cas

CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。

“基因敲除狗”，“基因敲除猪”，CRISPR/Cas9到底是怎样一个技术技术近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗？杜德娜和艾曼纽？夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。二、CRISPR/Cas系统的灵感来源CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。1、“记录”入侵者档案其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图A所示）。图1 CRISPR序列示意图其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。2、打击二次入侵者当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。三、CRISPR/Cas9技术的实现需要什么？在CRISPR/Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，如图3所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游

Crispr/cas9是种基因工具，在基因工程里修改调节基因etc.这个系统有两部分，guide RNA 用来和目标基因匹配（定位），Cas酶消化目标序列（两条链一起切）。

[](javascript:void(0);) | CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。 根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。 CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。 一、基因编辑技术的发展史 基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（ 图1 ）。[图片上传失败...(image-8dab49-1625385468208)] 图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右） NHEJ（Non-homologous end joining） 非同源性末端接合 NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（ 图1 ）。 HDR（Homology directed repair） 同源重组修复 当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。 NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（ 图1 ）。 1.ZFN的识别切割机制 融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （ 图2 ）。 [图片上传失败...(image-3f1d8d-1625385468209)] 图2-ZFN基因编辑原理图 2.TALEN的识别切割机制 两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（ 图3 ）。 [图片上传失败...(image-6dcfc-1625385468209)] 图3-TELEN基因编辑原理图 3.CRISPR/Cas9的识别切割机制 crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（ 图4 ）。 [图片上传失败...(image-c85235-1625385468209)] 图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图 ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较 [图片上传失败...(image-dd6344-1625385468209)] 图5-三种基因编辑的比较 二、CRISPR/Cas技术的介绍 CRISPR/Cas9 系统的发现 1987年，在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。 2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。 2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。 2013年，发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。 从此开始，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击，CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊，近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。 CRISPR/Cas技术的原理 CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图4）。 CRISPR/Cas技术的优势 设计简单，简明的碱基互补设计原则，识别不受基因组甲基化影响，能靶向几乎任意细胞任意序列，方便同时靶向多个靶点，切割效率高。 三、CRISPR/Cas的脱靶效应 PAM**** (Protospacer adjacent motif ) 前间区序列邻近基序 PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上，NGG介导的切割效率是最高的。 sgR****NA ****(Single guide RNA ) 向导 RNA sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对，而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键，其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。 CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性，也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。 2017年5月30日， Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章，研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后，对小鼠进行全基因测序，发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变，以及超过100个位点发生大片段插入或缺失（ 图6 ）。文章的结论无疑引发了巨大震动，也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。 [图片上传失败...(image-f21b76-1625385468208)] 图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变 仔细分析后，发现该文章并不十分严谨，文章仅有两只小鼠作为实验组，一只作为对照组，数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象，不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据，且该sgRNA特异性评分很低，造成脱靶效应也应该在预料之中（ 图7 ）。 [图片上传失败...(image-751d94-1625385468208)] 图7--针对 Nature Methods 文章的回应 经过一系列的研究和改进，目前CRISPR系统的脱靶性已经很低，当然，要想达到理想的状态，还有很长的路要走。 四、CRISPR/Cas技术的进展 2016年6月，张锋在 Science 发表文章，发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。 2016年9月，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。 2017年2月22日，美国纪念斯隆.凯特林癌症中心（MSK）研究人员在 Nature 杂志发文，使用腺相关病毒（AAV）介导，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害，又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险，赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。 2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文，使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是，该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。 2017年8月11日，杨璐菡等在 Science 发表文章，通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。 2017年9月，杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题，将扭转我国部分农作物重金属超标的问题，进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。 2017年10月4日，张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率，而且有更强的特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。 2017年10月19日，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应，且不降低靶向切割效率。 2017年10月25日，张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR，可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列，所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。 2017年10月25日，哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文，报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9，可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对，该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术，即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率，且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用，因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。 五****、展望 近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。 特别感谢：BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的图片。 | | |

　　中山大学人类胚胎遗传性致病基因修复实验采取了CRISPR／Cas9基因编辑技术。该技术是近年在锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术之后出现的新型基因编辑技术，原理来自细菌的适应性免疫防御机制。相比传统的基因打靶技术和其他基因编辑技术，CRISPR／Cas9更为精确、高效和经济。　　科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。

CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。 一、什么是CRISPR-Cas系统 CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。 C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。 1、CRISPR（/"kru026aspu0259r/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌） CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。 ①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。 ②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。 ③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。 2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。 Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。 依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。 第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。 第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。 目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。 二、CRISPR-Cas9的作用原理 对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。 1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ） CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5" 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5" 到3" 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。 新间隔序列的获得可能分为三步： 第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。 第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。 第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。 2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工） CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。 crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。 3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰） crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。 随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。 三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用… tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。 CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。 CRISPR-Cas9的广泛应用 1、基因敲除（Knock-out） Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除 2、基因敲入（Knock-in） 当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率 3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation） Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。 4、多重编辑（Multiplex Editing） 将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。 5、功能基因组筛选 利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。

CRISPR/Cas9基因编辑的原理是利用gRNA特异性识别靶序列，引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割，造成靶位点DNA双链断裂，再利用生物体自身的DNA损伤修复应答机制，将断裂上下游两端的序列连接，实现目标基因的敲除。

转基因技术是指利用DNA重组、转化等技术将特定的外源目的基因转移到受体生物中，并使之产生可预期的、定向的遗传改变。转基因技术应用在人类社会各个领域 中，较为常见的包括了利用转基因技术生产的农作物，以及利用转基因技术生产疫苗等。含有转基因作物成分的食品被称之为转基因食品，其与非转基因食品具有同样的安全性。世界卫生组织以及联合国粮农组织认为：凡是通过安全评价上市的转基因食品，与传统食品一样安全，可以放心食用。一连串基因研究工作开启了人类改造生物的新纪元，这种按照工程设计原理，利用现代生物技术手段达到预期目标的技术体系被称为“基因工程”或“遗传工程”。通常将植物基因工程称为“转基因技术”，所获得的产品被称为转基因植物或转基因作物，有时也使用“遗传修饰生物”或“工程作物”等名称转基因技术是利用现代生物技术，将人们期望的目标基因，经过人工分离、重组后，导入并整合到生物体的基因组中，从而改善生物原有的性状或赋予其新的优良性状。除了转入新的外源基因外，还可以通过转基因技术对生物体基因的加工、敲除、屏蔽等方法改变生物体的遗传特性，获得人们希望得到的性状。这一技术的主要过程包括外源基因的克隆、表达载体构建、遗传转化体系的建立、遗传转化体的筛选、遗传稳定性分析和回交转育等。

空闲的和非正式的、临时的

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什么是CRISPR/Cas9？ CRISPR----Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。 07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的 CRIS

英语翻译是：现金评级装钱的英文文：installassemblepretendholddecorate、钱的英语：cashmoneyfundsumwealtha unit of weight

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1、第一步是打开cass9.1软件。2、在下部命令行输入appload并回车。3、在打开的加载卸载应用程序窗口下找到SZCL.mns。4、点击即可加载。

hot flashn.（名词）潮热：一些妇女在更年期所感到的，因表皮血管瞬间扩张而引起的突然性的，经常是全身性的短暂热感flashvt.(口语中）]亮出(财物等); 炫耀; 卖弄这样你就懂了吧Shoppers flash the cash as Year of the Pig looms 是指猪年快到了，大家都在商场里大肆购物

