cris

歌曲名:Body Shots歌手:Kaci Battaglia&Ludacris专辑:Bring It Onfresh 21walk up to the clubmy girls cut the linecause we"re a step abovewalk up to the barbuying drinks like a starmy girl they wanna try it,so we had to buy it...uh huh, whip it up,lick it up, suck it downuh huh, drink it up(ooh i think she likes it)uh huh, whip it up,lick it up, suck it downuh huh, drink it up(ooh i think she likes it)doing shots-at the barbody shots-at the barmy girls, they wanna try itso we had to buy itat the what-at the barat the what-at the barmy girls, they wabba try itso we"re drinking like we"re rockstars!top alcohol, mix it up, mix it upgot me laying down and i pull my shirt upbaby get the whipped creamfeeling like a wet dreamgot me at the bar, doing body shots now...uh huh, whip it up,lick it up, suck it downuh huh, drink it up(ooh i think she likes it)uh huh, whip it up,lick it up, suck it downuh huh, drink it up(ooh i think she likes it)doing shots-at the barbody shots-at the barmy girls, they wanna try itso we had to buy itat the what-at the barat the what-at the barmy girls, they wabba try itso we"re drinking like we"re rockstars!LUDACRIScan somebody, anybody, everybodyplease just tell me where all of my shots are,i"m tryin" to get "em drunk and they not far,"cause even though my name"s Ludacris,when i get up in the clubi be drinkin" like a rock starpocket full of money and i"m throwin" stacks,grab a couple shots then throw "em backand conjure up your freaky sidewhen drinkin" the conjure cognacgot you feelin" kind of frisky and tipsy,we gon" drink "til the bottle"s goneand these girls wanna try some things,and i"mma be the one that they try it on.smoke smoke i"mma roll these papers,and ain"t nobody on they best behavior,,cause i"mma taste this shot,then i might taste you, if you come in all different flavorsuh huh, whip it up,lick it up, suck it downuh huh, drink it up(ooh i think she likes it)uh huh, whip it up,lick it up, suck it downuh huh, drink it up(ooh i think she likes it)doing shots-at the barbody shots-at the barmy girls, they wanna try itso we had to buy itat the what-at the barat the what-at the barmy girls, they wabba try itso we"re drinking like we"re rockstars!doing shots-at the barbody shots-at the barmy girls, they wanna try itso we had to buy itat the what-at the barat the what-at the barmy girls, they wabba try itso we"re drinking like we"re rockstars!http://music.baidu.com/song/18118385

基因敲出质粒转染可以构建稳定细胞株一种是脂质体转染后,单克隆筛选稳定细胞株.另外一种是应用逆转录病毒,慢病毒转染,筛选稳定细胞株.脂质体转染：在转染24小时后,消化细胞并计数.将细胞种到96孔板,保证每个孔2-3个细胞,这样才能得到单克隆.待细胞贴壁后,加入抗生素筛选.筛选时间和浓度视细胞而定.一般G418一个星期作用,嘌呤霉素2-3天.脂质体法筛单克隆时间较长,且效率低,大概只有1%.病毒转染：先要用包装细胞,一般为293细胞,包装出病毒,再用病毒转染目的细胞.包装病毒视不同类型的病毒而定,一般要3-5天的时间.包装好的病毒要测滴度,根据滴度决定转染目的细胞的病毒量.转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株.病毒转染得到稳定细胞株的效率高,只是步骤繁琐.

crisper的本质是细菌的一种保护机制。1、crisper介绍。CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统。利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统，是古菌和细菌抵抗病毒等外源遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。2、crisper的功能特点。CRISPR是生物科学领域的游戏规则改变者，这种突破性的技术通过一种名叫Cas9的特殊编程的酶发现、切除并取代DNA的特定部分。这种技术的影响极其深远，从改变老鼠皮毛的颜色到设计不传播疟疾的蚊子和抗虫害作物，再到修正镰状细胞性贫血等各类遗传疾病等等。该技术具有非常精准、廉价、易于使用，并且非常强大的特点。crisper的技术运用：1、CRISPR技术可以纠正导致疾病的基因错误。肥厚型心肌病（HCM）是一种心脏疾病，影响着全球0.2%的居民，该患者群体将承受巨大的痛苦，而且该疾病会致命。通过使用这项技术，有可能减轻这种遗传性疾病对家庭造成的负担，最终影响全人类。2、CRISPR技术可消除导致疾病的微生物。虽然艾滋病治疗是从感染致命病毒转变为健康状态，但是科学家仍没有找到有效的解决办法。这种状况可能会随着CRISPR技术的发展而改变，研究人员对使用CRISPR技术设计噬菌体保持乐观态度，因为它们是一种经过验证的、安全的治疗细菌感染方法。3、CRISPR技术可培育更健康的新型食物。CRISPR基因编辑技术被证实在农业研究领域具有发展前途，美国纽约冷泉港实验室科学家使用CRISPR工具能够增大番茄产量，该实验室开发一种方法能够编辑基因，确定番茄的大小，分枝结构以及最大产量时番茄的外形。

TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) 和 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 都是现代基因编辑技术的代表，它们有以下相同点：都可以精确切割DNA：TALEN和CRISPR都是通过酶切酶的功能，识别和切割目标DNA序列。都需要设计与序列匹配的RNA或DNA：TALEN和CRISPR都需要特异性的引物来识别和结合目标基因，以进行基因编辑。都可用于修饰基因组中的特定位点：TALEN和CRISPR都能够精确编辑基因组中的特定位点，以产生所需的基因改变。都可以在细胞和生物体中应用：TALEN和CRISPR都可以应用于生物体中，包括单细胞和多细胞生物，以进行基因修饰。都可以被用于基因治疗：TALEN和CRISPR都是潜在的基因治疗方法，因为它们可以用于纠正病态基因。需要注意的是，TALEN和CRISPR的具体工作机制、设计原理和应用范围都有所不同，所以在具体应用时需要根据需求进行选择。

近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。

crispr cas9技术原理如下：CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统,用来抵抗外源遗传物质的入侵,比如噬菌体病毒和外源质粒。同时,它为细菌提供了获得性免疫:这与哺乳动物的二次免疫类似,当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时,会产生相应的“记忆”,从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰(RNAi)的原理是相似的。CRISPR-Cas9，一种基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病。2017年3月，英国《自然·通讯》杂志发表一项遗传学重要研究成果，利用CRISPR-Cas9系统可拯救失明小鼠。CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。专利授权：2014年4月15日，获得了美国专利与商标局关于CRISPR的第一个专利授权。专利权限包括在真核细胞或者任何细胞有细胞核的物种中使用CRISPR。这意味着拥有在除细菌之外的所有生物，包括老鼠、猪和人身上使用CRISPR的权力。

CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。

“基因敲除狗”，“基因敲除猪”，CRISPR/Cas9到底是怎样一个技术技术近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗？杜德娜和艾曼纽？夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。二、CRISPR/Cas系统的灵感来源CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。1、“记录”入侵者档案其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图A所示）。图1 CRISPR序列示意图其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。2、打击二次入侵者当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。三、CRISPR/Cas9技术的实现需要什么？在CRISPR/Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，如图3所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游

Crispr/cas9是种基因工具，在基因工程里修改调节基因etc.这个系统有两部分，guide RNA 用来和目标基因匹配（定位），Cas酶消化目标序列（两条链一起切）。

[](javascript:void(0);) | CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。 根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。 CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。 一、基因编辑技术的发展史 基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（ 图1 ）。[图片上传失败...(image-8dab49-1625385468208)] 图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右） NHEJ（Non-homologous end joining） 非同源性末端接合 NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（ 图1 ）。 HDR（Homology directed repair） 同源重组修复 当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。 NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（ 图1 ）。 1.ZFN的识别切割机制 融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （ 图2 ）。 [图片上传失败...(image-3f1d8d-1625385468209)] 图2-ZFN基因编辑原理图 2.TALEN的识别切割机制 两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（ 图3 ）。 [图片上传失败...(image-6dcfc-1625385468209)] 图3-TELEN基因编辑原理图 3.CRISPR/Cas9的识别切割机制 crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（ 图4 ）。 [图片上传失败...(image-c85235-1625385468209)] 图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图 ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较 [图片上传失败...(image-dd6344-1625385468209)] 图5-三种基因编辑的比较 二、CRISPR/Cas技术的介绍 CRISPR/Cas9 系统的发现 1987年，在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。 2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。 2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。 2013年，发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。 从此开始，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击，CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊，近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。 CRISPR/Cas技术的原理 CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图4）。 CRISPR/Cas技术的优势 设计简单，简明的碱基互补设计原则，识别不受基因组甲基化影响，能靶向几乎任意细胞任意序列，方便同时靶向多个靶点，切割效率高。 三、CRISPR/Cas的脱靶效应 PAM**** (Protospacer adjacent motif ) 前间区序列邻近基序 PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上，NGG介导的切割效率是最高的。 sgR****NA ****(Single guide RNA ) 向导 RNA sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对，而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键，其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。 CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性，也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。 2017年5月30日， Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章，研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后，对小鼠进行全基因测序，发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变，以及超过100个位点发生大片段插入或缺失（ 图6 ）。文章的结论无疑引发了巨大震动，也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。 [图片上传失败...(image-f21b76-1625385468208)] 图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变 仔细分析后，发现该文章并不十分严谨，文章仅有两只小鼠作为实验组，一只作为对照组，数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象，不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据，且该sgRNA特异性评分很低，造成脱靶效应也应该在预料之中（ 图7 ）。 [图片上传失败...(image-751d94-1625385468208)] 图7--针对 Nature Methods 文章的回应 经过一系列的研究和改进，目前CRISPR系统的脱靶性已经很低，当然，要想达到理想的状态，还有很长的路要走。 四、CRISPR/Cas技术的进展 2016年6月，张锋在 Science 发表文章，发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。 2016年9月，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。 2017年2月22日，美国纪念斯隆.凯特林癌症中心（MSK）研究人员在 Nature 杂志发文，使用腺相关病毒（AAV）介导，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害，又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险，赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。 2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文，使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是，该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。 2017年8月11日，杨璐菡等在 Science 发表文章，通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。 2017年9月，杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题，将扭转我国部分农作物重金属超标的问题，进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。 2017年10月4日，张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率，而且有更强的特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。 2017年10月19日，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应，且不降低靶向切割效率。 2017年10月25日，张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR，可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列，所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。 2017年10月25日，哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文，报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9，可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对，该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术，即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率，且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用，因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。 五****、展望 近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。 特别感谢：BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的图片。 | | |

　　中山大学人类胚胎遗传性致病基因修复实验采取了CRISPR／Cas9基因编辑技术。该技术是近年在锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术之后出现的新型基因编辑技术，原理来自细菌的适应性免疫防御机制。相比传统的基因打靶技术和其他基因编辑技术，CRISPR／Cas9更为精确、高效和经济。　　科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。

CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。 一、什么是CRISPR-Cas系统 CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。 C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。 1、CRISPR（/"kru026aspu0259r/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌） CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。 ①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。 ②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。 ③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。 2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。 Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。 依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。 第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。 第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。 目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。 二、CRISPR-Cas9的作用原理 对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。 1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ） CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5" 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5" 到3" 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。 新间隔序列的获得可能分为三步： 第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。 第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。 第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。 2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工） CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。 crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。 3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰） crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。 随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。 三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用… tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。 CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。 CRISPR-Cas9的广泛应用 1、基因敲除（Knock-out） Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除 2、基因敲入（Knock-in） 当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率 3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation） Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。 4、多重编辑（Multiplex Editing） 将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。 5、功能基因组筛选 利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。

CRISPR的全称Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，意为成簇规律间隔短回文重复序列，Cas则是CRISPR-associated (Cas) systems。 CRISPR/Cas 系统是原核生物的免疫系统，这个系统可以识别出外源 DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，用来抵抗外源遗传物质比如噬菌体病毒和外源质粒的入侵。这与真核生物中RNA干扰（RNAi）的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中 CRISPR/Cas9 系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。 CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 来识别并剪切 DNA 以降解外来核酸分子。现在使用的 CRISPR/cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来，该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。 u26a0ufe0fnature video视频： CRISPR: 基因编辑原理及应用 基因敲除：sgRNA+Cas9 基因敲入：sgRNA+Cas9+目的基因（HDR模版） 5‘端开始数20个碱基这一段是需要设计的，这一段用来识别目的基因上的靶标，并通过碱基互补配对原理与靶点位置结合。 gRNA再往后数76个碱基，是另一段transactiviting RNA (tracrRNA)。它的序列是一定的，就像转运RNA一样可以形成空间结构，然后就可以和Cas9酶相结合。 这样一条完整的gRNA就可以识别靶点，并且把与它自身结合的Cas9酶带到这个靶点，引导Cas9酶在靶点处对目的基因的双链DNA进行切断，从而达到基因编辑的目的。 目前又很多在线工具可以用于设计sgRNA 不同的导入方式基因标记效率和脱靶效率不同 参考： CRISPR实验究竟怎么做？手把手教给你 CRISPR/Cas9 基因编辑全套操作和解决方案（TAKARA 讲解）

ZFNZFN，即锌指核糖核酸酶，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcription factor family），在真核生物中从酵母到人类广泛存在，形成alpha-beta-beta二级结构。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，骨架结构保守。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计ZFNs。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。TALENTALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。CRISPRCRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。微生物学家10年前就掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，其中比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术，并先后对多种目标细胞DNA进行切除。以往研究表明，通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高。但最近研究发现，虽然CRISPR有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。三种系统的比较那么，可能会有人疑问了，既然如此，这三种系统的区别和联系又是什么呢？特意从有效性，特异性，载体性及其它四个方面，进行了一个小小的总结。有效性在不同的基因位点基因靶向性的有效性都是不同的，并且这也依赖于每种细胞的转染的效率。因此，只能点对点的比较靶向位点，细胞系和转染方法，这样的比较才有意义。基于我们课题组和其他课题组的ZFN和TALENs的靶向效率的实验，我们在细胞系水平上进行了比较，虽然他们可能与不同的突变特征有关。Chen的课题组的最近的研究进行了大规模的体外分析，发现TALENs在使用与上下游相关的序列的时候比ZFNs显著的具有更多的突变产生。另一个组比较了TALENs和CRISPRs在人类ESCs细胞中的情况，观察到，通过用CRISPR更换掉TALENs，在其他方面条件相同的情况下，通过产生更多的基因突变的克隆，本质上提高了效率。最近，功能上重新编码的TALENs（reTALENs）已经得到了发展，并且在人类的iPSCs细胞中的基因编辑的有效性相比较于CRISPR得到了提高。但是这个研究发现，CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍的同源重组效率，并且其一定程度的比HE更有效率，挡雨ODN捐赠者进行比较。特异性ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的，其特异性是由DNA绑定的区域决定的，这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp。然而，在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸，它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的。这表明，3"12个碱基的“种子序列”是最关键的，而剩下的8个碱基（非种子序列）甚至PAM序列都是可以错配的。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行，并且发现存在频率低，但是可以检测到的脱靶事件的发生，其可以定义为一个高度有限的一部分。已经有研究表明，TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。基于这个研究，TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%，而在高度同源的CCR2位点上只有1%。相反，CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的，CCR5位点的突变频率是14%，而CCR2的是12%。几个研究也报告了，CRISPR/Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测（即，H2AX免疫染色）中都没有明显的脱靶现象。然而，最近的研究发现，CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象。例如，靶向CCR5的CRSIPR/Cas9系统偶到的在CCR2上的脱靶切除的突变率为5-20%，这是非常接近之前讨论的CCR5靶向的ZFN诱导的突变率。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性，其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配，从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入（插入缺失）。此外，靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标，而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的。已经有报告说，脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服。此外，在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性。病毒为基础的传递ZFN基因可以通过慢病毒和腺病毒进行传递。当前，ZFNs导入体细胞是通过共转染两个慢病毒载体，每个载体编码一个功能性异源二聚体对的一个单体。相反，腺病毒，但不是基于HIV的慢病毒，载体使用与TALEN的基因的传递，因为TALENs的大尺寸和TALE重复序列的种应用。Cas9也是一个较大的基因，并且其酶促死的版本也可以通过慢病毒进行传递，虽然也盛行的Cas9的稳定的表达对于细胞的毒性依然是不清楚的。其他方面ZFNs和TALENs都能够在切割时产生粘性末端，因此可以使用标签绑定，如果具有互补突出部分的双链寡聚核苷酸（dsODN）是可以进行预测的。ZFNs和TALENs都可以在捐赠的质粒的基因组中引入同一个核酸靶向位点来实现。ZFNs和TALENs通过采取同源二聚体的方式从而获得优势，绑定门通过设计实现了重组（Ob-LiGaRe）。这种方法在使用的质粒中倒置了两半的核酸酶的结合位点，这是在没有改变接头区的方向实现的，因此通过相同的ZFN/TALEN碱基对能够阻止连接产物的消化。因为CRISPR产生了一个非粘性末端，直接连接会遇到挑战。最近的文章表明，具有Cas9n的gRNAs的碱基对能够诱导具有徒步部分的DSBs，并且促进dsODN的高效率的NHEJ介导的插入。虽然至今还没有出版，但是进入的转基因大小的DNA能够通过引入在目标质粒的CRISPR/Cas9靶向位点的具有CRISPR/Cas的基因组使用。CRISPR/Cas系统相比较于ZFNs和TALENs具有几个优势，例如易于构建，花费低，并且产物具有可扩展性，并且能够用于多个靶向基因组位点。

