实验室自动化》2004年第4期

1、类型夹心法常用于检测大分子抗原，将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体，重复两次，洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。间接法常用于检测抗体，将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原，重复两次。洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器测定塑胶盘中的吸光值，以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体；加入待测检体、带有酶的抗原，与塑胶孔盘上的抗体专一性键结。塑胶孔盘上固著抗体数量有限，检体中抗原量越多，带有酶的抗原可键结固著抗体就越少。2、原理在测定时把受检标本和酶标抗原或抗体，按不同步骤与固相载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。扩展资料：Elisa应用Elisa生物试验敏感性高，特异性强，重复性好。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒适用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM抗体ELISA检测。参考资料来源：百度百科-ELISA

　　1.储存。　　收到试剂盒后应尽快放入冷藏室内保存，保存温度为4℃-8℃。　　2.回温。　　试剂盒在使用前应于室温（22-27℃）下充分回温，回温时间为40-60分钟。回温过程中勿将酶标板的包装袋开封，回温结束后再将其从包装袋中取出使用。　　3.样品稀释。　　样品稀释应严格按照说明书要求的稀释倍数进行稀释。如稀释倍数过大，可采用多步法进行样品稀释。例如：试剂盒要求样品需进行500倍稀释，可吸取5μl样品加入245μl样品稀释液中，充分混匀后，再吸取10μl混合液加入90μl样品稀释液中即可。　　4.加样。　　稀释好的样品在加入酶标板进行孵育的过程中，尽可能缩短第一次加样和最后一次加样的时间间隔，样品加好后马上开始计时。　　5.洗板。　　样品孵育时间结束后，马上甩去孔内液体。如多块酶标板需同时洗涤，可先将板内液体甩去，倒扣于吸水纸上，再依次进行洗涤。使用洗板机洗涤时，建议洗涤次数增加一次。未用完的洗涤液可在4℃-8℃下密封保存1月。　　6.显色。　　底物药片可在显色前3-5分钟加入底物缓冲液中，混合直到完全溶解。本试剂最好是现用现配，未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周。　　7.终止及读数。　　提前打开酶标仪，加入终止液后立即读数。　　8.同批号试剂盒中的试剂，除酶标二抗及阳性对照外，其余均可通用。　　9.移液器的正确使用、保存、清洁、校对。　　10.实验室管理　　桌面保持整洁，插枪头戴手套等。

ELISA试验要求一般可以看产品的说明书，说明书上一般都会介绍的比较详细。你可以看看人IL-1β ELISA试剂盒的介绍（pdf文件：www.neobioscience.net/Uploads/pdf/EHC002b.pdf）；如果像这种里面没有介绍全面的话，自己可以咨询购买ELISA试剂盒的厂家，基本上厂家都是有技术支持的。

主要就是抗原抗体的特异性反应。具体三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。ELISA，即酶联免疫吸附实验，其基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速，定性或者定量甚至定位的特点。

这个

不

是日本歌手名字。LISA（1989年4月14日－）是神奈川县出身的女性歌手。Elite Model Management所属。2007年7月自“elite MODEL LOOK 2007”应募者3000人入选10人之一。在视听的审查员询问到关于模特的工作时回答“我并不想成为模特，而是歌手”，让她试唱后就决定一个月后出道。在LIVE中自称为“博士”。2010年4月29日举行的ELISA第三次LIVE“Rouge Adolescence”中，本人首次作词作曲的歌曲《真実の证》披露（其后收录于第三张专辑Lasei中）。于2008~2011年连续四届参演动画界最大规模的演唱会Animelo Summer Live。于2008~2011年连续四届参演动画界最大规模的演唱会Animelo Summer Live：《Animelo Summer Live 2008 -challange-》演唱曲目《euphoric field》《HIKARI》《Animelo Summer Live 2009 u2212RE:BRIDGE-》演唱曲目《Wonder Wind》《ebullient future》《Animelo Summer Live 2010 -evolution-》演唱曲目《Dear My Friend》《Real Force》《Animelo Summer Live 2011 -rainbow-》演唱曲目《God only knows》《集积回路の梦旅人》

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。ELISA实验步骤及注意事项:1、固相载体选择聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。2、包被①板孔的选择：ELISA级别的微孔板。②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度。③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。3、封闭①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。4、加样及孵育①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。5、显色和终止①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。②显色底物需现配现用，避免污染。③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。