CAS 的安全性是一个非常重要的 Topic 。 CAS 从 v1 到 v3 ，都很依赖于 SSL ，它假定了这样一个事实，用户在一个非常不安全的网络环境中使用 SSO ， Hacker 的 Sniffer 会很容易抓住所有的 Http Traffic ，包括通过 Http 传送的密码甚至 Ticket 票据。TGC/PGT 安全性 对于一个 CAS 用户来说，最重要是要保护它的 TGC ，如果 TGC 不慎被 CAS Server 以外的实体获得， Hacker 能够找到该 TGC ，然后冒充 CAS 用户访问所有授权资源。 SSO 的安全性问题比普通应用的安全性还要严重，因为 SSO 存在一种门槛效应。以前即使 Hacker 能够截获用户在 Web 应用 A 的密码，它也未必能知道用户在 Web 应用 B 的密码，但 SSO 让 Hacker 只需要截获 TGC( 突破了门槛 ) ，即能访问所有与该用户相关的所有应用系统。 PGT 跟 TGC 的角色是一样的，如果被 Hacker 获得，后果可想而知。 从基础模式可以看出， TGC 是 CAS Server 通过 SSL 方式发送给终端用户，因此，要截取 TGC 难度非常大，从而确保 CAS 的安全性。 因此，某些人认为 CAS 可以不使用 SSL 的想法需要更正一下， CAS 的传输安全性仅仅依赖与 SSL 。 跟 Kerberos 一样 TGT ， TGC 也有自己的存活周期。下面是 CAS 的 web.xml 中，通过 grantingTimeout 来设置 CAS TGC 存活周期的参数，参数默认是 120 分钟，在合适的范围内设置最小值，太短，会影响 SSO 体验，太长，会增加安全性风险。 <context-param> <param-name>edu.yale.its.tp.cas.grantingTimeout</param-name> <param-value>7200</param-value> </context-param>TGC 面临的风险主要并非传输窃取。比如你登陆了之后，没有 Logout ，离开了电脑，别人就可以打开你的浏览器，直接访问你授权访问的应用 ) ，设置一个 TGC 的有效期，可以减少被别人盗用，或者被 Hacker 入侵你的电脑直接获取你系统目录下的 TGC Cookie 。Service Ticket/Proxy Ticket 安全性 首要明白， Service Ticket 是通过 Http 传送的，以为着所网络中的其他人可以 Sniffer 到其他人的 Ticket 。CAS 协议从几个方面让 Service Ticket 变得更加安全。l Service Ticket 只能使用一次。CAS 协议规定，无论 Service Ticket 验证是否成功， CAS Server 都会将服务端的缓存中清除该 Ticket ，从而可以确保一个 Service Ticket 被使用两次。l Service Ticket 在一段时间内失效。假设用户拿到 Service Ticket 之后，他请求 helloservice 的过程又被中断了， Service Ticket 就被空置了，事实上，此时， Service Ticket 仍然有效。 CAS 规定 Service Ticket 只能存活一定的时间，然后 CAS Server 会让它失效。通过在 web.xml 中配置下面的参数，可以让 Service Ticket 在多少秒内失效。<context-param><param-name>edu.yale.its.tp.cas.serviceTimeout</param-name><param-value>300</param-value></context-param>该参数在业务应用的条件范围内，越小越安全。l Service Ticket 是基于随机数生成的。Service Ticket 必须足够随机，如果 Service Ticket 生成规则被猜出（如果你使用了 ST+Helloservice+ 自增序列的方式， Hacker 就可以构造下一个 Ticket ）， Hacker 就等于绕过 CAS 认证，直接访问所有服务。