转基因技术是指利用DNA重组、转化等技术将特定的外源目的基因转移到受体生物中，并使之产生可预期的、定向的遗传改变。转基因技术应用在人类社会各个领域 中，较为常见的包括了利用转基因技术生产的农作物，以及利用转基因技术生产疫苗等。含有转基因作物成分的食品被称之为转基因食品，其与非转基因食品具有同样的安全性。世界卫生组织以及联合国粮农组织认为：凡是通过安全评价上市的转基因食品，与传统食品一样安全，可以放心食用。一连串基因研究工作开启了人类改造生物的新纪元，这种按照工程设计原理，利用现代生物技术手段达到预期目标的技术体系被称为“基因工程”或“遗传工程”。通常将植物基因工程称为“转基因技术”，所获得的产品被称为转基因植物或转基因作物，有时也使用“遗传修饰生物”或“工程作物”等名称转基因技术是利用现代生物技术，将人们期望的目标基因，经过人工分离、重组后，导入并整合到生物体的基因组中，从而改善生物原有的性状或赋予其新的优良性状。除了转入新的外源基因外，还可以通过转基因技术对生物体基因的加工、敲除、屏蔽等方法改变生物体的遗传特性，获得人们希望得到的性状。这一技术的主要过程包括外源基因的克隆、表达载体构建、遗传转化体系的建立、遗传转化体的筛选、遗传稳定性分析和回交转育等。

两个发音单词不一样WASP 音标:/wɑsp/ 本意是 黄蜂,现在多指代表美国主流价值观的人,通俗来说是指上层社会的白人 crisps 音标:/krɪsps/ 作名词是 油炸薯片,作形容词是 脆的 酥的. wasp读 哇斯普crisps读 克瑞斯普斯 纯手写,望采纳!

什么是CRISPR/Cas9？ CRISPR----Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。 07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的 CRIS

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The Count of Monte Cristo基督山伯爵双语对照词典结果：The Count of Monte Cristo基督山复仇记; [电影]新基督山伯爵; 例句:1.After dinner, the count of monte cristo was announced. 用完晚餐，侍者又来通报说基督山伯爵来访。2.He remembered the count of monte cristo. 他想起了基督山伯爵

《特大城市》（Cities XL）是一款由法国Monte Cristo开发的实时全三维城市建造游戏。《Cities XL》是以前作《梦想大都会》（City Life）的制作经验为基础开发的，但Monte Cristo否认前者为续作。游戏的玩法近似于《模拟城市4》的规划工商住用地、建设和财政管理，外加另收月费的大型多人线上（MMO）模式，让众多的网路版玩家在同一个伺服器——“行星”（Pla）的不同地点建造和管理城市，游览其他玩家的城市和与他们交易，而单机版玩家只能与一家NPC企业交易。 基本介绍 中文名 ：特大城市 原版名称 ：Cities XL、Cities XL: Limited Edition 游戏类型 ：模拟类 游戏平台 ：PC 地区 ：美国、欧洲 开发商 ：Monte Cristo Games 发行商 ：Focus Home Interactive 发行日期 ：2009年10月8日；2009年10月9日（ *** 版） 玩家人数 ：单人；多人 游戏容量 ：DVD X 1（3.7G） 游戏语言 ：英文、中文 游戏介绍,游戏内容,配置要求,游戏评测,升级版本,游戏介绍,游戏特色, 游戏介绍 《特大城市》（Cities XL）是一款媲美《模拟城市》的作品。玩家在如同真实3D地图般世界中打造城市，结合亚洲、欧洲、美洲等建筑物形式与山脉、海滩、岛屿等地形元素，并可设定寒带、热带等不同气候元素。创造城市后，玩家要管理居民满意度，创造合适的工作机会、社会福利、休闲娱乐等，还要满足国民食衣住行等众多需求。 游戏的地域比《模拟城市》系列更大。在《特大城市》中，玩家作为城市的市长，必须考虑模拟市民们的生活环境、生活设施、公共场所、交通问题、工作环境等因素。该游戏有昼夜交替模式，可以查看城市的昼夜的城市状况。总体上来说，该游戏是吸收了《城市生活》和《模拟城市4》的精华。城市生活的三维效果非常不错，可以从任何一个角度观赏城市，以路人的形式观赏、游览城市的每个角落。 《特大城市》着力于开发一款接近现实型的模拟类游戏，就连建立一个建筑物都变的更加的真实化，建造建筑物时由低至高逐步建立，最后完成。摩天大楼都是跟平时生活中的建筑物的设计相同。另外《特大城市》的建筑物非常真实，摩天大楼、工厂、医院、学校、警察局、购物中心、体育馆等等建筑物都是非常逼真，每一个建筑物的周围都有一些交通工具。如警察局的警车、医院的救护车，工厂的货车，家庭的私家车等等。另外，该游戏拥有的农业区，模拟市民可以开发自己的农场，然后到附近的城市进行销售，农业区的环境要求很高，不可以位于生活区和工业区附近。生活区的用水和工业区的污染都会导致农业区无法生存。 Monte Cristo强调游戏不仅可以单机游玩，还可以连线与其他玩家互动；单机游玩计画采一次付费买断的方式。至于玩家若要使用线上游戏模式的星球模式城市模拟器，则必须支付月费，目前定价为1个月7欧元，季卡、每月5欧元，半年卡、每月4.5欧元。付费使用星球模式的玩家将会持续收到《特大城市》升级内容，包括更多的建筑物与地物模组等。线上游戏模式除了包含单人游玩打造城市的完整内容外，玩家还可以与其他玩家相互交易资源，共同合作建设巨大建筑物，拜访其他玩家的星球等；玩家的行动也将影响星球的生命，例如玩家创造的人口与污染都可能对世界造成影响。 在《特大城市》内有仿真的3D地图，不可思议的独特建筑和纪念馆，以供玩家来打造自己的城市。这些建筑都是基于美国，亚洲和欧洲的建筑风格之上。地图上还有各种地形：山地、山丘、峡谷、海滩、岛屿，还搭配了热带、沙漠、地中海、温和等等气候。玩家还须合理处理社会服务，休闲设施，特殊事件和其他就业机会，来满足人民的食物，衣物，就业，娱乐需求等问题。游戏里还可以建造动物园，公园，居民区，以及运输系统等等。如果你想成为市长或是城市经理的话，本作会有一系列新鲜 *** 的挑战，等著玩家来完成！ Monte Cristo为《特大城市》所推出的 *** 版在标准版基础上增加了以下额外内容： 1、六处专有的标志性建筑 2、五幅用于单人模式的专有地图 3、两处永久性巨型结构 4、特殊附加组件 - 你的虚拟形象和网路区分T恤 5、《特大城市》大幅面海报 6、三张原始的《特大城市》明信片 游戏内容 一、交通系统工程 1）交通工具 Cities XL的交通工具Cities XL的交通可以说是游戏的一大亮点。该游戏宣扬的三维效果就连小小的交通工具都会变得逼真不已。Cities XL的交通工具非常完善。拥有公车、轮船（客轮、货轮）、飞机、货车、捷运（捷运）等。充分地展现了城市交通的繁忙、应有尽有的特性。Cities XL的交通工具可以出入邻近的城市，带动城市之间的交流、贸易。展现了现实生活中城市与城市之间的贸易发展、交流的重要性。 2）道路交通 Cities XL的道路非常的完善，除了拥有火车铁轨、捷运铁轨、高速公路、普通公路这些基本的道路以外，还有桥梁、隧道等重要的交通要道。 Cities XL的道路弥补了模拟城市4当中平坦、直直的道路。玩家可以方便地建造高架道路。使交通便捷，也弥补了现实生活着存在的道路结构。 3）内部交通与外部交通 一个城市有了道路和交通工具，当然需要跟邻近城市的连线了。道路连线可以促进城市之间居民的到访、本地工业、农业区的贸易。以及带动两地的旅游等，是非常重要的条件。内部交通泛指本城中居民的工作、娱乐等连线。外部交通指邻近城与本城的连线，让各城居民到访、贸易、旅游等。 二、环境系统 Cities XL可以像模拟城市4一样进行昼夜变化，而且比模拟城市4还要强大。Cities XL拥有浩瀚星空，每当夜晚来临，天空就会出现无数的星星，好比真Cities XL星球正的生活环境，而白天同样出现太阳。使得真正的感觉到城市正在变化。Cities XL还拥有雾、太阳的运动、视野景观等自然景观。并且，楼房的阴影会随着天空的太阳的位置而发生变化。是一种真实环境感觉。该游戏拥有强大的自然环境，如山脉、峡谷、海滩、岛屿等。让你充分地发挥想像，设计一个强大的城市，模拟市民们可以来往任何一个连通的地方，参加任何地方的聚会、活动、就连明星开演唱会都可以参加。是一个全方面的模拟类游戏。 三、建筑物 Cities XL着力于开发一款接近现实型的模拟类游戏，就连建立一个建筑物都变的更加的真实化，建造建筑物时由低至高逐步建立，最后完成。摩天大楼都是跟平时生活中的建筑物的设计相同。另外Cities XL的建筑物非常真实，摩天大楼、工厂、医院等等建筑物都是逼真不以的，每一个建筑物的周围都有一些交通工具。如警察局的警车、医院的救护车，工厂的货车，家庭的私家车等等。另外，该游戏拥有的农业区，模拟市民可以开发自己的农场，然后到附近的城市进行销售，农业区的环境要求很高，不可以位于生活区和工业区附近。生活区的用水和工业区的污染都会导致农业区无法生存。 配置要求 最低配置要求 作业系统：Windows XP SP3、Windows Vista SP1、Windows 7 CPU需求：Intel Core 2或更高 显示卡要求：nVidia GeForce 9600 / ATI Radeon HD 2600 以上（至少256MB显存） 声音系统：DirectX兼容 DVD光碟：2倍速 记忆体需求：1.5G 硬碟空间：8GB的可用空间 DirectX：9.0c 推荐配置要求 作业系统：Windows XP SP3、Windows Vista SP1、Windows 7 可自由建设的庞大都市 CPU需求：Intel Core 2或更高 显示卡要求：nVidia GeForce 8800 / ATI Radeon HD 3850 或更高（512MB显存或更高） 声音系统：DirectX兼容 DVD光碟：2倍速 记忆体需求：2G 硬碟空间：8GB的可用空间 DirectX：9.0c及以上 游戏评测 《特大城市》可以在地球上建立一个地球级的城市，不过游戏在运行一段时间后会变得慢，游戏对PC硬体配置要求非常高，要建设一个人口百万甚至千万的城市非常困难，一般达到最低配置要求的PC在人口达到50万左右的时候，显示刷新率就会变得很慢。一般达到推荐配置的PC在人口达到200万左右的时候显示刷新率会变慢。 PC版《特大城市》美版封面 升级版本 中文名称：特大城市2011 英文名称：Cities XL 2011 游戏平台：PC PC《特大城市2011》美版封面 游戏容量：DVD X 1 游戏类型：模拟建设、经营 游戏人数：1人、多人在线上 游戏语言：英文 发行区域：美国、欧洲 发售日期：2010年10月14日 制作公司：Focus Home Interactive 发行公司：Focus Home Interactive 输入方式：键盘、滑鼠 对应高清：720P、1080P 对应音效：5.1声道 推荐年龄：全年龄 游戏介绍 《特大城市》的伺服器现已关闭，开发商Monte Cristo也随之破产，然而这并没有阻止Focus Home Entertainment继续在今年10月份发布《特大城市2011》的计画。2010年秋天，玩家可以把目光聚焦在《特大城市2011》的身上，这将会是一款浓缩一切城市建设类游戏玩家期望的优秀游戏。Focus Home Interactive开发的模拟经营游戏新作《特大城市2011（Cities XL 2011）》官方网站正式上线，为了庆祝新网站的落成，他们还公布了这款新作的最新一批游戏截图。 游戏特色 在《特大城市2011》中，玩家将要在真实感十足的3D地图中建造并发展巨大的城市，城市中将会有700多种风格独特的建筑。玩家作为城市的虚拟市长，将要在经济发展、公共运输、住房建设、社区服务、休闲活动和城市里的特殊事件中找到平衡点。在《特大城市2011》中将会有比以往更真实的感受、更有深度和广度的城市以及更加精密的画面细节！ 游戏界面 《特大城市2011》将会再次超越自身的极限：增加数百种全新建筑物，总数超过700种，将要把建筑物的组合之丰富程度带进城市建设类游戏所从未达到的境界。加入多张全新地图，共有45张地图可供玩家建设。新加入公共运输系统（捷运）可以缓解市中心的交通拥堵状况，同时降低污染，增加大众满意度，这也带给玩家全新的城市管理体验。更复杂的赋税系统，将会让学着当市长的玩家们自由地进行调整并确定商业税率。在单人游戏模式下，会有全新的商业用户界面，若是玩家要发展几个不同城市的话，还可以在不同的城市间提交贸易请求。

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克里斯蒂亚诺·罗纳尔多(Cristiano Ronaldo,简称“C·罗纳尔多”或“C罗”）拉丁文,音标： Kris"tiu028cnu0259u(u028c代表A去掉中间横杠）Ronaldo（ru0254"nɑldu0259u）