1、ELISA是酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的简称。它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 2、原理如下： （1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 （2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA可以用来检测血清样本，看有还是没有某个抗原或抗体，也可以看该抗原或抗体是多还是少，可以比较不同血清样本之间该抗原/抗体的含量高低。如果该抗原是一个病原，或该抗体是一个对某病原具有特异性的抗体，则ELISA检测该抗原或该抗体的结果，可以用来帮助判断，提供血清的个体，是否感染或曾经感染过这个病原。

ELISA酶联免疫吸附实验1.原理：免疫分析是一种利用特定抗体与抗原或半抗原发生的高选择性高特异性识别和结合原理，对待测抗体或者抗原进行分析测定的方法，酶联免疫吸附分析（下称ELISA）是免疫分析的一种，分三个部分组成：免疫识别，信号输出和数据处理。2.步骤：免疫识别是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗体，而后利用抗体识别待测的抗原（通常是疾病的蛋白质生物标记物，病毒，细菌等等，从复杂待测液中将抗原吸附到96孔板表面。接着用带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、荧光或放射性标记的抗体通过直接或者间接的方式输出识别信号。最后利用信号强度，标准样品浓度梯度等信息计算得出待测样中目标抗原的浓度。3.分类：根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等等。其中双抗体夹心法在商业应用上最常见。双抗体夹心法：①：抗体包被 在96孔板上包被抗体。由于酶标板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面。然后，将未吸附的抗体用缓冲液清洗后，加入含有明胶或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分。加入封闭液的目的，是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行。②：免疫识别 在96孔板上包被抗体后，加入待测样，并在37°C环境下孵育一段时间，通常是1-2小时。此时酶标板上的抗体与待测抗原进行特异性识别结合。此处抗体的质量是关键，好的抗体既能特异性高效地结合抗原又不受待测样中其他生物大分子、蛋白质和无机盐等成分的影响。③：洗板 将未结合的抗原洗掉，加入该抗原所对应的识别抗体并在37°C下继续培养1-2小时，接着将未连接上抗原的抗体洗掉。④：酶标信号输出 加入带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的酶标二抗，用于和标准抗体结合。在培养30分钟后洗掉未连接的二抗，并加入显色剂显色。根据显色的结果判断抗原的浓度。一般认为，抗原浓度与显色后的发光强度呈正相关。免疫竞争法以抗原竞争抗体为例，在上述免疫夹心法操作步骤的第二步加入待测抗原后，立刻加入酶标抗原，使之与待测抗原竞争识别酶标板上的抗体。当待测抗原浓度越高，能够连上酶标板上抗体的酶标抗体就越少，输出的信号就越少。这样待测样浓度与酶显色信号就呈逆相关。

ELISA，即酶联免疫吸附实验，其基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速、定性或者定量甚至定位的特点。ELISA可用于测定抗原，也可以测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①、固相的抗原或抗体；②、酶标记的抗原或抗体；③、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检验方法。

ELISA即酶联免疫吸附测定，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可用于疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。扩展资料 ：ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数值，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。ELISA也可应用于病毒抗体检测：流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等，其敏感性都超过目前常用的检测方法。此外，还可用于鉴定病毒型别，例如疱疹病毒。参考资料：百度百科-ELISA

elisa[英][u026a"lau026azu0259][美][u026a"lau026azu0259]abbr.enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定法; 以上结果来自金山词霸网络释义百科释义1. 酶联免疫法2. 酶联免疫吸附试验收起例句:1.Rapid tests are the speedy alternative to the eia and elisa tests-and they"rejust as accurate. 快速检测快速检测是一种相对于eia检测和elisa检测来说更快捷的检测方式，它们准确性是相同的。article.yeeyan.org2.Elisa for detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. 口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒。putus.org.cn3.Mouse dehydroepiandrosterone, dhea elisa kit. 小鼠脱氢表雄酮试剂盒。www.gbdelisa.com4.Swine fever antigen elisa diagnostic kit. 猪瘟抗原酶免疫测定试剂盒。www.lookchem.cn5.Clinic meaning of detecting pneumonic mycoplasma and igm with themethods of elisa. 酶联免疫吸附法检测肺炎支原体igm抗体及临床意义。