紧急情况。经济情况下前面要加under

炼钢工艺过程 造渣：调整钢、铁生产中熔渣成分、碱度和粘度及其反应能力的操作。目的是通过渣——金属反应炼出具有所要求成分和温度的金属。例如氧气顶吹转炉造渣和吹氧操作是为了生成有足够流动性和碱度的熔渣，以便把硫、磷降到计划钢种的上限以下，并使吹氧时喷溅和溢渣的量减至最小。 出渣：电弧炉炼钢时根据不同冶炼条件和目的在冶炼过程中所采取的放渣或扒渣操作。如用单渣法冶炼时，氧化末期须扒氧化渣；用双渣法造还原渣时，原来的氧化渣必须彻底放出，以防回磷等。 熔池搅拌：向金属熔池供应能量，使金属液和熔渣产生运动，以改善冶金反应的动力学条件。熔池搅拌可藉助于气体、机械、电磁感应等方法来实现。 电炉底吹：通过置于炉底的喷嘴将N2、Ar、CO2、CO、CH4、O2等气体根据工艺要求吹入炉内熔池以达到加速熔化，促进冶金反应过程的目的。采用底吹工艺可缩短冶炼时间，降低电耗，改善脱磷、脱硫操作，提高钢中残锰量，提高金属和合金收得率。并能使钢水成分、温度更均匀，从而改善钢质量，降低成本，提高生产率。 熔化期：炼钢的熔化期主要是对平炉和电炉炼钢而言。电弧炉炼钢从通电开始到炉料全部熔清为止、平炉炼钢从兑完铁水到炉料全部化完为止都称熔化期。熔化期的任务是尽快将炉料熔化及升温，并造好熔化期的炉渣。 氧化期和脱炭期：普通功率电弧炉炼钢的氧化期，通常指炉料溶清、取样分析到扒完氧化渣这一工艺阶段。也有认为是从吹氧或加矿脱碳开始的。氧化期的主要任务是氧化钢液中的碳、磷；去除气体及夹杂物；使钢液均匀加热升温。脱碳是氧化期的一项重要操作工艺。为了保证钢的纯净度，要求脱碳量大于0.2％左右。随着炉外精炼技术的发展，电弧炉的氧化精炼大多移到钢包或精炼炉中进行。 精炼期：炼钢过程通过造渣和其他方法把对钢的质量有害的一些元素和化合物，经化学反应选入气相或排、浮入渣中，使之从钢液中排除的工艺操作期。 还原期：普通功率电弧炉炼钢操作中，通常把氧化末期扒渣完毕到出钢这段时间称为还原期。其主要任务是造还原渣进行扩散、脱氧、脱硫、控制化学成分和调整温度。目前高功率和超功率电弧炉炼钢操作已取消还原期。 炉外精炼：将炼钢炉（转炉、电炉等）中初炼过的钢液移到另一个容器中进行精炼的炼钢过程，也叫二次冶金。炼钢过程因此分为初炼和精炼两步进行。初炼：炉料在氧化性气氛的炉内进行熔化、脱磷、脱碳和主合金化。精炼：将初炼的钢液在真空、惰性气体或还原性气氛的容器中进行脱气、脱氧、脱硫，去除夹杂物和进行成分微调等。将炼钢分两步进行的好处是：可提高钢的质量，缩短冶炼时间，简化工艺过程并降低生产成本。炉外精炼的种类很多，大致可分为常压下炉外精炼和真空下炉外精炼两类。按处理方式的不同，又可分为钢包处理型炉外精炼及钢包精炼型炉外精炼等。 钢液搅拌：炉外精炼过程中对钢液进行的搅拌。它使钢液成分和温度均匀化，并能促进冶金反应。多数冶金反应过程是相界面反应，反应物和生成物的扩散速度是这些反应的限制性环节。钢液在静止状态下，其冶金反应速度很慢，如电炉中静止的钢液脱硫需30～60分钟；而在炉精炼中采取搅拌钢液的办法脱硫只需3～5分钟。钢液在静止状态下，夹杂物*上浮除去，排除速度较慢；搅拌钢液时，夹杂物的除去速度按指数规律递增，并与搅拌强度、类型和夹杂物的特性、浓度有关。 钢包喂丝：通过喂丝机向钢包内喂入用铁皮包裹的脱氧、脱硫及微调成分的粉剂，如Ca-Si粉、或直接喂入铝线、碳线等对钢水进行深脱硫、钙处理以及微调钢中碳和铝等成分的方法。它还具有清洁钢水、改善非金属夹杂物形态的功能。 钢包处理：钢包处理型炉外精炼的简称。其特点是精炼时间短（约10～30分钟），精炼任务单一，没有补偿钢水温度降低的加热装置，工艺操作简单，设备投资少。它有钢水脱气、脱硫、成分控制和改变夹杂物形态等装置。如真空循环脱气法（RH、DH），钢包真空吹氩法（Gazid），钢包喷粉处理法（IJ、 TN、SL）等均属此类。 钢包精炼：钢包精炼型炉外精炼的简称。其特点是比钢包处理的精炼时间长（约60～180分钟），具有多种精炼功能，有补偿钢水温度降低的加热装置，适于各类高合金钢和特殊性能钢种（如超纯钢种）的精炼。真空吹氧脱碳法（VOD）、真空电弧加热脱气法（VAD）、钢包精炼法（ASEA-SKF）、封闭式吹氩成分微调法（CAS）等，均属此类；与此类似的还有氩氧脱碳法（AOD）。 惰性气体处理：向钢液中吹入惰性气体，这种气体本身不参与冶金反应，但从钢水中上升的每个小气泡都相当于一个“小真空室”（气泡中H2、N2、CO的分压接近于零），具有 “气洗”作用。炉外精炼法生产不锈钢的原理，就是应用不同的CO分压下碳铬和温度之间的平衡关系。用惰性气体加氧进行精炼脱碳，可以降低碳氧反应中CO分压，在较低温度的条件下，碳含量降低而铬不被氧化。 预合金化：向钢液加入一种或几种合金元素，使其达到成品钢成分规格要求的操作过程称为合金化。多数情况下脱氧和合金化是同时进行的，加入钢中的脱氧剂一部分消耗于钢的脱氧，转化为脱氧产物排出；另一部则为钢水所吸收，起合金化作用。在脱氧操作未全部完成前，与脱氧剂同时加入的合金被钢水吸收所起到的合金化作用称为预合金化。 成分控制：保证成品钢成分全部符合标准要求的操作。成分控制贯穿于从配料到出钢的各个环节，但重点是合金化时对合金元素成分的控制。对优质钢往往要求把成分精确地控制在一个狭窄的范围内；一般在不影响钢性能的前提下，按中、下限控制。 增硅：吹炼终点时，钢液中含硅量极低。为达到各钢号对硅含量的要求，必须以合金料形式加入一定量的硅。它除了用作脱氧剂消耗部分外，还使钢液中的硅增加。增硅量要经过准确计算，不可超过吹炼钢种所允许的范围。 终点控制：氧气转炉炼钢吹炼终点（吹氧结束）时使金属的化学成分和温度同时达到计划钢种出钢要求而进行的控制。终点控制有增碳法和拉碳法两种方法。 出钢：钢液的温度和成分达到所炼钢种的规定要求时将钢水放出的操作。出钢时要注意防止熔渣流入钢包。用于调整钢水温度、成分和脱氧用的添加剂在出钢过程中加入钢包或出钢流中。