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英文名称：Cristiano Ronaldo 粤语译音：C.朗拿度 国籍： 葡萄牙 出生日期：1985.02.05 星期一 出生地点：葡萄牙马德埃拉 婚姻状况：未婚 身高： 188cm 体重： 79kg 场上位置：前锋 现效力球队：曼联 曾效力球队：里斯本竞技 国民队 场上编号： 7 转会记录： 2003年8月12日以转会费1224万英镑由本菲卡转入曼联 首场英超联赛：2003年8月16日代表曼联队主场5：1胜博尔顿队 星座：水瓶座 属相：牛 最喜欢的颜色：白色 儿时绰号：克鲁伊维特(当时荷兰的克鲁伊维特名声鹊起) 少年偶像：马拉多纳 偶像：菲戈和亨利 最想遇见的人：迈克.泰森 最喜欢的电影明星：尚格云顿 最喜欢的电影：第六感 勇闯夺命岛 最喜欢的女演员：安吉丽娜·朱丽 最喜欢的食物："Bacalhau a Braz"（一种葡萄牙食品，主料是鳕鱼，辅以土豆和炒鸡蛋） 最喜欢的饮料："Santal" (一种当地的果饮) 最喜欢的音乐：舞曲 最新的一张CD： "Almas del Silencio"（里奇·马丁） 个人简介： 与足坛第一前锋同名，身披足坛第一人气明星贝克汉姆在曼联留下的7号，世界足坛最炙手可热的新星被昵称为小小罗，2003年夏天年仅18岁的小小罗以1224万英镑的身价从里斯本竞技转会曼联，开始延续曼联7号的神奇之路。 克里斯蒂亚诺-罗纳尔多和菲戈是老乡，他们都来自葡萄牙盛产白葡萄酒的小岛马德埃拉，他的职业生涯从家乡的国民队起步，很快，天赋过人的小小罗受到国内豪门的青睐，被国内豪门里斯本竞技发掘出来，并在2002年9月打上了第一场葡超联赛，25场进3球的成绩对一个17岁的孩子来说已经足够完美。 2003年8月，小小罗以1224万英镑的价格由本菲卡转入曼联，2003-04赛季小小罗在各项比赛中出场39次，并在对米尔沃尔的足总杯决赛中首开纪录，为曼联捧杯立下头功。赛季末小小罗被授予曼联俱乐部为奖励年轻球员特设的“巴斯比爵士最佳球员奖”。 在葡萄牙国家队，2003年8月20日，他在对哈萨克斯坦的友谊赛中首次代表国家队上场。在2004年葡萄牙欧锦赛上，小小罗的技术和速度给球迷留下深刻印象。2004-05赛季，小小罗表现一般，和曼联一起两手空空。

克里斯蒂亚诺·罗纳尔多（Cristiano Ronaldo），1985年2月5日出生于葡萄牙马德拉岛丰沙尔。简称C罗，葡萄牙足球运动员，司职边锋可兼任中锋，现效力于西甲皇家马德里足球俱乐部，并身兼葡萄牙国家队队长

这不是英文，是拉丁文音标： Kris"tiAneo(A去掉横杠——， e反写）

C 罗纳尔多

Cristiano

上面3个说的大概都对了

Cristiano常见英文名音译是基斯坦奴，克里斯蒂亚诺。Cristiano代表是基督的追随者，是个男孩子用的英文名字，最早出现于丹麦语、法语，Cristiano是个常用的名字，这个名字寓意浪漫、开阔、迷人。此英文名字翻译为基斯坦奴，读起来柔和又好看，且该名由9个字母组成，Cristiano给人的印象是浪漫、开阔、迷人。Cristiano出自丹麦语、法语，这个名字在国外较为常见。基斯坦奴的意思是基督的追随者。

would have down fewer workerdown算什么呢？

b are facing the unemployed 是失业人员face the threat是面临。。。的危险用进行时表示事件正在发生

CristianoRonaldo是一名葡萄牙足球运动员，现效力于西甲俱乐部皇家马德里，同时身兼葡萄牙国家队的队长。由于其中文译名比较长，因此在香港、澳门和广东，多称他为“C朗”，在中国大陆亦有称为“小小罗”和“C罗”。克里斯蒂亚诺·罗纳尔多早于18岁时已加盟曼联，于2006年世界杯时扬名，其后除为曼联赢得多个主要锦标外，也获得不少个人奖项。在2007-2008球季中，该季个人打进了42球，超越了曼联前中场佐治·贝斯的纪录。亦成为欧洲足球先生和世界足球先生，是首个在英超诞生的世界足球先生。中文名：克里斯蒂亚诺·罗纳尔多外文名：CristianoRonaldo别名：C罗、小小罗国籍：葡萄牙出生地：丰沙尔出生日期：1985年2月5日身高：185cm体重：78kg运动项目：足球主要奖项：2008国际足联世界足球先生2008欧洲金球奖2008欧洲冠军联赛最佳射手重要事件：2003年转会加盟曼彻斯特联队2009-2010赛季转会皇家马德里队现俱乐部：皇家马德里俱乐部球衣号：9号国家队球衣号：7号位置：左右边前卫、左右边锋、中锋

不一样 第一个清音浊化 读b 第二个是纯粹的p

两个证都是信息安全行业的高含金量证书，耗时都差不多，备考时间至少3个月，与CISA认证不同的是，CRISC不能通过学历、授课等方式申请替代年限。我准备通过谷安学院报CRISC考试了，希望一次能过！

在临别时，他面向观众说了：人是要改变了，已经到了说再见的时候。

In one version, Eos (Aurora), the goddess of dawn, fell in love with Cephalus. In jealous distress, Procris ran into the forest. Cephalus searched for her but paused to rest. When Procris crept up to see if he was with Eos, Cephalus thought the rustling in the bushes was an animal and killed Procris with his spear. After accidentally killing his wife, Cephalus was sent into exile on an island. The Roman poet Ovid wrote a detailed account of Cephalus and Procris in his narrative poem the Metamorphoses, Ovid"s version describes Cephalus"s feats as a hunter and the series of crises that occur in the couple"s relationship.

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思卡帕俄罗斯户外世界十大户外登山鞋品牌对比1、Scarpa思卡帕（世界顶级户外登山鞋品牌，屡获国际知名户外用品大奖）2、LaSportiva（意大利顶级户外运动鞋品牌，品质一流，获得多项大奖的明星产品）3、Lowa（德国专业户外运动鞋品牌，德国销量最高的户外鞋品牌）4、Crispi（意大利著名户外登山鞋品牌，MonacoGTX是Crispi徒步鞋中口碑和销量俱佳的一款）5、Zamberlan（意大利知名户外鞋品牌，拥有超过90年的制鞋经验）6、AKU（世界驰名的户外鞋品牌，行销全球27个国家）7、SALEWA沙乐华（欧洲著名户外用品品牌，是众多极限运动员和探险家的选择）8、Vasque（世界知名的RedWing鞋业公司的子公司，提供宽版鞋子的品牌之一）9、迈乐（户外登山鞋、徒步鞋闻名，徒步鞋曾被Backpacker杂志评为北美最舒适、功能性最强的靴子）10、迪卡侬（全球著名的运动用品生产商，在中国已有超过290家专卖店）

《The Count of Monte Cristo》（Alexandre Dumas）电子书网盘下载免费在线阅读链接：https://pan.baidu.com/s/19rbuS7CLr44_N-mBPUrMYQ 密码：t0ny书名：The Count of Monte Cristo作者：Alexandre Dumas豆瓣评分：9.3出版社：Signet出版年份：2005-4-5页数：528内容简介：In the post-Napoleonic era, Edmond Dantes, a young sailor from Marserlles, is poised to become captain of his own ship and to marry his beloved. But spiteful enemies provoke his arrest, condemning him to lifelong imprisonment. Then Edmond"s sole companion in prison reveals his secret plan of escape and a letter with directions to hidden riches on the island of Monte Cristo---a treasure trove that will eventually fund Edmond"s dream of creating a new identity for himself: the mysterious and powerful Count of Monte Cristo.In The Count of Monte Cristo, Alexandre Dumas employed all the elements of compelling drama--suspense, intrigue, love, vengence, rousingadventure, and the triumph of good over evil--that contribute to this classic story"s irresistible and timeless appeal.

歌曲名:Pass Out歌手:Ludacris专辑:The Red Light DistrictTinie Tempah - Pass OutIt"s ok,I"m good,Let"s Go!Yeah (yeah) we bring the stars out,We bring the women and the cars and the cards out,Lets have a toast a celebration get a glass out,And we can do this until we pass out.(So) Let it rain,Let it pour away,We wont come down,Until we hit the ground and pass out!Yeah (i) yeah, i"m in charge now,I"m a star and i bought my fucking cast out,I live a very very very wild lifestyle,Heidi and Audrina eat your heart out,I used to listen to ‘you don"t wanna bring arms house"I got so many clothes i keep"s em in ma aunts house,Disturbing London baby we about to branch out,Soon ill be the king like Prince Charles Child, Yeah!Yeah, yeah and there ain"t nobody fresherSemester to semester, ravin" with the freshers20 light bulbs around my table and my dresserCLK Kompressor, just in case that don"t impress herSay hello to Dexter, say hello to Uncle FesterGot them gazing at my necklace and my crazy sun protectorsG-Shocks i got a crazy don collectionHaters, i can"t fuckin" hear your receptionYeah (yeah) we bring the stars out,We bring the women and the cars and the cards out,Let"s have a toast a celebration get a glass out,And we can do this until we pass out.(so) Let it rain,Let it pour away,We wont come down,Until we hit the ground and pass out!This shit was meant to last me 24 hrs manYeah, They say hello, they say ‘ola and they say bonjour,I"m pissed i never got to fly on a concord,I bin Southampton but ive never bin to Scunthorpe,I"m fucking crazy with the kicks, call me Jean Claude,About to be a bigger star than my mum thought,Cos every day i got a groupie at my front door,Now I drive past the bus i used to run for,Where"s my fucking clap, where"s my encore?I walk alone, cos I was born alone,I chirps her just for fun, I never ever call her phone,I leave her in the club, i never ever walk her home,DL the f"kin foundation, im the cornerstone,I"m born famous,I"m sorta" known,If your son doesn"t,I bet your Daughter knows,Check out my visual, checkout my audio,Extra ordinary, yo, hope you enjoyed the show,Yeah (yeah) we bring the stars out,We bring the women and the cars and the cards out,Let"s have a toast a celebration get a glass out,And we can do this until we pass out.(so) Let it rain,Let it pour away,We won"t come down,Until we hit the ground and pass out!Woh ho, woh ho ho...Uh, Look at me i been a cheeky bastard, Man"im,Look at all the drama we started, Now"imIn here layin" on my back,Sayin" DJ wont ya gimmie one more track(so) Let it rainLet it pour awayWe wont come downUntil we hit the ground and pass out!(so) Let it rain,Let it pour away,We won"t come down,Until we hit the ground and pass out!Pass out (echo)Pass out (echo)http://music.baidu.com/song/2183860

歌曲名:georgia歌手:Ludacris专辑:light poles and pine treesGeorgiaLudacrisATL OSTGeorgia, GeorgiaGeorgia, GeorgiaWe on the grind in... GeorgiaAll the time, it ain"tNothin on my mind but... GeorgiaWe ain"t playin witchaCountry NameCountry SlangFiens at the liquor storeLac CruisinCrap Shootin50 on the 10 to 4Overcast the forecastShows clouds fromt plenty droAnd we ready for war in the state of... GeorgiaDirty WordsDirty BirdsIt"s mean in the dirty southIf you ever disrespect it then we"ll clean out your dirty mouthBulldawgs is clockinThese look out boys is hawkinYou gotta be brave in the state of... GeorgiaI got 5 Georgia homes where I rest my Georgia bonesCome anywhere on my land and I"ll aim at your Georgia domeIf you get in an altercation just hop on your mobile phoneAnd tell somebody you need help in the middle of... GeorgiaWe some ATL thrashersScope your pumpkin and smashaWe"ll come through your hood worse than a tsunami disasterDon"t know who they gonna get or who them robbers gonna hitThats why I keep my Georgia Tech in the state of... GeorgiaWe on the grind in... GeorgiaAll the time, it ain"tNothin on my mind but... GeorgiaWe ain"t playin witchaI"m from the home of the neck bones, black eyed peas, turnip and collard greensWe the children on the corn dirtier than Bob Marley"s pee peeGA the peach state where we stayMy small city"s called Albany... GeorgiaPecan country like catfish with gritsCandy yams and chitlinsGram"s homemade baked biscuitsThe land of classical Caprices and Impala super sportsIngredients in the peach cobbler called... GeorgiaI love the women out in L.A.And the shopping stores in New YorkThe beaches in MIABut they ain"t nothin like that GA red clayLook on your map, we right above FloridaNext to BamaUnder the Carolinas and Tennesse you"ll see... GeorgiaWhere Gladys Knights and the Midnight TrainThe birthplace of Martin Luther KingWhere ass so plump and hips are thickWhere Lac trucks sit on 26"sKnow where your going or your get lostFound on these plum trees in the southThese choppas will tomahawk your top down here in... GeorgiaWe on the grind in... GeorgiaAll the time, it ain"tNothin on my mind but... GeorgiaWe ain"t playin witchaNow I was born in the belly of the bottom of the map,Where the wet paint drip jelly on pirelliz an the chrome on the Chevy when I"m choppin in the trapCountry as hell, dey sum warriorz, told sum to spray sumthan the same shape as Florida,Lookin for me boy, ya find me, outta Dougherty County in a small city call"d Albany... GeorgiaWhere dey use to call us sum bamas,An now dey jockin da grammarWatch ya mouf unless you out foe sum mannar,Bunch of hustlaz run on every corna like the Waffle house in AtlantaR.I.P Camoflauge out in Savannah... GeorgiaNow u might come foe vacachun,Leave on probachunHome of da strip club,Known foe da thyck gulzWhere da chickz put tipz in da tip cup,Of thyck chick in a thong wit a big buttWhen it gettin on, won"t b cheap when it on like peachtree,Make a chick take it off like freaknik, down here in... GeorgiaWhen you see dem confederate flagz ya know wut it iz,Ya folkz pick cotton here datz y we call it da fieldI got a Chevrolet on 26"zzz,I"m frum GA.. .GA... GeorgiaWe on the grind in... GeorgiaAll the time, it ain"tNothin on my mind but... GeorgiaWe ain"t playin witchahttp://music.baidu.com/song/14745725