人名 译文：艾丽斯

UEFI mode改成Legacy

Disabled (禁用)Enabled (开启)你可以理解为关闭和打开的意思，就是你对你选择的项目是否生效的一种执行询问。

virtual instrument software architecture（虚拟仪器软件架构）

需要win7 sp1才可使用。

在LabVIEW中使用VISAVISA是仪器编程的标准I/O API。 VISA的多种用途 VISA可控制GPIB、串口、USB、以太网、PXI或VXI仪器，并根据使用仪器的类型调用相应的驱动程序，用户无需学习各种仪器的通信协议。VISA独立于操作系统、总线和编程环境。换言之，无论使用何种设备、操作系统和编程语言，均使用相同的API。 开始使用VISA之前，应确保选择合适的仪器控制方法。 GPIB、串口、USB、以太网和某些VXI仪器使用基于消息的通信方式。对基于消息的仪器进行编程，使用的是高层的ASCII字符串。仪器使用本地处理器解析命令字符串，设置合适的寄存器位，进行用户期望的操作。SCPI（可编程仪器标准命令）是用于仪器编程的ASCII命令字符串的标准。相似的仪器通常使用相似的命令。用户只需学习一组命令，而无需学习各个仪器生产厂商各种仪器的不同命令消息。最常用的基于消息的函数是：VISA读取、VISA写入、VISA置触发有效、VISA清空和VISA读取STB。 PXI和许多VXI仪器使用基于寄存器的通信方式。对基于寄存器的仪器进行编程，使用的是将直接写入仪器控制寄存器的底层二进制信息。该通信方式的优点是速度快，因为仪器不需解析命令字符串，并将信息转换为寄存器层次的程序。基于寄存器的仪器实际上是在直接硬件操作层上进行通信。最常用的基于寄存器的函数是：VISA输入、VISA输出、VISA转入和VISA转出。

thatisagreenleaf的复数：thosearegreenleaves。原句句意：那是一片绿色的树叶。改成复数句，that的复数是those，leave的复数是leaves。

disappear应该是disappeared,过去式Little by little the snow disappeared, didn"t it?很高兴为你解答，祝你每天都开心：）望采纳，谢谢！

前者是感受到挫折的，沮丧的，后者是失望的

歌曲名:Beautiful Disaster歌手:Jon Mclaughlin专辑:IndianaJon McLaughlin - Beautiful Disasterlrc 编辑 Memphis 314522711She loves her mama"s lemonade,Hates the sounds that goodbyes make.She prays one day she"ll find someone to need her.She swears that there"s no difference,Between the lies and complements.It"s all the same if everybody leaves her.And every magazine tells her she"s not good enough,The pictures that she sees make her cry.And she would change everything, everything just ask her.Caught in the in between of beautiful disaster,And she needs someone to take her home.She"s giving boys what they want, tries to act so nonchalant,Afraid they"ll see that she"s lost her direction.She never stays the same for long,Assuming that she"ll get it wrong.Perfect only in her imperfection.She"s not a drama queen,She doesn"t want to feel this way, only seventeen but tiredShe would change everything for happy ever after.Caught in the in between of beautiful disaster,But she just needs someone to take her home.Cuz she"s just the way she is, but no ones told her that"s ok.And she would change everything, everything just ask her.Caught in the in between of beautiful disaster,And she would change everything for happy ever after.Caught in the in between of beautiful disaster,But she just needs someone to take her homeAnd just needs someone to take her home.http://music.baidu.com/song/1372639

好个屁。。。。

反方立论：We firmly believe that as long as human technology can be advanced enough, we can do much for the nature disasters. We say that the defeat is not forced to rely on the strength of contrary to the laws of nature. Ever since human beings come into being, we had never stopped the action to put our feet on each inch of land we can find. We fight against nature, at first, for survival. In the face of the different kinds of disasters, we can find the appropriate measures to overcome it. That"s all, thank you.提问反方: Wen chuan earthquake killed more than 60000, because human technology isn"t advanced enough. We think we can reduce the loss as long as human technology advanced enough. Do you agree? Thank you.正方：Can it indicate that man can conquer the nature? In the several millions of years from human birth, but we still suffer a lot when the disaster comes, why? Is there a disaster which people know before it happens and prevent it? Thank you.反方： It is true that we suffer a lot in the several millions of years from human birth. But while human developing, we can do more and more for the natural disasters. Do you agree? Thank you.正方： There are some effects, but only a little. We can do something because of it is not big enough. If someday it takes a disaster which like bring the dinosaur dying out, what can we do? And how can we do after we all killed.自由：反方：You are said we can do little in face of the natural disasters .I want to ask a question” when you suffer a downpour, what would you do? Stand here?正方：We are discussing the nature disasters, not a downpour. 反方： The downpour is a nature disaster, isn"t it? A light rain can become a downpour, can"t a downpour become flood. 正方：You are kidding, In Sichuan and its surrounding areas it"s suffered a serious disaster killed more than 40,000. People realize that even if the development of human technology is so advanced to the extent they can"t be able to overcome nature.正方总结：There is a gold chain runs through the universe, there is a red line links all living things, it is the things in the course of development of natural formation and the rules of the law - the law of life and death. The law forms natural, can not be easily changed, nor transfer with the people"s will. People can only obey the rulers, not change the law. So we insist on that nature can not be conquered. Thank you.反方总结： In the face of the different kinds of disasters, we can find the appropriate measures to overcome it. During this earthquake, our government does much for it and gets some achievement. We firmly believe that with the development of technology, we can accurately predict earthquakes. At that time, we are faced with natural disasters and able to leisurely. Therefore, we firmly believe that we can do much for the nature disasters. Thank you. 希望对你有用