看一下日晷再看一眼你的手表

你可以上卡西欧专柜去问

where

that

occasion场合,机会,理由复数形式直接+s即可，即occasions

认为选B occasion 既可表场合也可表时机,所以既可以是抽象地点名词,也可是时间名词,注重在此句中的意思

对every后面是不＋s得

where

这要看具体情况了,某个先行词用什么关系词引导定语从句是不一定的,这取决于引导词在定语从句中作什么成分,作主语、宾语的,要用that或which,作状语的就得考虑用where或when.即使是day,year这样的先行词,关系词也不一定要用when,也可能用that或which.如： I will never forget the day when I joined the Party.作时间状语 He happened to come (on) the day that was my birthday.作主语 The director came in person to mark the occasion that mattered to him.作主语 He always talks like that on the occasion where（相当于on which） he can draw others" attention.作状语.

occasion定语从句用法：如果occasion表示机会，时间的话，就用when引导。如果它翻译成场合，表示地点，就用where引导。occasion的意思是某次，…的时候，特别的事情（或仪式、庆典），适当的机会，时机。 扩展资料 occasion的例句：I often think fondly of an occasion some years ago at Covent Garden（我时常愉快地回想起几年前在科文特花园的一个时刻）；Taking her with me on official occasions has been a challenge（带着她出席正式场合对我来说一直是个挑战）。

condition-指某时某处事情发展,存在的状况、状态,一个人的"感觉如何". situation-往往指一组情况或一些情况的综合.常译为"情况"、"形势". occasion-指物定的"时机"、"场合"、"良机".

occasion定语从句用法：如果occasion表示机会，时间的话，就用when引导。如果它翻译成场合，表示地点，就用where引导。occasion的意思是某次，…的时候，特别的事情（或仪式、庆典），适当的机会，时机。 扩展资料 occasion的"例句：IoftenthinkfondlyofanoccasionsomeyearsagoatCoventGarden（我时常愉快地回想起几年前在科文特花园的一个时刻）；Takingherwithmeonofficialoccasionshasbeenachallenge（带着她出席正式场合对我来说一直是个挑战）。

occasion 时机,机会[S][(+for)] He seized the occasion to invite her home for dinner. 他抓住机会邀请她回家里吃饭. situation 形 势;情况;局面[C] The economic situation is now different. 现在经济形势不同了. condition 环境;形势[P] The miners there worked in dreadful conditions. 那里的矿工们在极其恶劣的环境中工作. Conditions were favorable for business then. 当时的形势有利于经商.

选C situation是情况,情形,境遇,一般与in搭配“in ...situation” case是事情,案例,场合,也与in搭配,如“in that case”“in any case” circumstance是条件,环境,境况,与under搭配,如题 occasion是场合,时机,机会,与on搭配,“on a/an ...occasion”

occasion定语从句用法：如果occasion表示机会，时间的话，就用when引导。如果它翻译成场合，表示地点，就用where引导。occasion的意思是某次，…的时候，特别的事情（或仪式、庆典），适当的机会，时机。 扩展资料 occasion的"例句：IoftenthinkfondlyofanoccasionsomeyearsagoatCoventGarden（我时常愉快地回想起几年前在科文特花园的一个时刻）；Takingherwithmeonofficialoccasionshasbeenachallenge（带着她出席正式场合对我来说一直是个挑战）。

occasion英 [əˈkeɪʒn] 美 [əˈkeʒən] n. 机会，时机； 场合； 理由； 需要vt. 惹起，引起；复数： occasions 过去式： occasioned 过去分词： occasioned 现在分词： occasioning 第三人称单数： occasionsOn one occasion, his father threw a radio at his mother. 他父亲曾有一次拎起收音机砸向他的母亲。The good weather helped to make the occasion a resounding success. 天公作美，使得这次活动获得了巨大成功。It is always an important occasion for setting out government policy. 这历来都是阐明政府政策的重要时机。