歌曲 we got歌手：ludacrisDTP we got them guns that go...I-20Yea I"m all about that pistol playa, cold blooded killaNiggaz recognize my name, I dub the young dealerYou better tell ya man that with the gages I"m niceIll shoot up yall white shirts until yall look like dikesBut I"m through with all the talking time to show all you niggazI 2-0, I"m like J-Lo...going through niggazDTP we aint plying if you try to get our penA.K"s get ta spraying like...Bottom line that mean I"m bout it, any nigga want it, doubt itBust you in the broad day, on the street that"s fully crowdedFind our hole and fagots there, just for thinking its rapAnd tell that pretty bitch thug we got some pretty big gatsChaka say I"m shot out, and I tend to agreeSo you should what you saying if it"s intended for meSo be careful what you starting, let my fingers do the walkingAnd that oozy get to talking like...Tity BoiHammers, jam "em, snatch "em, grab "emCan the an and fuck "em, damn "emPress him, man him, scared him, teared him, kneed him upBake him, take him, beat him up, I hate I hate, I eat him upA-B-C-E-F shawty is you a G or whatNow it"s just me and my nuts, that"s all I got in this worldI"m pulling pistols out my stomach and throwing them bitches up like earlServing the club, head shot, scattered, covered, run, scram "emI"m 38, hot with a pearl handle...And I"m throwing text like a NBA refI got, all gold guns like they came from I-RAQArtillery, could it be I got all kinds of these pistolsI point my gun at ya homeboy make ya own folks hit yaAnd aint taking no more pictures, if you snap ima clickAnyway, plus I got bullets in the clip the size of Lil FateAnd I"m webbing choppers like heli-coptersYou gon" need hella doctors, when the glok go...Say on the set bitch, better watch your lip that text be quick20 over thurr, Tity over thurr, Luda over thurr, aint no exit trickUs you don"t mess with, we got them guns like action flicksReload with the next clip, I"m the ro nigga to flex with bitchCome on and test this, my gun I"m having sex with shitPut a bullet in (in) shoot it out, got them long horns like Texas bitchLook at my necklace, maybe hit a ngga disrespect this clickMy pistol grip sound like this...now whatWho want that they fucked, when I cock and load the cake, bust bustYall cowards play tough, and my peeps we come to spray stuff upYall lives made up, like ugly hoes with make-up braWe"ll suit you up then toss yo ass in the lake tough nutI"m wrist rocky, like Sylvester StalloneSo thurr for you should invest, in a vest for ya domeCause I know you marks planning on getting me when I"m landingast the nick, but my cannon go...ck a medic, we gon" call yo ass a taxi cabBleedin so hard you"ll need a life size maxi padSo flip the script and tell your woman its your time on the monthA.K. 47 for the niggaz who"s really looking for heaven and a 9 for you chumpsGot killaz in my squad and I"m the nicest one in my groupBut I got bananas for you niggaz and I aint talking bout fruitIll pay your CAB BACK with the BLACK MACKTill your BACK CRACK, got the GAT BACK like...CLAK CLAK CLAKSwallow a hallow make "em digest with a 50 caliberYo futures not looking so good, tomorrows not on your calendarI, do away with the amateurs, they breathing too longIll leave "em coughing like the sound effects you hear in this songMy Shotguns are cold and hard, but my Desert is easyAnd my triggers are always talking about some squeeze me, squeeze meAnd for these fakers talking greezy, I"m starting the showMy Oozy got a drum roll, it goes...http://music.baidu.com/song/8249770

歌曲名:Loverboy歌手:Mariah Carey Featuring Da Brat. Ludacris. Twenty Ii. Shawnna专辑:The Remixes"Loverboy""Billy Ocean""Album : L.I.F.E. (Love Is For Ever)"I don"t know what you"ve gotbut it plays with my emotionsI want you so muchDarling I want to hold you nearwant to whisper sweet and tenderin your ear Can"t stand the thought of youwith somebody else Got to have your lovegot to have it all to myselfI say yeah yeah yeah yeahWanna be your lover lover uhmmWanna be your lover lover lover boyLover lover yeahWanna be your lover lover lover boyToo far gone it"s hard to stopBaby you"re my dream in motionand I won"t give up Uhmm Teasing mewith your fire My finger"s on the triggerYour the one I desireCause I have this feeling feelingfrom nobody elseGot to have your tendernessall to myselfI say yeah yeah yeah yeahWanna be your lover lover uhmmWanna be your lover lover lover boyLover lover yeahWanna be your lover lover lover boyAnd I want you reallybut the thing is there"s nothing I can sayTo stop you darlingfrom running running awayWon"t you stay stay stayI wanna be your loveI wanna be your loveI wanna be your loveI gotta be your loveI wanna be your loveAnd I can"t stand it baby uhm uhm...http://music.baidu.com/song/7900648

San Cristobal圣克里斯托瓦尔双语对照词典结果：San Cristobal[地名] [菲律宾、美国] 圣克里斯托瓦尔; 以上结果来自金山词霸

CristobalValderramaCristobalValderrama，导演、编剧、副导演/助理导演，主要作品《同居损友》、《Juegodeverano》。外文名：CristobalValderrama职业：导演,编剧,副导演/助理导演代表作品：《同居损友》合作人物：CristobalValderrama电影作品

CristobalKrusenCristobalKrusen是一名导演、编剧、制作人、演员，主要作品有《票据托收者》《最终解决》。外文名：CristobalKrusen职业：导演、编剧、制作人、演员合作人物：丹尼·特乔代表作品：《票据托收者》《最终解决》

奢侈品牌Balenciaga（巴黎世家）。这个中文译名巴黎世家的奢华品牌并不出自法国，实际上是在1919年出自西班牙的天才设计师Cristóbal Balenciaga之手。 Cristobal Balenciaga 曾被尊称为 “设计师中的设计师” ，作为一个冷峻而且稳健的天才，也是时装界里难得的全才人物，他用典雅、富丽、细致的风格，成为了巴黎时装界的一代宗师。 五十年代的欧洲，他蜚声海内外，创造了许多高级时装的奇迹。他的语录和设计方法都曾影响过日后许多的时装大师，无数的设计者们都曾以进入Balenciaga的设计室为荣。 纪梵希、古海热和安伽罗等人都是他的学徒。 有客户反映，“实在不知道该如何穿着这些衣服去洗手间！” 但是这些革新举措仍然替他赢得“ 时尚 界的毕卡索”这样的美誉。 连Christian Dior 都曾如是崇拜道： “高级时装就像是交响乐，指挥家就是Cristobal Balenciaga，我们这些设计师就是听从他指挥的音乐家。” Cristóbal Balenciaga 1895年出生在位于西班牙圣塞巴斯蒂安附近一个名叫“Getaria”的不起眼小渔村里，他的母亲是名普通的女裁缝。所以从小他就跟着妈妈学会了西装剪裁等裁缝手艺。还曾经仿照邻居奶奶的衣服，缝了一套套装出来。 16岁的时候，少年Balenciaga孤身来到法国学习法语；17岁时，出于对自己才华的肯定，他回到家乡开了一间以自己名字命名的时装屋C.BALENCIAGA。由于出色的设计和剪裁，这个品牌得到了西班牙王后的青睐，在她的支持下，Balenciaga迅速在西班牙贵族阶层流行开来，而这个时候Balenciaga还不满20岁。 与此同时，他在巴黎结交了众多大师级的设计师，Jeanne lanvin、 Coco Chanel等都成为他终生相伴的至交好友。不过后来西班牙内战，Cristóbal Balenciaga搬去了巴黎，并在那里开设了BALENCIAGA时装店，至今总部都同样在巴黎。 Cristóbal Balenciaga擅长利用 视觉错觉与剪裁巧妙结合，让身形看上去更加的完美。 比如彻底去掉腰线的外套，在肩部做平滑肩线处理，藏起不够纤细的腰身，突出腿型的比例，这也就是今时今日都被热捧的“茧形”廓型。 他认为， 服饰之美，是与身体的完美结合，“a beautiful dress is one which follows the body and only the body”。 Cristobal Balenciaga的设计差不多是以“反 Dior”的形式出现他拒绝使用垫肩、或者隐形支架来做衣服，设计强调宽松、自然，垂直，不在腰部做过多的装饰。 这也是后来流行的茧型大衣、方形大衣、蓬松夹克、垂背日装裙、斗牛士式开衫，还有前短后长的孔雀晚礼服。尽管最初这些服装都是为高级定制界的顾客服务，但是新样式很快就普及开来。 或者仿照孔雀与钟罩的形态，制作出前短后长的礼服，看上去简约爽利的线条里，华美的褶皱却藏在裙摆内部。 既突出身形，又不至于让过分装饰成了服装与身体本身的美好。处于战后的50年代，经历了战争洗礼的女人是渴望极尽华美之能事的。BALENCIAGA的简约依然能够博得大众的欢心，受到大家的认可。 还有1958年推出的娃娃裙（Baby Doll Dress），伞状裙型装饰了褶皱的裙摆，最大限度藏起身体过分丰满或过瘦的缺憾，这一设计也是现在时装潮流中比比皆是的廓型。就算是胖姑娘穿上Cristóbal Balenciaga的设计，也能在视觉上变得恰当合身。 此外，Cristobal Balenciaga 还是未来极简主义的先锋。早在 1967 年他曾设计过一条只有三处缝合的婚纱，就是来自遥远年代的摩登。 线条毫无拖沓，一气呵成，配合飞碟一般的帽饰，卸掉了以往印象中婚礼礼服的繁复华丽，仅仅留下圣洁如雕塑一般的白色。 在BALENCIAGA当时的客户名单上全都是声名显赫的大人物，比如比利时王后Fabiola、摩洛哥王妃Grace Kelly、温莎公爵夫人、影星Ava Gardner、Ingrib Bergman等等。 他说过，“一个服装设计师必须是：设计的建筑师，形态的雕塑家，色彩的画家，和谐的音乐家和度量的思想家”。 在业界，服装设计师的工作主要是在2D平面上绘制草图，真正的打版与裁缝则交给专业的打版师和样衣师负责；然而，Cristobal Balenciaga 早先于欧洲受过的裁缝训练，令其能精通所有的制衣步骤，从绘图、裁剪、立体塑形到缝纫成品皆游刃有余。 除此之外，Cristobal Balenciaga更认定 “布料” 是决定一切设计的起始，各种不同的织物以相异的质地、韧性和垂直度，启发Cristobal Balenciaga创造前所未有的新颖廓形。 连Coco Channel都曾赞誉说道： “Cristobal Balenciaga是世界上最具实质意义的女装设计师，只有他有能力裁剪布料、组装成品并亲自手缝成型，其他人跟他比起来，都只不过是 时尚 设计师而已。” 可见Cristobal Balenciaga 对于时装设计的热爱与思索。 在Cristobal Balenciaga的每一季发布会上，没有音乐，长达一个半小时的秀场上，模特们采用一种“高傲而欢呼“的步伐，避免与客户们目光接触，而Cristobal Balenciaga自己全程藏在幕后，甚至不愿意在走秀结束后出来谢幕。 才华是一种命里自带的东西，有就有，没有就没有。真正成为大师的人，多少有自己的固执和坚持，知道什么是想要的，什么是多余的。 时至60年代，当青年文化开始蓬勃发展时，Cristobal Balenciaga不愿意顺从当时的潮流（如迷你裙、太空时代风格服饰等等）而改变自己的设计风格，索性将经营甚久的奢华时装屋关闭。 他抗拒“成衣”的流行，看不惯衣服被大批量规模化复制生产，无奈地告诉忠实客人“可以改去Givenchy那边买衣服” 。 1997年开始执掌Balenciaga，用短短3年力挽Balenciaga的天才设计师Nicolas Ghesquiere时常在成衣秀中将一些Cristobal Balenciaga的经典设计，重新演绎，赋予新生。 虽然自创立之时，Balenciaga便一直以其 Haute Couture 高级定制时装为人所知。但令人遗憾的是，自从1968年后，就再也没有Balenciaga Haute Couture的存在。Demna Gvasalia曾表示2020年7月会正式重启高级定制系列。 他表示“高级定制时装是 Balenciaga 的基石。我有责任以充满创意的方式让定制时装回归品牌。对我来说，高定服饰是一种未经 探索 的自由创作模式和创新平台，它不仅为服装制作提供了另一种可能性，也将会让日趋现代化的 Balenciaga 重返品牌本源。定制时装高于潮流，它传达出一种美，一种诠释最高级别审美和质感的美。” ——Demna Gvasalia 2021年的重返高定秀如期而至，尽可能地还原了当年Cristobal Balenciaga时代的沙龙形式。 这既是对Cristobal Balenciaga时代的一种缅怀，也是开创一个新的时代，把过去及现在融合在一起。

克里斯

相互交错，每两个之间都与电线，现在强调之间的联系

myfavourite丨ettCrisA中文意思？这个问题我建议你还是去查一下词典 就知道这两个字意思了

CristinaAmaralCristinaAmaral是一名演员，主要作品有《冒牌金发女郎》、《海盗心灵》。外文名：CristinaAmaral合作人物：CarlosReichenbach代表作品：《冒牌金发女郎》职业：演员

歌曲名:Brazil歌手:Cristina Donà专辑:The Emi Album CollectionBrazilBelliniBrazil..bailarBrazil en fiesta, Brazil bailarFeel the rhythm"s gonna make you danceTill the morning lightLet us feel the heat all through the nightWhen we are dancing side by sideI can feel the heat all nightEvery move and every stepLike a maniacBrazil en fiesta, Brazil bailarFeel the rhythm"s gonna make you danceTill the morning lightLet us feel the heat all through the nightBrazil en fiesta, Brazil bailarFeel the rhythm"s gonna make you danceTill the morning lightLet us feel the heat all through the nightBrazil...wowLet me be the one tonightLet"s dance till the morning lightI wait for your love attackLike a maniacBrazil en fiesta, Brazil bailarFeel the rhythm"s gonna make you danceTill the morning lightLet us feel the heat all through the nightBailamos Sao Paulo, bailamos SalvadorBailamos de Janeiro, bailamos en BrazilLet"s come togetherand have some funNo time for wastingLet"s dance until the morning sunBrazil en fiesta, Brazil bailarBrazil en fiesta,bailamos en BrazilBrazil en fiesta, Brazil bailarFeel the rhythm"s gonna make you danceTill the morning lightLet us feel the heat all through the nightBrazil en fiesta, Brazil bailarFeel the rhythm"s gonna make you danceTill the morning lightLet us feel the heat all through the nightBrazil bailarhttp://music.baidu.com/song/8136832

对 对 对

可以一起用The global financial crisis.全球金融危机。

D

因为金融危机，5星级酒店一夜收费6000元的日子一去不复返了 选B when

B. when 用when（引导词）用来引导days（先行词）时间，这里是一个定语从句，翻译后就是：由于金融危机，那种在五星级宾馆一晚6000元日子已经不存在了

2007-2008的金融危机，也被熟知为全球金融危机，或者2008金融危机，被很多经济学家认为是继1930的大萧条之后的之严重的金融危机。开头部分，供参考。

crispi的户外鞋在业界被认为是顶级档次的鞋子。 crispi专注于生产高品质的户外鞋，采用优质的材料和先进的科技，为户外爱好者提供舒适、稳定的鞋子。 此外，crispi的鞋子还具有时尚的外观和防水等功能，在市场上备受消费者喜爱。