他在自己的梦中沉醉我知道（他是）优美的极致他的人跟他的外表一样该死我想象不出有比他更美的天堂。如果我试着拯救他，我的世界可能会随之堕落。这样可不行这样可不行（合唱 1）噢，我不知道我不知道他的信仰但是他如此美丽简直就是一场美丽的灾难如果我可以控制自己我的笑和泪会不会也变得美丽还是说这只是一场美丽的灾难？他是魔法和神话和我想象中一样强壮一个灵魂不应看到的悲剧我应该试着改变他么？不去责备他实在太难了努力坚持努力坚持（合唱2）噢，因为我不知道我不知道他的信仰但是他如此美丽简直就是一场美丽的灾难如果我可以控制自己我的笑和泪会不会也变得美丽还是说这只是一场美丽的灾难？（Bridge）我期待不失理智的爱情但是他却如此疯狂我等待着奇迹的发生等待……等待。他曾经那么温柔但是最后我们在争论中分手他永远不满足永远不会被我束缚住(重复合唱2)他那么美丽但却是美丽的灾难美丽，美丽的灾难美丽的灾难可累死我了~

高采纳率保证准确率! March 27,1964 was a holiday in Alaska,so most people were at home,and everything was going on (as usual).Suddenly,there was a sound like thunder.Next,people"s houses began to shake.Buildings cracked and water (pipes) burst.In the town of Anchorage,and buildings fell down.People were shocked by the unexpected (quake).Some ran up and down the street while others who（were trapped）in the buildings,were looking out of their windows for help.The earthquake that hit Alaska was one of the strongest (disasters) in North America.The earthquake (destroyed) many towns and (a great number of) people were killed.,2,as usual / pipes / disaster / were trapped / quake / destroyed / a great number of,2,as usual pipes quake were trapped disasters destroyed a great number of,2,题目是什么？,0,高一英语书上第63页的完形填空 (destroy) (trap) (disaster) (a great number of) (as usual) (pipe) (quake) 填空 1March 27,1964 was a holiday in Alaska,so most people were at homw,and everything was going on______.2.Suddenly,there was a sound like yhunder.Neext,people"s houses began to shake.Buildings cracked and water_________burst.In the town of Anchorage,andbuildings fell doen.3.People were shocked by the unexpected________.4.Some ran up and down the street while others who_________in the buildings,were looking out of yheir windows for help.5.The earthquake that hit Alaska was one of the strongest_________in North America.The earthquake________many towns and __________people were killed.请各位哥哥姐姐们帮帮小妹啊！

直接翻译，意思是 你是一份礼物，也是一场灾难。按照意译，可以理解为 你是恩赐也是劫。望采纳

歌曲名:Natural Disaster歌手:Loudon Wainwright III专辑:A Live OnePlain White T"s - Natural DisasterShe said she saw me on TVThis girl"s a legend in the late night sceneAnd you can see she aimed to pleaseCause she just wouldn"t take her eyes off meShe made the music come to lifeShe moved her body like a butcher knifeChopping up every guy in sightShe was mysteriousI could not resist to save my lifeI don"t know what this girl was afterShe"s a natural, natural disasterShe"s so sexyI had to have herShe"s a natural, natural disasterNatural disaterNow when she left me on the floorShe knew I"d follow her right out that doorShe"d always leave you craving moreJust the addiction I"ve been waiting forShe made the music come to lifeStaring me down with those electric eyesAnd when she said "Your place or mine?"I was delirious, I could not resist to save my lifeI don"t know what this girl was afterShe"s a natural, natural disasterShe"s so sexyI had to have herShe"s a natural, natural disasterNatural disasterAll my loveWhat"s your name?What"s your game?Show me how to playAll night longCause I can see you and me going all the wayAll night longAnd I don"t even really care what you"re afterAll night longAs long as you keep going faster and fasterShe said she saw me on TVThis girl"s a legend in the late night sceneAnd you can see she aimed to pleaseCause she just wouldn"t take her eyes off meI don"t know what this girl was afterShe"s a natural, natural disasterShe"s so sexyI had to have herShe"s a natural, natural disasterI don"t know what this girl was afterShe"s a natural, natural disasterShe"s so sexyI had to have herShe"s a natural, natural disasterNatural disasterhttp://music.baidu.com/song/8165288