用on

1、occasion，英[__ke__n]美[__ke__n]n.场合;时机;某次;?的时候;2、Foreignvisitorshelptogiveatrulyinternationalflavourtotheoccasion.外国客人使这个场合显出一种真正国际性的气氛。3、Ithappenedonthreeseparateoccasions.这事在三个不同的场合发生过。

　　occasion表机会，时机; 场合的意思，那么你知道occasion的同义词有哪些吗?接下来我为大家整理了occasion的同义词，希望对你有帮助哦! 　　occasion的同义词辨析： 　　chance, opportunity, occasion 　　这些名词均含"机会"之意。 　　chance ： 侧重指偶然或意外的机会，有时也指正常或好的机会。 　　opportunity ： 侧重指有利或适合于采取行动，以达到某一目的或实现某种愿望的最佳时机或机会。 　　occasion ： 指特殊时机或良机，也指时节。 　　词组习语： 　　on occasion (或 occasions) 　　1. 有时;偶尔 　　有时政府会被要求进行干预。 　　on occasion, the state was asked to intervene. 　　rise to the occasion 　　1. 在特殊场合超常发挥，在特殊场合应付裕如 　　take occasion 　　1. (古)抓住时机 　　on occasion 　　1. 偶尔：间断地;不时地 　　occasion的例句： 　　1. On one occasion, his father threw a radio at his mother. 　　他父亲曾有一次拎起收音机砸向他的母亲。 　　2. The good weather helped to make the occasion a resounding success. 　　天公作美，使得这次活动获得了巨大成功。 　　3. It is always an important occasion for setting out government policy. 　　这历来都是阐明政府政策的重要时机。 　　4. On another occasion I answered the phone and the line went dead. 　　还有一回，我一接电话，就掉线了。 　　5. How can anyone look sad at an occasion like this? 　　在这样的场合怎么会有人显得忧伤呢? 　　6. I would like it to be an informal occasion. 　　我希望把它办得不那么正式。 　　7. It is, however, necessary on occasion to work outwith these hours. 　　然而，有时候在这些时点之外也需要工作。 　　8. He treated them seriously and, on occasion, entertained them hilariously. 　　他对待他们严肃认真，偶尔又逗得他们捧腹不已。 　　9. There was a touch of triumphalism about the occasion. 　　这一活动有一点炫耀胜利的意味。 　　10. All the old crowd have come out for this occasion. 　　那些老伙计们都来参加这一庆典。 　　11. The coronation was an occasion for extravagant myth and sentiment. 　　加冕典礼是极尽奢华和怀旧的仪式。 　　12. The meal gave the occasion an almost festive air. 　　这一餐使整个场合有了近乎节日般的喜庆氛围。 　　13. He could also turn on the style when the occasion demanded. 　　如果场合需要，他也能瞬间就表现得风度翩翩。 　　14. But he could also turn on the style when the occasion demanded. 　　但是如果场合需要，他也能拿出派头来。 　　15. Enthusiastic applause lent a sense of occasion to the proceedings. 　　热烈的掌声给活动平添了几分隆重的色彩。

occasion 的意思是时机、机会，是可数名词。 例句： He has been late on numerous occasions. 他已经迟到过无数次了。 It happened on three separate occasions. 这事在三个不同的场合发生过。 扩展资料 　　They have been seen together on two separate occasions. 　　他们有两次被人看见在一起。 　　I can think of at least three occasions when he arrived late. 　　我记得他至少迟到过三次。 　　I only use that on special occasions, so it"s as good as new. 　　我只在特殊场合用，所以它完好如新。 　　On several occasions she had remarked on the boy"s improvement. 　　有几次她说起过那个男孩的进步。