我就发现有些人老拿冠军说事儿。。我佛了，两届msi冠军难道不是冠军吗？装眼瞎吗？小明我认为是他们三个里面最厉害的那个人，还要说吗？

CRISPR/Cas9的出现使得高效进行精确、有针对性的基因组修改变得比以往更加容易。Cas9已被修改，使研究人员 能够敲除 ， 激活，抑制， 甚至 图像你最喜欢的基因 。但是，在提供如此广泛的 Cas9 试剂时，您如何选择适合您特定实验的 Cas9？此博客文章将帮助您熟悉通过 Addgene 存储库提供的广泛 Cas9s，并便于选择适合您使用的 Cas9 试剂。 在任何CRISPR实验中，要做的第一件事就是确定你到底想做什么。您是否试图永久淘汰细胞类型或生物体中的基因？您是想在不永久修改基因组的情况下减少特定基因的表达吗？尝试在特定点激活是否更有意义？在特定位置修改表观基因组怎么样？正如您所料，这个问题的答案将极大地影响您决定您的实验需要哪个 Cas9。以下是使用Cas9和特定Cas9进行的几种常见基因操作的简要摘要。 ****敲出细胞或动物是通过共同表达特定于要瞄准的基因和内分泌酶Cas9的gRNA而形成的。基因组靶点可以是任何 +20 核苷酸 DNA 序列，只要它满足两个条件： 1） 序列是独特的相比，其余的基因组。2） 目标位于原空间器相邻图案 （PAM） 的正上游。SpCas9 是一个常见的选择，当有一个合适的目标位点，很少关心偏离目标的影响（例如，最佳 gRNA 设计与最小的同源位点在整个基因组）。Addgene 携带各种 含有质粒的 SpCas9，这些质粒 经过优化，可在细菌、酵母、蠕虫、果蝇和哺乳动物中进行基因组工程实验。**** 通过正确设计您的 gRNA 序列，可以增强 Cas9 介质的特异性。即选择基因组中其他部位具有最小同源性的目标序列。已采用各种方法进一步提高Cas9的特异性。例如 ，Cas9-nickase （Cas9n） 利用了 Cas9 通过两个核糖域（RuvC 和 HNH）的组合活动进行双链断裂 （DSB） 这一事实。将两个关键酶残留物之一转换为丙氨酸（D10A 或 H840A）会生成一个"刻痕"Cas9，无法生成双链断裂。因此，需要两个正确定位的Cas9n分子才能在靶点高效创建DSB，与野生型SpCas9相比，它大大提高了特异性。 虽然Cas9n肯定比野生型SpCas9更具体，但当只有一个gRNA与Cas9n表达时，在目标地点仍然能够检测到DSB。这意味着 Cas9n 有可能在其任何 gRNA 的偏离目标站点之一绑定并导致一个因德尔。人们可以通过使用核酸酶死Cas9（dCas9）融合到非特异性内分泌酶FokI来克服这一限制。福基只有在变暗时才会切开目标DNA。因此 ，dCas9-FokI 基本上需要在发生任何裂痕之前，在目标部位正确定位两个dCas9-FokI分子;dCas9-FokI在单个gRNA指定的偏离目标处切割的可能性比Cas9n要小得多。 ******Cas9n 或 dCas9-FokI 方法的一个明显局限性是，它们都需要两个合适的目标序列才能有效地生成 DSB。几个实验室，包括张峰在布罗德研究所的实验室和Keith Joung在MGH的小组，已经使用结构生物学来识别关键残留物，以调解Cas9的切开目标点的能力。所谓的 增强 Cas9 （ 张）或 高保真 Cas9 （ Joung ） 在目标点与野生型 SpCas9 具有可比的活动，但大大减少了偏离目标的活动。这些 Cas9 变种可增强特异性，而无需在目标点内需要两个或多个相邻目标点。更多关于增强特异性Cas9变种的信息可以 在我们的博客文章中找到，题为"增强CRISPR目标特异性与eSpCas9和SpCas9-HF1"。 ****** 通过一系列细菌中的阳性选择屏幕，Keith Joung 的小组识别出识别新型非 NGG PAM 序列 的 S. Pyogenes Cas9 突变体（VQR、EQR 和 VRER Cas9 变种）。 重要的是，VQR、EQR 和 VRER Cas9 变种能够修改无法使用野生型 SpCas9 进行修改的基因组位点，并且它们对 PAM 变异的特异性类似于人类细胞中几个基因组靶点的野生型 SpCas9。包括VQR、EQR和VRER SpCas9变种，有效地使人类基因组中CRISPR/Cas9的目标范围翻倍。更多关于各种合成Cas9s可以通过Adgene可以找到我们的博客文章题为 "PAM要求和扩大CRISPR超越SpCas9"。 除了典型的 NGG PAM 序列之外，其他 Cas9 同源已从各种细菌物种和许多结合的 PAM 序列中分离出来。所谓的"非Sp"Cas9s可能更适合你的实验，原因不是PAM序列。例如，金 黄色葡萄球菌（SaCas9）的Cas9 编码序列比SpCas9小约1公斤基，SpCas9允许包装成腺相关病毒（AAV），这是目前基因治疗的黄金标准。重要的是要记住，非SpCas9s只与来自同一物种的tracRNA和crRNA（或合成gRNA）兼容。更多有关通过Addgene提供的各种非SpCas9的信息，可以在我们的博客文章中找到题为 "PAM要求和扩大CRISPR超越SpCas9"。 注意：Cpf1 也称为 Cas12a。 ********上述大多数Cas9变种已用于通过 同源定向修复（HDR）途径 生成特定的基因编辑。有关如何使用 CRISPR 生成特定基因编辑的更多信息，请参阅我们的 CRISPR 指南 页面。******** Cas9的一个独特方面是它能够结合目标DNA，而独立于它 切割 目标DNA的能力。换句话说，含有破坏 DNA 的突变的 Cas9 （ SpCas9 的 D10A 和 H840A ）仍然能够结合目标 DNA 。此外，所谓的核糖核酸死Cas9或"dCas9"可以用作平台，通过将各种货物直接融合到dCas9，将各种货物运送到特定的DNA位位。dCas9的这一特性已被利用来定位各种蛋白质以靶向基因，包括转录活化剂和转录抑制剂。 早期在细菌中 使用 dCas9 的实验表明，将 dCas9 定位为转录启动点足以通过阻止转录启动来"抑制"或"击倒"转录。在哺乳动物细胞中，强力抑制需要将带有转录抑制剂标记的dCas9定位到感兴趣的基因的发起区域。在敲除目标基因对细胞有毒时，您可能需要考虑使用基于 dCas9 的抑制剂，包括 dCas9-KRAB。在 Addgene的网站上 可以找到抑制各种物种和细胞类型目标基因的质粒。 **********基于 dCas9 的激活器阵列非常多样化。最简单的激活器由 dCas9 融合到单个转录激活域（通常为 VP64）。最近开发出第二代活化剂，这些激活器使用几种不同的方法改变基因表达。例如 ，"SunTag"系统 通过共同表达标记为 dCas9 的表位和抗体活化剂融合蛋白，促进将多个激活领域招募到同一遗传细胞位。 协同激活介导器复合物 由 dCas9-VP64 融合和能够与附加的 RNA 绑定转录激活器交互的修改 gRNA 组成。额外的质粒激活各种物种和细胞类型的靶基因可以在 Addgene的网站上 找到。********** 您选择了适合您的实验的 Cas9。你接下来做什么？这里有一些考虑，这将有助于您推进您的CRISPR实验。 设计或选择 gRNA - Addgene 可能已经携带了来自您最喜爱的物种的" 验证 gRNA"。 经过验证的 gRNA 已在实验中成功使用，并发表在同行评审的期刊上，在开始 CRISPR 实验时将节省您的实验室时间和资金。如果您需要为您的实验生成新的 gRNA，您可以从各种 "空 gRNA 向量" 中进行选择，并使用众多免费 gRNA 设计程序之一设计您的 gRNA 定位序列 。 我应该使用哪种类型的表达系统或交付方法？为您的实验选择合适的Cas9试剂只是一半的战斗 - 现在你必须选择适当的表达系统，并将Cas9交付给你的目标细胞！Addgene 携带各种 Cas9，其中含有质粒，这些质粒经过优化，可在不同物种和细胞类型中表达，包括（但不限于）细菌、酵母、植物、果蝇、蠕虫和哺乳动物（这里按模型有机体浏览质粒 ）。对于难以转染的细胞类型，您可能需要考虑使用伦蒂病毒将Cas9传送到目标细胞。更多关于哺乳动物细胞各种输送系统的信息可以在我们的博客文章中找到，题为 "CRISPR 101：哺乳动物表达系统和交付方法"。 ************验证您的基因组编辑 - 一旦您将 Cas9 和 gRNA 传送到目标细胞，是时候确认目标序列已修改！确切的协议可能因您的特定实验而异，但在我们的博客文章 "CRISPR 101：验证您的基因组编辑" 中可以找到您验证基因组编辑的各种方式的广泛概述。************

克利斯普

歌曲名:Midlife Crisis歌手:Faith No More专辑:This Is It: The Best of Faith No Morego on and wring my necklike when a rag gets weta little disciplinefor my pet geniusmy head is like a lettucego on and dig your thumbs ini cannot stop givingi"m thirty-somethingsense of securitylike pockets jinglingmidlife crisissuck ingenuitydown through the family treeyou"re perfect, yes, it"s truebut without me you"re only youyour menstruating heartit ain"t bleeding enough for twoit"s a midlife crisis...what an inheritancethe salt and the kleenexmorbid self attentionbending my pinky backa little disciplinea donor by habita little disciplinerent an opinionsense of securityholding blunt instrumenti"m a perfectionistand perfect is a skinned kneeyou"re perfect, yes, it"s truebut without me you"re only youyour menstruating heartit ain"t bleeding enough for twoit"s a midlife crisis...............http://music.baidu.com/song/29237428

克里斯·安吉尔（Criss Angel），美国著名魔术师，转型为大众传媒巨星。安吉尔可总以一身怀旧礼服登场，身边靓女和孩童相伴，上演老套的戏法，偏好于痛苦、极大的危险以及露骨的性。安吉尔的魔术总是和利润率、再投资、多样化紧密相连。 中文名： 克里斯·安吉尔 外文名： Criss Angel 别名： 克里斯托弗·尼古拉斯·撒丹踏克 国籍： 美国 出生地： 美国纽约长岛 出生日期： 1967年12月19日 职业： 魔术师 代表作品： Mindfreak S1.2.3.4 目录[隐藏] 人物简介 获得荣誉 人物档案 详细介绍 奇幻的表演 克里斯 安吉尔 评价 发行专辑 主持WWE RAW特别嘉宾 主持节目 电视剧 英文介绍 中文介绍 街头魔术 第二季 人物简介 获得荣誉 人物档案 详细介绍 奇幻的表演 克里斯 安吉尔 评价 发行专辑 主持WWE RAW特别嘉宾 主持节目 电视剧 英文介绍 中文介绍 街头魔术 第二季 [编辑本段]人物简介 克里斯·安吉尔，世界街头魔术之神，唯一一个2001年到2004年连续获得世界最佳魔术师称号的人，其前卫的风格和匪夷所思的魔术令世界人惊叹，但本人具有自毁趋向，性格极其怪异。自残魔术天下第一，幻觉魔术举世无双。唯一一个好莱坞愿意为他一人修建剧院的魔术师，唯一一个能够连续2次上美国时尚封面的封面人物。 [编辑本段]获得荣誉 ●全球唯一同时登上魔术杂志及GENII杂志的第一人 ●纽约邮报给予四星级★★★★的高分评价表演 ●连续两次打破魔术百年宗师胡迪尼维持近80年无人能破的纪录 ●《克里斯安吉尔的日本表演》荣获2004年Telly奖的最高荣誉。 ●史上唯一两度荣获年度魔术师大奖 [编辑本段]人物档案 姓名： 克里斯·安吉尔 （Criss Angel） 生日：1967年12月19日 原名:Christopher Nicholas Sarantakos(克里斯托弗·尼古拉斯·撒丹踏克斯) 出生地：East Meadow, New York, U.S.（美国纽约的东梅多郊区） 出道年份：1997年 国籍：美籍希腊后裔 [编辑本段]详细介绍 他是一个魔术师中魔术师，音乐家，逃生术表演专家和特技表演家。 他创立的《Criss Angel Mindfreak 》电视节目，在2005年7月首映，三季节目都获得了空前的成功。前2季中节目包括：水上行走、空中飞人、磁悬浮以上卢克索酒店、在观众面前表演脱身、切割自己身体还有压路机压躺在玻璃碎片上身体。 而在第三季的拍摄中，克里斯·安吉尔意外受伤，并停止了三个星期的拍摄。 克里斯·安吉尔，这位广受崇拜的英雄想转型为大众传媒巨星。安吉尔可谓是魔术界的摇滚明星，总以一身怀旧礼服登场，身边靓女和孩童相伴，上演与众不同的戏法——偏好于痛苦、极大的危险。安吉尔的魔术总是和利润率、再投资、多样化紧密相连。你期待看到李（Tommy Lee），但出现了特朗普（Donald Trump），只是头发更漂亮了。 克里斯安吉尔，是一个非常棒的艺术家，不仅仅限于魔术本身而言，在《mindfreak》他用自己的魔术和对生活、世界的思考融入其中，完全可以成为一个不折不扣的魔术思想家， 每表演一个大型魔术，他都要试着追寻其历史、其来龙去脉，然后加入自己前人不敢的东西，形成自己的与众不同的、令人叹为观止的魔术风格。 然而，魔术师要摇身一变成为超级巨星简直是“天方夜谭”，工业贸易杂志《天才》（Genii）的编辑考夫曼（Richard Kaufman）这样认为。在他看来只有6位魔术师做到了，从霍迪尼到布兰恩（David Blaine），并且“安吉尔将会是下一个”。 明年春天，安吉尔可能展开3个月的亚洲巡演，预计收入可达300万美元。同时，魔术、DVD光盘、品牌赞助、宣讲会、美国巡演、拉斯维加斯赌场表演计划都在筹备过程中。安吉尔年收入150万美元，他的助手们梦想突破大卫·科波菲尔（David Copperfield）5,700万美元的年收入。“电视节目提供给我一种内 置的行销方式。不花钱进行再投资，我们就创造不出更多的艺术”安吉尔如是说。更多的艺术作品意味着更多的金钱。 克里斯·安吉尔是谁继太阳马戏团及席琳.狄翁之后，还有这么大的魅力让拉斯维加斯饭店愿意花费上亿元特别为他的演出专门建造一间剧院？这个人曾被MTV台总监赞赏为“拥有掌握未来魔术新潮流的强人”— 克里斯·安吉尔(Criss Angel)，去年才刚荣获第二十二届路易奖及第二十五届Telly奖的双料赢家。 2001年，克里斯·安吉尔于纽约地下世界剧院(The World Underground Theater)的一场魔术表演不仅引起了纽约报评的强烈报导，在魔术界掀起强烈飓风震撼，更颠覆了观众对魔术的一切认知，圆型的舞台立于观众席中间，完全没有所谓的后台可以隐藏机关，观众可以近距离从任何角度观赏演出，不仅观众会蹦出《他是怎么办到的？》，就连同行都不禁要问《他为什么做得到？》，仅仅两年就演出超过六百场的演出，场场爆满，纽约邮报更于首演后马上毫不吝啬的给予四颗星高评价，纽约杂志更是大大调侃了舞台幻象魔术佼佼者大卫·科波菲尔 、街头超自然魔术首创大师大卫·布莱恩及脱逃魔术祖师爷哈利·胡迪尼 等各类型魔术代表大师来极力赞赏克里斯·安吉尔的演出，因为他的表演不仅涵盖三者的精髓，而功力及创意也远远超过他们。 [编辑本段]奇幻的表演 克里斯.安吉尔的长发、黑色眼影、黑色指甲等怪异特立独行装扮就如同他另类无法预料的演出，比如高达十层楼的倒立脱逃秀仅花2分26秒完成，用八个吊勾穿过背上肌肉悬空高挂五个多小时，待在灌满水约电话亭大小的空间长达24个小时…..，而毫不受空间限制的克里斯，在街头的随性演出更让人瞠目结舌，轻松漫步走上大楼的外墙、跳入小朋友正在嘻戏的小水坑而消失不见、由路人随意挑选路边的垃圾桶就地将他盖住，十秒钟后克里斯已在大楼屋顶上向名众挥手致意，随性挑选路人催眠后让人悬空飘浮、纸牌读心术……，没有任何事先的安排或场地布置，克里斯.安吉尔就像是个拥有超能力的幻觉魔法师不断挑战或制造极度危险的技巧。 2001年，克里斯将这一切神奇的魔术(或者你也可称之为魔法)搬上百老汇的舞台时，克里斯结合了百老汇式的摇滚魔术秀、街头表演的真实现场感、太阳马戏团的超现实舞台感，再加上现场重金属的摇滚乐团，不仅挑战视觉的极限，撞击听觉的震撼，测试您的心脏强度，创造全所未有的幻觉魔术新世纪，自此您对魔术的传统印象或定义得重新更正。 幻象与真实、魔术与超能力的交错. 2005年10月，克里斯.安吉尔不可思议的幻觉魔法就即将发生在你眼前！超另类的舞台及超自然的魔幻演出，搭配震撼又诡异的音乐风格，这真的只是魔术吗？还是….不可思议的超能力！”他怎么做到的？”是我们对大部分魔术师的典型反应，就如同”他为什么要做那个？”是我们对克里斯安乔正常的反应。他将一个二十五分的硬币穿过手臂皮肤，然后切开手臂把硬币拿出来。他把剃须刀片放在口中、像是将他们吞下而后用线把它们收回来。他让不可思议的怪物从胸膛(箱子)中冲出来。无疑地，克里斯是震惊与幻觉的创造大师。 克里斯已经被描绘为各式各样的称号，”后现代的胡迪尼”(a postmodern Houdini)、””(“post-apocalyptic chic”)，然而显然地这些都只是用花俏的形容来阐述”他绝对不只是穿着晚礼服从大礼帽中变出兔子”。长而柔顺的头发、黑色的指甲油、全黑的特殊服装，克里斯看起来像是罗伯疆尸(Rob Zombie重金属摇滚魔王)再现。然而真确地，克里斯与摇滚乐的差距并不大，他不只是整个幻觉秀的创作者、导演、明星，他还为表演创作谱曲。仅管这节目是一场站在时代最前线的魔术秀，但他的很多魔术都是来自于一些相当旧的题材：纸牌戏法、被切成一半、箱子逃脱秀等，再加以变化。就像一个直接由歌德风太阳马戏团中走出的表演者与道具妆扮着他大规模的表演。这个恐怖而充满危险的现代胡迪尼并不适合每一个人，但如果你抱持的心情是看一场稍微疯狂而毛骨悚然的好莱坞秀，它铁定不会让你失望的。 [编辑本段]克里斯 安吉尔 评价 克里斯 安吉尔－有着歌特式黑暗丧冥风格、有 着太阳马戏团的奇异，是 魔术师、是街头艺人、是表演艺术者、是音乐家、是舞者－将带着他骇人疯狂之作【心灵奇想】莅临世界各地。或许克里斯真 正的魔术是这个结合了纽约特色与玛莉莲曼森气质(makeup)的男人，将魔术与幻觉结合达到了艺术之境。 你曾梦想过在电视上表演魔术吗？不只是在一些地方性的早晨谈话秀，而是好几百万人看的、一整个小时的特别节目。它将会重新改造”魔术”而使它可以被拍制成电视节目，这是您已经为之努力了超过十年的目标。这是一个有关克里斯 安乔如何拍制他的第三个电视特别节目－【超自然】(Supernatural)的故事。在这个故事里，你可以看到大部分的胜利喜悦和一小部分的失败沮丧、你会学到科技对于一个成功电视特别节目的制作是如何重要，此外你还会了解到许多克里斯 安吉尔个人的幻觉艺术，这个去年在时代广场进行了六百场现场表演、荣获2001和2004国际魔术师协会(International Magician"s Society)所赠《年度魔术师》的男子。 [编辑本段]发行专辑 Criss Angel: Mindfreak Halloween Criss Angel: Mindfreak Soundtrack/Bonus CD Criss Angel: Mindfreak Complete Season One Criss Angel: Mindfreak Complete Season Two Criss Angel: Mindfreak Complete Season Three Criss Angel: Mindfreak Complete Season Four Criss Angel: Mindfreak Complete Season Five Criss Angel: Mindfreak DVD Gift Sets, Vol. 1 & 2 Criss Angel: Mindfreak Best of Seasons 1 & 2 Criss Angel: Mindfreak The Most Dangerous Escapes Criss Angel - Collectors Edition DVD Set [编辑本段]主持WWE RAW特别嘉宾 美国时间3月8日，将主持WWE美摔RAW节目。 [编辑本段]主持节目 神奇的科幻魔术收到全世界人的欢迎与向往，克里斯·安吉尔主持的《破胆王》（又名：天使魔法）赢得了全球的追捧，目前在中国，星空卫视每周一至周五晚上10:30-11:00全国独家首播该节目(目前已停播，已由《Lady 呱呱》这个栏目代替了）。 [编辑本段]电视剧 街头魔术 第一季 英文名称 ：Criss Angel Mindfreak 首播时间 ：2005年7月20日 美国 演员 ：克里斯·安吉尔（Criss Angel） 更多中文片名： 克里斯·安琪儿的街头魔术 导演： 克里斯·安吉尔 Criss Angel ....(18 episodes, 2005-2007) Michael Yanovich ....(4 episodes, 2006-2007) 编剧： 克里斯·安吉尔 Criss Angel ....(15 episodes, 2005) 地区 ：美国 语言 ：英语 类型 ：科幻/现实 影片长度 ：平均20分钟 集数 ：18集 [编辑本段]英文介绍 Criss Angel is on a quest to bring magic into our lives through extreme entertainment that he calls "mindfreak." He believes today"s magicians are for the most part archaic and out of touch with society. He plans to change that with amazing feats, including being set ablaze for 46 seconds with very little protection and levitating people right on the street to death-defying escapes and even more slight-of-hand acts. [编辑本段]中文介绍 本片可以说是给骡友的新年大礼，Criss Angel其人其事大家可以在网上搜索下了，我简要的说明一下CRISS其人，CRISS所表演的魔术可以说有一点邪门，除了他的装束和他的表演内容有一部分近似巫术外，他表演所用配乐和标志其实都是来自撒旦教……到底他部分的表演是掩眼法，超能力，巫术还是……无论如何，CRISS是当今最火魔术师，不单令观众震惊，还令行内惊讶，没有舞台，没有灯光，没有视角，在街头众目睽睽下，表演不可思议的魔术……大卫·高柏菲的时代已经过去，CRISS让你重新认识什么才是魔术…… [编辑本段]街头魔术 第二季 英文名称 ：Criss Angel Mindfreak Season 2 资源格式 ：RMVB 版本 ：[YYeTs人人影视][中文字幕] 首播时间 ：2007年 演员 ：克里斯·安吉尔(Criss Angel) 地区 ：美国 语言 ：英语 集数 ：16集