A:An tornado took place in Carolado yesterday.B:Really? How bad was it?A:Not the same bad as you may think. A couple of houses were torn down and, what is the worst, a gas station was ruined causing gas leak.B:Oh, that"s terrible.A:Sure it is.B:Any casualty?A:Eh, it was broadcast that a homeless was hurt like a rib-breaking, and was sent to local hospital.B:Ah, lucky, isn"t it!A:Yeah, lucky we don"t have that sort of disaster in this area.B:Yeah, and the NBDH(National Bureau of Disaster Handling) seems to be more efficient than before.A:Sure thing.

平日习惯上讲似乎catastrophe略大于disaster 但严格意义上这两者在「强度」上没有区别.这两个词最大的区别是catastrophe源于希腊语,disaster源于拉丁语

disastrous

[00:03.05]JoJo - Disaster[00:12.35]I"m trying not to pretend that [00:13.82]It won"t happen again and again like that[00:18.18]Never thought it would end, [00:19.57]But you got up in my head n my head like that[00:23.21]You made me happy baby, [00:25.21]Love is crazy, so amazing[00:28.18]But it"s changing, rearranging[00:31.26]I don"t think I can take anymore[00:34.50][02:29.53][00:35.81]Cuz the walls burned up and our love fell down[02:32.35][00:38.48]And it turned into whatever now we"re saying never[02:35.77][00:41.79]Feel the fire cuz it"s all around [02:38.38][00:44.51]And it"s burning for forever and always[02:41.36][00:47.52]We gotta let it go, be on our way[02:44.25][00:50.26]Look for another day, [02:45.68][00:51.64]Cuz it ain"t the same my baby[02:47.92][00:53.99]Watch it all fall to the ground[02:50.50][00:56.59]No happy ever after, just disaster[02:52.78][01:00.83][01:06.34]Didn"t want it this way, [01:07.72]I only wanted to say[01:09.23]I loved you right[01:12.12]Then your love went away, [01:13.67]And I needed you to stay[01:15.20]But I can"t wait for you to realize[01:18.55]All the things I gave you, [01:20.96]Made you change you[01:22.20]Your dreams came true[01:23.56]When I met you, now forget you[01:26.95]Don"t want anymore[01:28.61][02:53.91][01:29.73]Cuz the walls burned up and our love fell down[02:56.36][01:32.40]And it turned into whatever now were saying never[02:59.76][01:35.82]Feel the fire cuz it"s all around [03:02.37][01:38.42]And it"s burning for forever and always[03:05.10][01:41.11]We gotta let it go, be on our way[03:08.13][01:44.23]Look for another day, [03:09.54][01:45.54]Cuz it ain"t the same my baby[03:11.78][01:47.86]Watch it all fall too the ground[03:14.52][01:50.58]No happy ever after, just disaster[03:18.16][01:53.08][03:21.83](Lyrics by MaxRNB)[01:54.05]You shot the bullet, [01:55.22]You shot the bullet that killed me[01:57.62]Not feeling my heart beat and now I was dying[02:00.26]I I"ve been through it, [02:01.27]I I"ve been through the agony[02:04.08]And now my eyes I"m trying, [02:06.51]trying, no more crying,[02:08.73]Lying"s just a game,[02:11.53]To stand up straight and I"m all right [02:14.36]cuz my loves on his way[02:19.56]Yeah[02:22.76]Burning for forever and always

disastrous [dɪ"zɑːstrəs] adj.灾难性的；损失惨重的；悲伤的

The earthquake is a disaster. Don"t see it as your personal misfortune and make a great tragedy killing yourself.

disease和disaster的区别为：指代不同、语法不同、侧重点不同。一、指代不同1、disease：病;疾病。2、disaster：灾难;灾祸。二、语法不同1、disease：disease用作不可数名词时,是“疾病”的通称。disease用作可数名词时,指某种具体的疾病。2、disaster：disaster指人为的或自然的灾祸。三、侧重点不同1、disease：disease指具体的疾病，且通常较严重，发病时间也较长。2、disaster：disaster普通用词，指大破坏、痛苦或伤亡。