1. [C] particular time ( at which an event takes place ) （事情发生的）时刻，时候，场合 on this / that occasion 此时 / 彼时on the present occasion 在这次on one occasion = once 有一次on rare occasions 偶尔e.g I"ve met him on several occasions. 我见过他几次。 I was not at home on that occasion. 那时我正好不在家。 I only wear a tie on special occasions. 我只在特殊场合才打领带。 On one occasion he even rang me in the middle of the night. 有一次他甚至在午夜给我打电话。 On this occasion, as it happens, the engine started immediately. 2. suitable time for sth. opportunity 时机；机会 You should go there if the occasion arises. 如果有机会，你应当到那里去。 He used the occasion to express his gratitude. 他利用那机会表达了感激之情。 3. [ C ] special event or celebration 特殊的事件或庆典The wedding was quite an occasion. 该婚礼是一盛会。 4. [ U ] 原因；理由；需要I"ve had no occasion to visit him recently. 我最近无需去看他。 You have no occasion to be angry. 你没有理由生气。 There was no occasion to be so rude. 没有理由这样粗鲁。 5. 习语a sense of occasion 场合意识 on occasion(s) 偶尔；必要时 on the occasion of her daughter"s wedding 在她女儿的婚礼上e.g. He wore shabbiest clothes to the party: he hads no sense of occasion.他穿着最寒酸的衣服去参加聚会，毫无场合意识。He has even been known to go shopping himself on occasion.

Occasion:[ u0259"keivu0259n ] n.场合,机会,理由 v.致使,惹起,引起

关于偶然的英文occasion的相关知识点如下：一、读音：英[u0259u02c8keu026au0292n]；美[u0259u02c8keu026au0292n]二、释义：n. 机会；时刻；场合；原因v. 导致；引起三、词态变化1、复数：occasions；2、第三人称单数：occasions；3、过去式：occasioned；4、过去分词：occasioned；5、现在分词：occasioning。四、实用场景例句1、He happened on the book in a secondhand bookstore.他在旧书店偶然发现了这本书。2、Their accidental meeting led to a renewal of their acquaintance.偶然的相遇使他们重续前缘。3、The occurrence of such things is by no means fortuitous.出现这种问题绝不是偶然的。4、I found out by chance that she was actually a freshman from London University.我偶然发现她实际上是伦敦大学的一年级学生。

occasion [英]u0259u02c8keu026au0292n [美]u0259u02c8keu0292u0259n n. 机会，时机;场合;理由;需要 vt. 惹起，引起 [例句]And especially when the occasion in question is valentine "s day.还有就是，尤其谈到的这个场合是情人节。

n. 时机，机会；场合；理由vt. 引起，惹起

occasion[英][u0259u02c8keu026au0292n][美][u0259u02c8keu0292u0259n]n.机会，时机; 场合; 理由; 需要; vt.惹起，引起; 第三人称单数：occasions过去分词：occasioned复数：occasions现在进行时：occasioning过去式：occasioned短语词组on occasion (或 occasions)rise to the occasiontake occasion例句:1.Then you can use music for every occasion. 你可以把音乐用在任何场合。祝你英语学习成功！~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~如有疑问请继续追问，望采纳，谢谢，您的采纳是我的力量！

机会请采纳

occasion[英][u0259u02c8keu026au0292n][美][u0259u02c8keu0292u0259n]x0dx0an.机会，时机; 场合; 理由; 需要; x0dx0avt.惹起，引起; x0dx0a第三人称单数：occasions过去分词：occasioned复数：occasions现在进行时：occasioning过去式：occasionedx0dx0ax0dx0a短语词组x0dx0aon occasion (或 occasions)x0dx0ax0dx0arise to the occasionx0dx0ax0dx0atake occasionx0dx0ax0dx0a例句:x0dx0a1.x0dx0aThen you can use music for every occasion. x0dx0a你可以把音乐用在任何场合。x0dx0ax0dx0a祝你英语学习成功！x0dx0a~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~x0dx0a如有疑问请继续追问，望采纳，谢谢，您的采纳是我的力量！