"Slap" [Chorus - 2X] I know it"s strange But my brain"s gone really insane And I"m off the chain Sipping on a fifth of the Golden Grain I feel like slappin a nigga today (slap slap) Slappin a nigga today I feel like slappin a nigga today (slap slap) Slappin a nigga today Slappin a nigga today[Verse 1: Ludacris] This morning, I woke up on the wrong side of the bed (bed) I"m sick of people putting lies in my head (head) I don"t really wanna work, I"m tired I hate my 9 to 5 And I"m thinking bout killin my boss today Killin my boss today I"m thinking bout killin my boss today (it"s just a thought man) Killin my boss today (yeah)Yesterday my best friend died (died) Somebody came and took his life (life) Now I"m looking up at the sky Have you ever seen a grown man cry? And I"m asking why did you take him away? Why did you take him away? I"m asking why did you take him away? (why"d you take him) Why did you take him away? (hey)I need some money please (please) I can barely make it on these streets (these streets) Cause I got a couple mouths to feed My baby"s in dire need So I"m thinking bout robbin a bank today Robbin a bank today I"m thinking bout robbin a bank today Robbin a bank today (real talk)Baby mama"s at home and fussin" (fussin) Callin up my mobile cussin" (cussin) Always yappin about this and that But she really don"t be talkin bout nothin Somebody take my pain away (Take my pain away) Take my pain away (please) Somebody take my pain away (hey) Take my pain away (I can"t take it)[Chorus - 2X][Verse 2: Ludacris] Somebody just broke in my ride (ride) Snatched up everything inside (inside) Even got my 45 How am I supposed to survive When I know that my stereo"s taken away Stereo"s taken away When I know that my stereo"s taken away (I need my music, man!) Stereo"s taken away (hey)Gas prices are way too high Rich people are way too fly And I"m where I wanna be in my life But why am I so behind Is it cause I"m wasting my time away Wasting my time away Is it cause I"m wasting my time away (too lazy) Wasting my time away (I can"t help it)My grandmama"s nerves are bad (bad) And everybody in the hood is mad (mad) Cause President Bush could give a DAMN about our ass So I don"t wanna hear shit that he has to say (don"t say nothin) Shit that he has to say I don"t wanna hear shit that he has to say Shit that he has to say (woo)Troops gone and we still at war (war) Nobody even really knows what for (what for) Even more I"m scared to find what the world really has in store Cause you know that tomorrow"s not promised today (it"s not promised man) Tomorrow"s not promised today Cause you know that tomorrow"s not promised today (live like today could be your last man!) Tomorrow"s not promised today (hey)[Chorus - 4X]

Ohh wooaah (3x) 这个…就不翻译了6You know you love me,I know you care 你知道你爱我，我知道你会在意You shout whenever, And I"ll be there 无论何时只要你呼唤，我就会出现在那里You want my love, You want my heart 你想要我的爱，你想要得到我的心And we will never ever ever be apart 而我们也将永远不分离Are we an item? Girl quit playing 我们是一个项目吗？（我也不懂啥意思） 女孩退出/放弃游戏We re just friends, what are you saying 我们只是朋友，你在说什么？Said theres another one Looks right in my eyes 说那里有另一个在我眼中看起来是对的（指遇见新欢）My first love broke my heart for the first time, 我的初恋就这样第一次伤了我的心And I was like 而我就像Baby, baby, baby nooo My baby, baby, baby noo My baby, baby, baby nooo 这个地球人都知道啥意思 就不翻了I thought youd always be mine mine 我认为你几乎已经是我的了Baby, baby, baby nooo My baby, baby, baby noo My baby, baby, baby nooo I thought youd always be mine, oh oh 同上For you, I would have done whatever 为你 我无论如何都会完成{应该是这样}Another chance for we, We"ll get together如果再给我们另一个机会 我们就会在一起 And wanna play it cool, or I"ll loosin" you 并且想要弄的酷一点 不然我就会失去你I"ll buy you anything, I"ll buy you any ring 我会给你买任何东西 我会给你买任何戒指And i"m in pieces , baby fix me 而我变成碎片的时候 宝贝修理我吧{比较好玩}And you"ll shake me til" you wake me from this bad dream 你会一直摇我直到我从这个美梦中醒来Im going down, down, dooown我的情绪愈来愈失落And just can"t believe my first love won"t be around 只因为我不相信我的初恋不在周围Baby, baby, baby nooo Baby, baby, baby nooo My baby, baby, baby noo My baby, baby, baby nooo I thought youd always be mine 同上When i was 13 i had my first love 当我13岁时我拥有了初恋Here was nobody to compare my baby没有任何人可以和我的宝贝相比And nobody came between us or could ever come above并且没有任何人介入我们之中或在我们之上{就是家长在上管理的意思}She had me goin crazy 她让我疯狂Oh i was starstruck. oh 我就像追星族She woke me up daily dont need no starbucks 她每天都使我醒来 不得不需要星巴克咖啡来让我清醒{个人理解}She made my heart pound 她使我心跳加速/猛烈跳动Asking for a beat when i see her in the street 当我在街上遇到她时 心脏一阵跳动And in the school on the playground 还有在学校和操场的时候But i really wanna see her on the weekends 但我真的很想在周末看见她She knows she got me dazy 她知道她使我疯狂Cause she was so amazing and now my heart is breaking 因为她是如此的引人吃惊 而我正在心碎But i just keep on sayin 但我还是想继续说Baby, baby, baby nooo My baby, baby, baby noo My baby, baby, baby nooo I thought youd always be mine x2 同上Now Im on gone yeah yeah yeah x3i"m gone现在我只能/已经离去

很准确的 看吧～BIEBER:Ohh wooaah (3x)You know you love me,I know you careJust shout whenever, And I"ll be thereYou want my love, You want my heartAnd we will never ever ever be apartAre we an item? Girl quit playingWe"re just friends, What are you sayingSaid there"s another, Look right in my eyesMy first love broke my heart for the first time,And I was likeBaby, baby, baby ohhhLike baby, baby, baby nooLike baby, baby, baby ohhI thought you"d always be mine, mineBaby, baby, baby ohhLike baby, baby, baby nooLike baby, baby, baby ohhI thought you"d always be mine,mine (oh oh)For you, I would have done whateverAnd I just can"t believe, we ain"t togetherAnd I wanna play it cool, But I"m losin" youI"ll buy you anything, I"ll buy you any ringAnd I"m in pieces, Baby fix meAnd just shake me til" you wake me from this bad dreamI"m going down, down, down, downAnd I just can"t believe my first love won"t be around.And I"m likeBaby, baby, baby ohhLike baby, baby, baby nooLike baby, baby, baby ohhI thought you"d always be mine, mineBaby, baby, baby ohhLike baby, baby, baby nooLike baby, baby, baby ohhhI thought you"d always be mine, mineLUDACRIS:When I was 13, I had my first love,There was nobody that compared to my baby,And nobody came between us or could ever come aboveShe had me goin" crazy,Oh I was starstruck,She woke me up daily,Don"t need no Starbucks.She made my heart pound,And skip a beat when I see her in the street and,At school on the playground,But I really wanna see her on the weekend,She know she got me gazin",Cuz she was so amazin",And now my heart is breakin",But I just keep on sayin"...Baby, baby, baby ohhLike baby, baby, baby nooLike baby, baby, baby ohhI thought you"d always be mine, mineBaby, baby, baby ohhLike baby, baby, baby nooLike baby, baby, baby ohhI thought youd always be mine, mine(I"m gone)Yeah, yeah, yeah (6x)(Now I‘m all gone, now I"m all gone, now I‘m all gone)Gone, gone, gone,(gone)I"m gone.