1、disaster，英语单词，名词，意为“灾难”“灾祸”。包括自然灾难和人为灾难。自然灾难是指地震，洪涝，海啸，泥石流，森林自燃，干旱等等。人为灾难包括人为放火，饥荒等等。 2、单词释义:大不幸，大难，大祸，灾难，灾害，天灾；成事不足败事有余的人；彻底(或完全)的失败，惨败；事故，故障，彻底(或完全)失败的事；[废语](星向)凶位，凶向。

1、disaster，英语单词，名词，意为“灾难”“灾祸”。包括自然灾难和人为灾难。自然灾难是指地震，洪涝，海啸，泥石流，森林自燃，干旱等等。人为灾难包括人为放火，饥荒等等。2、单词释义:大不幸，大难，大祸，灾难，灾害，天灾；成事不足败事有余的人；彻底(或完全)的失败，惨败；事故，故障，彻底(或完全)失败的事；[废语](星向)凶位，凶向。

不用浊化，还是发s

disastrous

calamity 指造成重大破坏的灾难，如火灾、水灾等disaster 指伤亡惨重的灾难，如大地震、空难、瘟疫等。

亲，这个题我来帮你回答这个单词当中的元音字母有3个：i，a和e，剩余的5个字母（d，s，t，r）都是辅音字母。在英语中，26个字母只有五个，是元音字母，他们分别是：a，e，i，o，u，其余的都是辅音字母。亲，这是我的全部答复，希望对你有所帮助，如果你对我的答案满意，请给个五星好评或者点我的头像加关注，方便我一对一为您咨询

可能版本每年都会有所改动，具体还是要看当年的课本。给你参考：Unit4NaturalDisaster达标课课件-人教版(2019)必修第一册-达标课disaster，英语单词，名词，意为“灾难”“灾祸”。包括自然灾难和人为灾难。自然灾难是指地震，洪涝，海啸，泥石流，森林自燃，干旱等等。人为灾难包括人为放火，饥荒等等。

说到“自然灾害”的时候，一般都说 a natural disaster，而不说 "a natural catastrophe"。如果自然灾害极为严重、救援不足等等，可把它形容为 a catastrophe。catastrophe表示程度大一点

应该是可数的，比如说：“There were a number of natural disasters last year.”"If you ignore the safety measures, you are inviting disasters."所以，是可以数的。希望帮到你。

themostdisaster。disaster含义作自然灾害时是一个可数名词，作名词使用时它的意思是灾难，彻底的失败，不幸，祸患。

accident人祸disaster天灾

disaster着重指突然的、意外地、不可预见地“灾难”，尤指自然灾难，如地震、水灾、火灾等；calamity 比disaster语气重，表示“可怕的，严重的事件或不幸”，没有disaster用的普遍

"disaster" 的近义词包括：catastrophe、calamity、cataclysm、tragedy、crisis 等等。它们都表示某件事情或事件非常严重，给人们造成了巨大的伤害、损失或困难。以下是 5 个使用这些近义词的英文例子：The earthquake was a real catastrophe, leaving thousands of people injured and homeless.（地震真是一场巨大的灾难，许多人受伤无家可归。）The fire at the chemical plant was a calamity for the surrounding community; air and water quality suffered greatly.（化工厂的火灾给周边社区带来了一场灾难，空气和水质遭到了严重破坏。）The war was a cataclysm that left entire cities destroyed and millions dead or displaced.（战争是一场浩劫，整个城市被摧毁，数百万人死亡或流离失所。）The plane crash is a tragedy that no one could have predicted or prevented.（飞机坠毁是一场悲剧，没有人能够预料或防止。）The economic crisis has led to widespread unemployment and poverty, affecting the lives of millions of people.（经济危机导致了普遍的失业和贫穷，影响了数百万人的生活。）

disaster 灾难，havoc危害、威胁。区别是灾难disaster是已经发生的造成严重后果的，而havoc危害尚未造成灾难性后果。

disaster可数，可数名词是指能以数目来计算，可以分成个体的人或东西；因此它有复数形式，当它的复数形式在句子中作主语时，句子的谓语也应用复数形式。 名词根据其可数性可分为可数名词（CountableNoun）和不可数名词（UncountableNoun）。可数名词即指可以分为个体，且可直接用数目进行计数的名词，如课桌、风筝、女孩、房间、学校等。

英[di04zɑ:st05] 美[d0104z03st06, -04s03s-]