由于Addgene的篇幅太长，因此决定分为至少两个部分来介绍。 上期： 来自Addgene的CRISPR指南（1） 参考： CRISPR Guide 由于这个部分已经不是简单的看CRISPR guide了，中间还有查阅资料，文献阅读的工作，因此没有再冠以CRISPR Guide的名字。 某天晚上我和师妹在微信上描述CRISPR screening实验时，她表示惊叹说，师姐这难道不是精准的大海捞针吗？因此本期我们的文章标题使用了师妹非常精辟的描述。在平时，我们要研究某基因的功能只能通过单独敲低/敲除、过表达的方式，而CRISPR screening允许我们同时进行上万个这样的操作，一次搞定基因组范围的基因编辑，确可谓：精准大海捞针。 高通量是新时代生物技术的标配，从能一次完成超过5万个基因的PCR（RNA-seq）到细胞谱系追踪（barcoding），在不影响研究精准度的情况下，大大的降低科学研究时间和成本。依据我们前面的介绍，sgRNA将Cas9蛋白靶向至目的序列，Cas9结合到DNA上后剪切DNA，那么以下这几种情况则非常好理解： （1）Cas9 + 1个sgRNA：针对一个基因进行编辑； （2）Cas9 + 2个sgRNA：可针对两个基因进行编辑，或者可敲除两个sgRNA之间的大DNA片段； （3）Cas9 + 多个sgRNA：可同时对多个基因进行编辑； （4）Cas9 + 上万个sgRNA：同时对上万个基因进行编辑。 针对第3、4种情况，这多个sgRNA的合集被称为CRISPR文库（CRISPR Library），文库的大小可从几十个sgRNA到十几万个sgRNA。文库的出现使得我们可以 同时对上万个基因进行编辑，再筛选出对某特定表型有明显作用的基因集，用于指导下一步研究 ，这一过程称为 CRISPR screening ，举例如下图： 从上图中可以看出，CRISPR Library是包含sgRNA的pool（A-C），并通过慢病毒转导的方式转入Cas9稳定表达或野生型细胞（D），pool sgRNA感染的细胞经过特定特征（耐药性等）区分后，通过NGS测序鉴定与特定特征相关的基因集。除了常规流程的展现，我们还需要注意到 构建pool library的工作量是相当大的 ，如张峰教授组的GeCKO v2 Library可针对19,050个编码基因，而为了提高编辑效率，每个基因都设计了至少6个sgRNA，因此整个library包含有123,411个sgRNA，每个sgRNA都要构建出相应质粒，整个library的构建花费不菲，而我们只需要用500美元即可从Addgene上购得，能够使用这样的工具，真得感谢这些巨人们。 CRISPR Library的类型也根据实验目的、物种、文库大小和投递方式分类，具体信息可以在Addgene网页上可以查看： 在设计CRISPR screening实验之前需要思考以下问题： （1）CRISPR screening在准备阶段需要使用电转的方式扩增文库，并需要NGS测序来确定文库丰度，尽管目前已经有一些library可以选用化学感受态细胞进行扩增，但选用library之前一定要查阅清楚； （2）CRISPR screening实验需要大量的细胞，因此对于一些无法扩增、数量有限且非常珍贵的细胞时，如原代细胞等，CRISPR screening则可能不适用； （3）大多数CRISPR文库需要使用慢病毒将gRNA/Cas9传递到目标细胞。 因此，使用者需要充分考虑课题组的条件是否能达到以上要求。一旦确定实验条件适合，那么下一步就是选择library， 在选择文库时，也需要考虑以下几点 ： （1）基因修饰的类型：敲除、激活还是抑制目标基因； （2）gRNAs的数量：CRISPR Library可以针对整个基因组或某一类特定的基因，例如最近报道的用于增强CRT T细胞在实体瘤中活性的TCR pool knockin CRISPR Library，只有36个目的基因。 （3）物种：特定的CRISPRLibrary中的gRNAs对于特定生物体的基因组是唯一的，并且文库只与来自该生物体的细胞兼容。 （4）library骨架：如骨架中已有Cas9，则直接使用即可；如骨架中无，需要搭配使用Cas9质粒或者要求细胞本身就表达Cas9。 大部分的CRISPR Library都需要使用慢病毒投递系统， 一般有这几种骨架：LentiCRISPR和lentiGuide-Puro（如下图） 等，区别在于前者的骨架中已带有Cas9，因此是一个质粒系统；而后者需要叠加使用一个Cas9质粒。 每个CRISPR文库都是不同的，然而大多数CRISPR文库有几个共同的特性：首先，每个基因文库通常包含3-6个gRNAs，以确保每个靶基因的编辑效果，因此CRISPR文库包含数千个针对多种基因的独特gRNAs；CRISPR文库的gRNA设计通常是优化选择high on-target和low off-target的gRNA；敲除文库通常针对5" 组成性表达的外显子，而激活和抑制文库则针对启动子或增强子区域。 虽然含有Cas9的慢病毒文库是目前最流行的CRISPR筛选方法，但它们并不适用于所有的细胞类型或实验。AAV骨架的哺乳动物CRISPR文库主要用于体内实验，逆转录病毒形式的文库可用于慢病毒转导效率差的细胞中。此外，由于技术问题，CRISPR在细菌中的应用较少，但仍有几个细菌CRISPR文库通过dCas9作用达到抑制效果。 在文章TSC1 and DEPDC5 regulate HIV-1 latency through the mTOR signaling pathway 中，作者为探讨调控HIV病毒潜伏的关键基因，作者首先构建HIV的荧光报告细胞（HIV-1 proviral DNA+GFP），当HIV病毒复制的时候，GFP也同时表达，因此可以通过绿色荧光来观测HIV病毒的活动情况。 在HIV-GFP报告细胞中，转入sgRNA library进行大规模基因敲除，一定时间后用FACS分选出强绿色荧光表达细胞，经过4个循环后则得到了低荧光（HIV潜伏）和高荧光（HIV活动）两组细胞，通过NGS测序发现两组细胞中的sgRNA丰度情况，经过3次重复后得到257个基因对HIV病毒活动有正向作用，最后通过数据分析筛选出TOP的gene集。后续可针对TOP基因集进行针对性的验证。 通过这个例子，我们还可以想象，把GFP细胞换成肿瘤药耐药细胞如厄洛替尼，将FACS分选换成给药+不给药两组，一定时间后检测两组细胞的sgRNA丰度差别，则可以找到厄洛替尼耐药相关的基因。 （1）需要注意骨架中的启动子是否适合自己的目的细胞，例如CMV启动子非常广谱，但对于人胚胎干细胞的效率则非常低，需要选用带有EF1α启动子的骨架。 （2）部分library要求细胞本身就表达Cas9，这本无可厚非，但部分细胞在高表达Cas9的情况下非常脆弱，这时候需要考虑使用inducible Cas9 system，而这个系统的构建本身就是有难度的实验，因此在设计可提前一定要做好全面分析。 （3）Library扩增工作量非常大，需要尽可能的严格按照protocol进行，并且配备质粒超大提试剂盒，部分Library要求使用特殊的感受态细胞，而该细胞之外国外出售并且非常贵。 （4）由于Library非常庞大，慢病毒的包被也是大批量的，如果使用Lipo3000或者Roche的转染试剂则花费非常大，此时可以考虑使用PEI40000等便宜且效果又好的转染试剂。 （5）此外，慢病毒的包被需要选择状态好且代数低的293T细胞，如果有293FT细胞则效果更佳。 （6）考虑筛选标记的冲突，例如目的细胞是通过慢病毒转染的方法稳定表达Cas9，且筛选标记是puromycin，那么几乎所有的Library的抗性筛选基因都是puromycin，这就冲突了。 具体更多的细节还需要我们去发现。

CristinaYbarraCristinaYbarra是一名制作人，主要作品有《不及格》。外文名：CristinaYbarra职业：制作人代表作品：《不及格》合作人物：NicolásLópez电影作品

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https://www.jianshu.com/p/bfb34ba1050d 接上文，还是这篇文章。但是上篇文章只是简单的介绍了一下CRISPR-Cas9系统，以及它的一些原理和应用介绍。今天还是基于上次的结构来进行补充。会保留上篇文章中的一些关键信息，以帮助理解。 文章结构简单整理如下： 和ZFN，TALEN一样，CRISPR-Cas也是通过激活DSB的模式来达到基因标记的目的。 CRISPR RNA (crRNA) array，编码gRNA，再加上tracrRNA，则可达到定位+编辑的功能 gRNA用于引导，tracrRNA用于结合靶点。所以，人们就把crRNA和tracrRNA合在一起，成为了single-guide RNA，即sgRNA，而通过修改tracrRNA的序列，在理论上可以on-target任何目的靶点。 Cas9 offers several potential advantages over ZFNs and TALENs , including the ease of customization, higher targeting efficiency and the ability to facilitate multiplex genome editing. As custom ZFNs are often difficult to engineer, we will primarily compare Cas9 with TALEN. Cas9只需要重新购买一对oligos 20-nt gRNA即可，可是TALEM却需要重新设计新的TALEN. WT S. pyogenes Cas9 (SpCas9) is known to make a blunt cut between the 17th and 18th bases in the target sequence (3 bp 5′ of the PAM). Mutating catalytic residues in either the RuvC or the HNH nuclease domain of SpCas9 converts the enzyme into a DNA nicking enzyme. In contrast, TALENs cleave nonspeciufb01cally in the 12–24-bp linker between the pair of TALEN monomer-binding sites. Cas9可以同时对对个目的基因进行编辑，只要联合使用相应的sgRNA即可。 我放英文原文的原因是：要么这里很重要，担心自己的理解不能完全阐明；要么就是，这里不是那么重要，放出来看看就行。 Cas要求唯一的PAM存在3′ of the 20-bp target sequence，每个同源的Cas9有唯一的PAM序列，而这个情况在人类中却不是那么严格，常常每8-12个bp就能找到一个。 另外很重要的就是脱靶效应。 PAM必须紧跟在20-nt对应的靶向基因的下游，结合前面所说，降低脱靶效应也至关重要。 (i) the 5′-NGG PAM for S. pyogenes Cas9 and (ii) the minimization of off-target activity We provide an online CRISPR Design Tool ( http://tools.genome-engineering.org ) that takes a genomic sequence of interest and identifies suitable target sites. To experimentally assess off-target genomic modifications for each sgRNA, we also provide computationally predicted off-target sites (for a detailed discussion, see Box 1) 为了解决以上不足之处，张老师课题组提供了在线设计sgRNA的工具，并且也提供了关于脱靶位点的计算方法以及增加编辑效率的alternative strategy（using the D10A nickase mutant of Cas9 (Cas9n) along with a pair of sgRNAs）---该部分内容比较多，感兴趣可回原文查看 CRISPR设计工具提供了所需的所有寡核苷酸和引物的序列(i)制备sgRNA结构，(ii)分析目标修饰效率，(iii)评估潜在靶外位点的切割。值得注意的是，由于表达sgRNA的U6 RNA聚合酶III启动子更倾向于将鸟嘌呤(G)核苷酸作为其转录本的第一个碱基，因此在sgRNA的5 "端附加了一个额外的G，而20-nt引导序列并不以G开头(图4 b, c)。在极少数情况下，某些sgRNA可能由于未知的原因而无法工作;因此，我们建议为每个位点设计至少两个sgRNA，并在预期的细胞类型中测试它们的效率。 Isolation of clonal cell lines with specific modifications is often desired. This can be achieved after transfection by isolating single cells through either FACS (Steps 54–65) or serial dilutions (Steps 66–70) , followed by an expansion period to establish a new clonal cell line. It is worth noting that cell types can vary substantially in their responses to single-cell isolation, and literature specific to the cell type of interest should be consulted. 使用流式分离或者连续稀释法得到单克隆。 （1）SURVEYOR nuclease assay. （2）Plasmid- or ssODN-mediated HDR. （3）Detection of indels or HDR by sequencing 感谢师兄DZ

最近要开始学习CRISPR-Cas9实验，对着动辄几十页的说明，实在是看不下去，不如就尝试用读书笔记的方式来学习吧。 今日要讲的当然是张峰老师组的protocol 文章结构简单整理如下： ############################################################ 1.1 Targeted nucleases are powerful tools for mediating genome alteration with high precision. 照例说很需要强有力的基因编辑工具。 1.2 The RNA-guided Cas9 nuclease from the microbial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) adaptive immune system can be used to facilitate efficient genome engineering in eukaryotic cells by simply specifying a 20-nt targeting sequence within its guide RNA. 简单说由gRNA引导的Cas9核酸酶的有效性。 1.3 Here we describe a set of tools for Cas9-mediated genome editing via nonhomologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) in mammalian cells, as well as generation of modified cell lines for downstream functional studies. 非同源连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR) 1.4 To minimize off-target cleavage, we further describe a double-nicking strategy using the Cas9 nickase mutant with paired guide RNAs. 双切 This protocol provides experimentally derived guidelines for the selection of target sites, evaluation of cleavage efficiency and analysis of off-target activity. 本protocol提供了选择靶点的策略、评价切割的有效性和脱靶效应的分析。 1.5 Beginning with target design, gene modifications can be achieved within as little as 1–2 weeks, and modified clonal cell lines can be derived within 2–3 weeks. 从靶点设计开始，基因修饰可在1-2周内完成，而2-3周内可得到克隆细胞系。 ############################################################ A number of genome editing technologies have emerged in recent years, including zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and the RNA-guided CRISPR-Cas nuclease system. 近年来出现的基因编辑技术：ZFNs（锌指核酸酶），TALENs（转录激活因子样效应物核酸酶），CRISPR-Cas核酸酶系统。 The first two technologies use a strategy of tethering endonuclease catalytic domains（连接内切酶催化域） to modular DNA-binding proteins for inducing targeted DNA double-stranded breaks (DSBs) at specific genomic loci. By contrast, Cas9 is a nuclease guided by small RNAs （在引导RNA的帮助下）through Watson-Crick base pairing with target DNA 这张图后面还会需要用到 和ZFN，TALEN一样，CRISPR-Cas也是通过激活DSB的模式来达到基因标记的目的。 在CRISPR-Cas系统中，经Cas剪切形成DSB后，DNA可通过以下两种途径进行修复： （A）在缺乏修复模板的情况下，DSBs通过NHEJ过程重新连接，以插入/删除(indel)突变的形式留下疤痕，可用于基因敲除，indel的出现导致移码突变和终止密码子的过早出现。（B）在DNA修复模板的情况下，精确修复-可达到精确编辑的效果；修复模板可以是插入序列两侧带有同源臂的传统双链DNA靶向结构，也可以是单链DNA寡核苷酸(ssODNs)。 以下这句话很重要：Unlike NHEJ, HDR is generally active only in dividing cells, and its efficiency can vary widely depending on the cell type and state, as well as the genomic locus and repair template. 简介：CRISPR-Cas is a microbial adaptive immune system that uses RNA-guided nucleases to cleave foreign genetic elements. Three types (I–III) of CRISPR systems have been identified across a wide range of bacterial and archaeal hosts, wherein each system comprises a cluster of CRISPR-associated (Cas) genes, noncoding RNAs and a distinctive array of repetitive elements (direct repeats). These repeats are interspaced by short variable sequences derived from exogenous DNA targets known as protospacers, and together they constitute the CRISPR RNA (crRNA) array. Within the DNA target, each protospacer is always associated with a protospacer adjacent motif (PAM), which can vary depending on the specific CRISPR system。 CRISPR-Cas是细菌用来抵抗外来生物抵御系统。经过广谱检测，人们发现了三种主要的CRISPR系统，它们由CRISPR-associated (Cas)基因、非编码rna和一组独特的重复元素(直接重复)组成，而这些重复序列则由来自外源性DNA靶点(即原间隔体)的短可变序列直接间隔开来；重复序列+间隔序列=CRISPR RNA (crRNA) array。在有DNA靶点的情况下，每一个间隔序列都有一个前间区序列邻近基序（PAM）。 CRISPR RNA (crRNA) array，编码gRNA，再加上tracrRNA，则可达到定位+编辑的功能 gRNA用于引导，tracrRNA用于结合靶点。 Furthermore, the crRNA and tracrRNA can be fused together to create a chimeric, single-guide RNA (sgRNA) . Cas9 can thus be re-directed toward almost any target of interest in immediate vicinity of the PAM sequence by altering the 20-nt guide sequence within the sgRNA. 所以，人们就把crRNA和tracrRNA合在一起，成为了single-guide RNA，即sgRNA，而通过修改tracrRNA的序列，在理论上可以on-target任何目的靶点。 目前应用的经典例子： Direct injection of sgRNA and mRNA encoding Cas9 into embryos has enabled the rapid generation of transgenic mice with multiple modified alleles （获取基因工程鼠的好帮手！） We describe considerations for designing the 20-nt guide sequence, protocols for rapid construction and functional validation of sgRNAs and finally the use of the Cas9 nuclease to mediate both NHEJ- and HDR-based genome modifications in human embryonic kidney (HEK 293FT) and human stem cell (HUES9) lines 感谢师兄DZ

CRISPR技术 （vchal/Shutterstock） 就像有人在基因编辑领域快速前进：科学家可以使用一种简单的工具来剪断和编辑DNA，这加快了可能导致治疗和预防疾病的进步步伐。 的发现现在正在迅速到来，由于研究人员可以发表他们的工作成果，利用的工具，称为CRISPR-Cas9。 这个工具，通常简称为CRISPR，首次被证明能够在2011年剪断DNA。它由一种蛋白质和一种叫做RNA的DNA的近亲组成。科学家可以利用它在非常精确的位置切割DNA链，使他们能够从遗传物质链中移除基因的突变部分。 仅在过去的一年里，世界各地的研究人员就发表了几十篇科学论文，详细介绍了研究结果——有些很有希望，一些关键的-使用CRISPR剪掉并替换不需要的DNA来开发癌症、HIV、失明、慢性疼痛、肌肉萎缩症和亨廷顿病的治疗方法，举几个例子。 “由于CRISPR，基础研究发现的速度已经爆炸了，”生物化学家和CRISPR专家Sam Sternberg说，加州伯克利的Caribou Biosciences Inc.的技术开发小组负责人，该公司正在为医学、农业和生物研究开发基于CRISPR的解决方案。 虽然任何基于CRISPR的治疗方法都需要几年时间才能在人体中进行测试，“几乎每天都会有无数次斯特恩伯格在接受《生活科学》采访时说，新的出版物概述了利用这一新工具对人类健康和人类遗传学的新发现。当然，人类并不是唯一拥有基因组的物种。CRISPR在动物和植物上也有应用，从消灭寄生虫，比如引起疟疾和莱姆病的寄生虫，到提高土豆、柑橘和西红柿的产量， [CRISPR]的功效令人难以置信。这已经给大多数实验室的日常生活带来了一场革命，”纽约冷泉港实验室谢尔茨实验室首席研究员、分子生物学家杰森·谢尔茨说。Sheltzer和他的团队正在使用CRISPR来了解染色体的生物学，以及与染色体相关的错误是如何导致癌症的。 “我非常希望在未来十年里，基因编辑将从一个主要的研究工具转变为能够在临床上进行新治疗的工具，”Neville Sanjana说，来自纽约基因组中心和纽约大学生物学、神经科学和生理学助理教授。 在这里，我们来看看在对抗10种疾病方面的最新进展，这些疾病证明了CRISPR的能力，并暗示未来的事情。 癌症 （royaltystockphoto/Shutterstock） 一种治疗癌症的方法已经暗示了人类，自从公元前460年至370年的希腊医生希波克拉底发明了这个词：karkinos。但是，由于癌症和许多疾病一样，都是由人的基因组突变引起的，研究人员说，基于CRISPR的治疗有可能有一天会减缓肿瘤扩散的速度，或者完全逆转这种疾病。 这一领域的一些早期工作已经在中国展开，《自然》杂志报道，在人类使用基因编辑的法规比美国更为宽松的地方， 在2016年10月，中国的一名肺癌患者成为世界上第一个接受用CRISPR修饰的细胞注射的10人。由成都四川大学肿瘤专家陆佑博士领导的研究人员，对从患者自身血液中提取的免疫细胞进行了改造，并使产生一种蛋白质的基因失效，而这种蛋白质通常是癌细胞为了分裂和繁殖而劫持的。希望没有这种蛋白质，癌细胞就不会繁殖，免疫系统就会获胜美国的 研究小组也在寻找使用CRISPR抗癌的方法。宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心转化研究主任Carl June博士及其同事于2016年6月获得美国国家卫生研究院批准，对18名晚期黑色素瘤（皮肤癌）癌症患者进行临床试验，根据该大学的一份声明，肉瘤（软组织癌）和多发性骨髓瘤（骨髓癌）。在这项临床试验中，研究人员将使用CRISPR改变患者自身免疫系统细胞中的三个基因，希望使这些细胞破坏他们体内的癌细胞。 HIV （Sebastian Kaulitzki | Shutterstock） 根除导致艾滋病的病毒HIV，一直是一场艰难的战斗。这种病毒不仅感染人体内攻击病毒的免疫细胞，而且还是一种臭名昭著的变异因子。在HIV劫持体内的一个细胞并开始复制后，它会产生自身的许多基因变异，这有助于它逃避药物治疗。据世界卫生组织称，这种耐药性是治疗艾滋病毒感染者的一个巨大问题， CRISPR已经把艾滋病毒排在了它的视线中。2017年5月，坦普尔大学（Temple University）和匹兹堡大学（University of Pitt *** urgh）的研究人员利用CRISPR从病毒感染的细胞中截获病毒，关闭了病毒的复制能力。蒙特利尔麦吉尔大学（McGill University）的病毒学家陈亮（Chen Liang）领导的研究人员称，这项技术的使用在三种不同的动物模型中进行了测试，这是研究人员首次展示了一种从受感染细胞中消除艾滋病病毒的方法。他们在《分子治疗》杂志上报道了他们的研究结果。 亨廷顿病 （Ralwel/Shutterstock） 在美国大约30000人有一种叫做亨廷顿病的遗传病，这种致命的遗传病会导致大脑神经随着时间的推移而恶化，根据美国亨廷顿病学会。症状包括人格改变、情绪波动、步态不稳和言语迟钝。“KDSPE”“KDSPs”是由一种有缺陷的基因导致的，这种基因比正常情况下更大，产生一种大于正常形式的蛋白质，叫做亨廷顿蛋白，然后分解成更小的有毒的碎片，积聚在神经元中，破坏其功能。据美国国家卫生研究院（National Institutes of Health）报道， ，但在2017年6月，科学家在《临床研究杂志》（Journal of Clinical Investigation）上报告称，他们已经在实验室老鼠身上逆转了这种疾病，这些老鼠已经被改造成用人类突变的huntingtin基因代替老鼠的huntingtin基因。Su Yang，亚特兰大埃默里大学人类遗传学系博士后研究员，中国科学院遗传学与发育生物学研究所的任宝昌，用CRISPR将突变的亨廷顿基因的一部分剪掉，产生毒性位。毒性碎片在小鼠的大脑中减少，神经元开始愈合。受影响的小鼠恢复了一些运动控制、平衡和握力。尽管他们在某些任务上的表现不如健康老鼠，但结果显示CRISPR有助于对抗这种情况的潜力，科学家们强调，在这种疗法应用于人类之前，需要进行更为严格的研究。 杜氏肌营养不良症 （chiccodifc/Shutterstock） 杜氏肌营养不良症是一种由于一个叫做肌营养不良蛋白基因，是体内最长的基因之一。由分子生物学教授埃里克·奥尔森领导的德克萨斯大学西南医学中心的一个研究小组正在与CRISPR合作，寻找对抗杜氏肌营养不良症的方法sps“由于肌营养不良蛋白基因的突变，人体并没有形成一种功能性的肌营养不良蛋白，这对肌肉纤维的健康至关重要。随着时间的推移，这种蛋白质的缺乏会导致进行性肌肉退化和虚弱。 在2017年4月，奥尔森和他的团队在《科学进展》杂志上报告说，他们使用了一种叫做CRISPR-Cpf1的CRISPR工具的变体来纠正导致杜氏肌营养不良的突变。他们将该基因固定在实验室培养皿中生长的人类细胞和携带缺陷基因的小鼠中。 CRISPR-Cpf1是基因编辑工具箱中的另一个工具。根据美国犹他州西南医学中心的一份声明，它不同于更常用的CRISPR-Cas9，因为它更小，因此更容易输送到肌肉细胞。它还识别出一个不同于Cas9的DNA序列，Cas9在编辑很长的营养不良蛋白基因时非常有用。 防止失明 （Hannah Boettcher/Stock.XCHNG） 儿童失明最常见的原因之一是一种叫做Leber先天性黑蒙的疾病，这种疾病影响大约2到3人根据美国国家卫生研究院的数据，每10万名新生儿中就有一名。这种情况是遗传的，是由至少14个负责正常视力的基因突变引起的。 麻省剑桥生物技术公司Editas正在研究一种基于CRISPR的治疗方法，以逆转一种称为Leber先天性黑蒙病10型的疾病。据生物科技新闻网站Xconomy报道，该公司计划在2017年底前向美国食品和药物管理局提交必要的文件，以开始第一次针对这种情况的人体试验。 Editas由麻省理工学院生物工程教授张峰（音译）共同创建，他证明了CRISPR-Cas9可以被使用在人体细胞上。加州大学伯克利分校的詹妮弗·杜DNA和当时维也纳大学的埃曼纽尔·查彭蒂尔也证明了CRISPR-Cas9可以截取DNA，他们在2012年就这项技术申请了专利。麻省理工学院下属的博德研究所（Broad Institute）于2014年4月提交了专利，并快速跟进，最终获得了专利。据《自然》杂志报道，2017年2月，美国加州大学伯克利分校提起诉讼，声称双脱氧核糖核酸（Doudna）是第一位的，此后，博德研究所的专利获得了支持。 慢性疼痛 （Stasique/Shutterstock） 慢性疼痛不是遗传性疾病，但科学家们正在研究如何利用CRISPR通过改变基因来减少炎症来抑制背部和关节疼痛。在正常情况下，炎症是身体告诉免疫系统修复组织的方式。但慢性炎症则相反，会损伤组织，最终导致虚弱的疼痛。 2017年3月，由美国犹他大学生物工程助理教授Robby Bowles领导的一个研究小组报告说，他们使用CRISPR阻止某些细胞产生分子，这些分子被设计用来分解组织，导致引起引起疼痛的炎症，根据该大学的一份声明， 这项技术可以用来延缓背部手术后组织的退化。这可以加速愈合，减少需要额外的手术来纠正组织损伤。 莱姆病 （CDC） Kevin Esvelt，麻省理工学院的进化生物学家，想要消灭莱姆病，莱姆病是由蜱传细菌引起的，这种细菌可以从鹿蜱叮咬传播到人身上。疾病预防控制中心称，如果不加以治疗，这种感染会引起关节炎、神经痛、心悸、面瘫等问题。 虽然引起莱姆病的细菌是由鹿蜱传播给人的，但蜱虫本身在从卵中孵化时并没有这种细菌。相反，幼小的蜱虫在进食时会吸收细菌，通常是在白足鼠身上。埃斯韦尔特想减少据《连线》报道，通过使用CRISPR-Cas9基因改造白足鼠，使它们和它们的后代对细菌免疫，无法将其传给蜱虫，从而引发疾病。2016年6月，Esvelt向马萨诸塞州南塔基特岛和玛莎葡萄园的居民介绍了他的解决方案，据《科德角时报》报道，这是莱姆病的主要问题。然而，在进一步的测试完成之前，这些老鼠不会在岛上被释放，这可能需要数年的时间。 疟疾 （James Gathany）。由疾控中心提供，Paul I.Howell，MPH；Frank Hadley Collins教授， 疟疾每年导致数十万人死亡。2015年是世界卫生组织统计的最近一年，约有2.12亿疟疾病例和约42.9万疟疾死亡。 从源头上解决了这个问题，伦敦帝国理工学院的研究小组正致力于减少传播疟疾的蚊子的数量。根据该学院的一份声明，由奥斯汀·伯特教授和安德烈·克里斯蒂教授领导的一组科学家将研究两个主要的行动方案：对雄性蚊子进行基因改造，使其产生更多的雄性后代，研究小组在《自然》杂志上报道，2015年12月，他们发现了三种降低雌性蚊子生育能力的基因。他们还宣布，他们发现CRISPR可以至少针对其中一种。 作物 （Linda&Dick Buscher博士） 就像CRISPR可以用来修改人类和动物的基因组一样，它也可以用来修改植物的基因组。科学家们正在研究如何利用该工具的基因编辑能力，减少一些作物的疾病，使其他作物更加健壮。 英国诺维奇塞恩斯伯里实验室的教授索菲恩·卡蒙（Sophien Kamoun）正在研究如何去除使土豆和小麦易受疾病侵袭的基因，PhysOrg报道。据《自然》杂志报道，纽约冷泉港实验室的遗传学家扎卡里·利普曼（Zachary Lippman）正在利用CRISPR技术开发一种番茄植株，其枝条经过优化，能够承受成熟番茄的重量而不会折断。在加利福尼亚，几个实验室正试图利用CRISPR来对付一种叫做柑橘绿色化的植物疾病，这种疾病是由在柑橘林中植物间飞行的昆虫传播的细菌引起的，《自然新闻》报道， 编辑了一个可行的人类胚胎 （Dreamstime） 基于CRISPR的研究从假设到结果的速度令人震惊。谢尔茨告诉《生活科学》杂志说，过去需要几个月的实验现在需要几个星期。这一速度引起了政策制定者和利益相关者的一些担忧，特别是在人类身上使用这种技术时。 2017年2月，美国国家科学、工程和医学院的科学家发布了一份人类基因编辑评估报告，说这是可以接受的，但只是在某些条件下。该组织还说，改变胚胎、卵子和 *** 中的细胞在伦理上是允许的，前提是这样做是为了纠正疾病或残疾，而不是为了增强一个人的外表或能力，《科学新闻》报道， 虽然美国还没有科学家使用CRISPR来修饰一个可行的人类胚胎，但中国广州医科大学刘建桥领导的研究小组在2017年3月1日的《分子遗传学与基因组学》杂志上报道了这一进展。科学家们利用CRISPR-Cas9基因导入并编辑出人类胚胎的致病突变。这项研究表明，基因编辑可以在胚胎期完成。这些胚胎不是植入人体的。 关注Live Science@livescience，Facebook&Google+。“

都不错，LOWA相对来说性价比稍低。女孩子嘛，何必用那么专业的鞋子，凯乐石就够了。

其实，这个真有点难，LOWA和CRISPI都是顶级的户外运动品牌，我个人还是喜欢CRISPI一点，纯意大利手工制造的，而LOWA是纯德国手工制造的，不过CRISPI较LOWA可能稍稍贵了一点，哎，都非常不错的，凭个人喜好吧，款式呀，颜色呀，舒适度呀什么的，喜欢就好了。

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Not Alone -- Darren CrissIve been alonesurrounded by darknessand Ive seen how heartlessthe world can beAnd Ive seen you cryingyou felt like its hopelessIll always do my bestto make you -you seeThat Harry, you"re not alonecause youre here with meand nothings ever gonna bring us downcause nothing can keep me from lovin youand you know its trueit dont matter whatll come to beour love is all we need to make it throughNow I know it aint easy(No it aint easy)But it aint hard trying(its so hard trying)everytime I see you smilingand I feel you so close to metell meThat baby youre not alonecause youre here with meand nothings ever gonna bring us downcause nothing can keep me from lovin youand you know its true it dont matter whatll come to beour love is all we need to make it throughNow I still have troubleI trip and stumbletrying to make sense of things some timesI look for reasonsbut I dont need emall I need is to look in your eyesand I realizeRON: Hey Harry!HARRY: You guys came back.Baby youre not alonecause youre here with meand nothings ever gonna bring us downcause nothing can keep me from lovin youand you know its trueit dont matter whatll come to beour love is all we need to make it throughCause it dont matter whatll come to be our love is all we need to make it through

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