首先，可以将这几个词分组，appraisal、evaluate、assess一组，侧重于评估、评价的意思，estimate、reckon一组，侧重于估计（含计算的意思）assess 通常表示“对(财产、收入等)进行估价(作为征税根据)，(为征税)估定(财产)的价值，估定(收入)的金额，评估，把…定值”，The hurricane demage was assessed at three million dollars.飓风损害赔偿金的金额被确定为三百万美元。还有就是“对(人、物、工作等)进行估价，评价，评论，判断，评定(…的意义、重要性或价值) ”，简历里经常用到的‘self-assessment 自我评价就来自这个词，We should equitably assess historical figures. 我们应该公正地评价历史人物。evaluate 评价, 估计 基本上中文有这个意思的，都可以用到这个词，用法很广，基本可以代替其他的意思。书面语evaluation也很常用。I can"t evaluate his ability without seeing his work.我没有看到他的工作情况, 无法评论他的能力。The school has only been open for six months, so it"s hard to evaluate its success.该学校仅开办了六个月, 现在还很难估计它的成就。appraisal 估计, 估量, 评价 是一个会计术语，当然也可以用在通常语境。另外，在软件行业，它常常用来指CMMI认证的评估，如果你和这行业有关的话，经常用到。estimate 这词不用说了，只要是“估计”（动词）或估计（值）作名词，都可以用这个词。你去翻翻词典吧，反正如果用它来表示含估计这个意思的，不会有错。reckon 1.猜想; 估计 Reckon the cost before you decide.先算一下费用, 然后再作决定。2.〈非正〉思忖; 设想 I reckon that he will come soon.我想他很快就会来。3.考虑; 认为 I reckon that he is old enough.我认为他的年龄已经够大了。She has always been reckoned as clever.大家一直认为她是个聪明人。其实你只要掌握estimate和evaluate的用法就好了，任何词表达的意思没有明显的界限，这跟行业、语境、使用者有很大的关系。

锁定计算机,数据1表示启用,0代表关闭.

歌曲名:Lisa歌手:Alain Souchon专辑:Triple Best OfLisa Left Eye Lopes - L.I.S.A.Ya"ll never really know me from the stories i tellFrom the lifestyle i lead and the records i sellCaught up in situations detrimental to meAnd i been through every war just for the world to see(that time) is always moving situations do change(and things) don"t always work out just the way that we planned(still stand) necessary be my friend and my foeEither love me or you hate me, that"s how the game goes(if it"s wrong) to be respected never ever say die(remain strong) never neglected spread my wings and fly(like you) i"ve been though struggles so much stress on my brainActin" out my life on stages and still had to maintain(question every decision) my intentions were goodTwist the story all around and leave me misunderstood(imagine that) no privacy but that"s the price of this fame(under attack) my destiny to be a soldier through fameLet me live liveLet me liveIn in side inside intelligenceSay say say say what you gotta sayAlways asking you will amazedAlways ask and you will amazedJust to make it in the world and go against all oddsCome from the gritty inner city to a superstarNumber one hits consistently for ten long yearsPut my soul in every project my blood sweat and my tearsYa"ll know my statusLeft eye the badestUnderestimate don"t hate and i keep it lavishBut it don"t mean nothing if i can"t find peace of mindPacking all distractions away leave them behindSay goodbye hard times small crimes and feloniesA new beginning i"m winning envisioning the breezeI"m dressed in all white linen and falling to my kneesThankful for all that"s been given, i"m living, with easeTropical trees 90 degrees, pleaseDo like the birds and the bees and start a familySo remise on every line that i wroteKnow that i never will surrender and it"s truth that i spokeI flew i flew like water like waterAm i desire like fire like fireI"m picking up the dirt from the earth the earthImaging i"m the wind redelivering from people withinLet me live live, let me liveLet me love love, let me loveLet me learn learn, let me learnLet me laugh laugh, let me laughLet me see see, let me seeLet me say say, let me sayLet me smile smile, let me smileLet me ask ask, let me askhttp://music.baidu.com/song/2888079

是的，因为visa卡才可以在境外支付，你需要选择提前办理好visa卡。一、UCAS申请费只能用visa卡支付。你需要到UCAS的网站注册，如果你只申请1所学校，需要8镑的申请费，2所以上需要15镑。必须用信用卡支付。申请人必须登陆UCAS网站使用网上申请系统进行申请，最多可同时申请6所大学和学院的课程（即共有6个选项，也可以同一所大学选择两个专业，这样就是占用2个选项）。二、UCAS的申请方法。学生提出UCAS申请时，最多可填写6所不同的学校(或课程)（如果你向同一所学校申请两个专业，算作两个志愿）。申请人只需把UCAS申请表寄给UCAS，不必附上成绩单或毕业证等相关文件。如果学生对牛津或剑桥感兴趣，那他们可以把其中一所作为第一志愿。同时还可以选择另外5所院校。当然，也不是说必须要选6个志愿。一般申请时需支付UCAS少许的申请费用(若你只申请一个志愿，费用为5英镑；若申请超过一个志愿，费用为15英镑)。学生每年只能通过UCAS提出一次申请，因此在专家的建议下来完成申请程序是非常重要的。三、UCAS的查询方式。1、各院校在审理后会通过UCAS寄发录取通知给学生或直接寄发。学生也可以通过UCAS上的‘TRACK"来关注大学给他们的回复。2、UCAS在收到学校的录取意见信的一个工作日内，会向申请人寄出由UCAS签发的标准格式的录取文件，转告校方的录取意见，此录取文件是签证时很重要的文件，请务必妥善保管。3、申请者必须在全部录取通知意见书（条件和无条件的）之中挑选，声明确认接受一个学校/专业，同时还可以备选接受一个学校/专业，此过程可在网上直接进行。

是的，因为visa卡才可以在境外支付，你需要选择提前办理好visa卡。一、UCAS申请费只能用visa卡支付。你需要到UCAS的网站注册，如果你只申请1所学校，需要8镑的申请费，2所以上需要15镑。必须用信用卡支付。申请人必须登陆UCAS网站使用网上申请系统进行申请，最多可同时申请6所大学和学院的课程（即共有6个选项，也可以同一所大学选择两个专业，这样就是占用2个选项）。二、UCAS的申请方法。学生提出UCAS申请时，最多可填写6所不同的学校(或课程)（如果你向同一所学校申请两个专业，算作两个志愿）。申请人只需把UCAS申请表寄给UCAS，不必附上成绩单或毕业证等相关文件。如果学生对牛津或剑桥感兴趣，那他们可以把其中一所作为第一志愿。同时还可以选择另外5所院校。当然，也不是说必须要选6个志愿。一般申请时需支付UCAS少许的申请费用(若你只申请一个志愿，费用为5英镑；若申请超过一个志愿，费用为15英镑)。学生每年只能通过UCAS提出一次申请，因此在专家的建议下来完成申请程序是非常重要的。三、UCAS的查询方式。1、各院校在审理后会通过UCAS寄发录取通知给学生或直接寄发。学生也可以通过UCAS上的‘TRACK"来关注大学给他们的回复。2、UCAS在收到学校的录取意见信的一个工作日内，会向申请人寄出由UCAS签发的标准格式的录取文件，转告校方的录取意见，此录取文件是签证时很重要的文件，请务必妥善保管。3、申请者必须在全部录取通知意见书（条件和无条件的）之中挑选，声明确认接受一个学校/专业，同时还可以备选接受一个学校/专业，此过程可在网上直接进行。

我是 过来人 你要到 你那边的 大使馆 直接问 是 最快 最 有效 办法

歌曲名:Jake歌手:Lisa Loeb专辑:FirecrackerI"m going as far as I can go, away from hereAway from you, Jake, and the hole you"ve sunk me into.I wish that I could belong here, with youbut that"s not all that I"m about.Your life is built on accidents, like meeting me.You write everything down in your grocery list - people do this.Even insects buzz like airplans, why can"t we fly away?I"m going as far as I can go.Your dad died, cause his heart hurt, arking away his forty-five yearsdragging your mom along.I don"t want that, netiher do you. Neither do you.If I am not fun, and I am not interestingperhaps I am not interested in you, neither are youYou can"t stand in front of an over, cause it"s warmand the fumes are dangerous.I"m going as far as I can goaway from here, away from you, Jake, and the hole you"ve sunk me into.I wish that I could belong here, with you, and just be,but that"s not all that I"m about to do.http://music.baidu.com/song/8107441

MisaFukai外文名：MisaFukai职业：演员代表作品：美少女战士合作人物：几原邦彦电视剧作品

没有公布。截止到2022年6月18日，Rokid是一家专注于人机交互技术的产品平台公司，创始人misa并没有公布她的女朋友，而且他的个人私事不愿意被很多人知道。

不知道的 麻烦采纳，谢谢!

作为名字或特定名词里边，完全可以。海：(カイ,うみ,あま,うな,うみ,み)飒：（さつ、そう、さ）

Misa gama对剧中伽马