occasional是形容词occasion是名词

risetotheoccasion的意思是：应付自如。risetotheoccasion的意思是：应付自如。risetotheoccasion的网络解释是risetotheoccasion的反义词。risetotheoccasion的例句是Whilethere"snoquestionthatcontinuousstressisharmful,severalstudiessuggestthatchallengingsituationsinwhichyou"reabletorisetotheoccasioncanbegoodforyou.虽然毫无疑问，持续的压力是有害的。但有几项研究表明，在具有挑战性的情况下，如果你能够迎难而上，可能对你有好处。Youcandependonhimtorisetotheoccasion,ifneedbe.如果需要的话，你可依靠他来应付这个局面。So,canIndiarisetotheoccasion?那么，印度能对城市化应付裕如吗。一、网络解释点此查看risetotheoccasion的详细内容1.risetotheoccasion的反义词1.应付自如：occassionn....的时刻;机会;需要vt.引起,导致|risetotheoccasion应付自如|occupyvt.居住;占2.有应变之才：onthisoccasion这一次|risetotheoccasion有应变之才|takeoccasionto抓住...的好时机,乘机...3.成功应对困难局面：risetosth对某事(尤指令人气愤的评论)反应强烈|risetotheoccasion成功应对困难局面|riseup反抗,造反4.risetotheoccasion的反义词4.随机应变：水泄不通beblockedwithcrowdsofpeople|随机应变risetotheoccasion|挑挑拣拣pickandchoose二、例句Whilethere"snoquestionthatcontinuousstressisharmful,severalstudiessuggestthatchallengingsituationsinwhichyou"reabletorisetotheoccasioncanbegoodforyou.虽然毫无疑问，持续的压力是有害的。但有几项研究表明，在具有挑战性的情况下，如果你能够迎难而上，可能对你有好处。Youcandependonhimtorisetotheoccasion,ifneedbe.如果需要的话，你可依靠他来应付这个局面。So,canIndiarisetotheoccasion?那么，印度能对城市化应付裕如吗？risetotheoccasion的相关临近词rise、risento点此查看更多关于risetotheoccasion的详细信息

occasion 的固定用法，记住吧，以后还会遇到

C occasion 作可数名词时，意为“时机”，作不可数名词时，意为“必要”，本题中occasion意为“必要”。从句语法结构上看，本句中用opportunity(难得的)机会，chance（偶然的）机会均可，但按逻辑意思，应用occasion.

o-c-c-a-s-i-o-noccasion。单词就是这样记的。语言学家曾经做过调查，用一些所谓的巧妙的方法记单词会使单词的记忆环节变长，从而降低记单词的效率。希望您的英语学习路程顺利~ ——助人自助英语团诚心回答

在occasion定语从句中，如果occasion表示机会，时间的话，就用when引导。如果它翻译成场合，表示地点，就用where引导。occasion的意思是某次，…的时候，特别的事情（或仪式、庆典），适当的机会，时机。occasion的简明意思： n. 场合；时机；理由；机会；盛大场面 vt. 引起；致使 An occasion lost cannot be redeemed. 时机失了无法挽回。 The video camera that one single mother bought for a special occasion， for example， is not much fun now 比如，一位单身母亲为特殊场合购买了摄影机，现在她不觉得这台摄影机多有趣了。 I will speak to him if the occasion arises. 如果有机会我将跟他说。 Luckily for you， you have no more occasion to do it than I had. 你很幸运，你同我都没有这样做的理由。

当occasion要表达“在……情况，场合下”的意思时，前面应与英语介词on搭配。 occasion 英 [ken] 美 [ken] n.某次;…的时候;特别的事情(或仪式、庆典);适当的机会;时机 v.使发生;造成;导致 扩展资料 　　短语： 　　on this / that occasion 此时 / 彼时 　　on the present occasion 在这次 　　on one occasion = once 有一次 　　on rare occasions 偶尔

occasionn.时机，机会；场合；理由vt.引起，惹起onoccasion有时；间或；不时地；必要时purchaseoccasion购买时机occasionfor时机；有…理由varyingoccasion动时点occasionsituation场合PagingOccasion寻呼块出现时刻AnyOccasion各种场景occasionanalysis诱因分析HistoricOccasion历史留念ontheoccasion在那时；值此…之际specialoccasion特别的时刻；特别的场合ontheoccasionof值此…之际onoccasion有时；偶尔onthisoccasionadj.这一次ononeoccasionadj.有一次；曾经，有一个时候onthatoccasion在那个时机；在那个时候；在那个场合下risetotheoccasion应付自如

要看你的主语是什么吧

重要的场合。不同以往的场合。有重要意义的场合。

occasion n. 名词：时机， 机会 ， 场合occational adj. 形容词：偶然的 ，临时的，特殊场合的 ，occationally adv. 副词： 偶尔 ，间或 ，

occasion：a.a time when something happens b.an important social event or ceremony 做定语从句的先行词,如果表示时间,关系副词自然用when.如果表示地点,关系词用where】

occasion 在定语从句中做先行词时，将它看作地点名词（同样的：case, situation, circumstance），用where =in which 引导，如 It took all the fun out of the occasion when we heard that you were ill. 我们一听说你病了，欢乐的气氛一扫而光。属于时间状语从句

occasion的形容词是：occasional。occasional　英 [u0259"keu026au0292u0259nl] 　 　 美 [u0259"keu026au0292u0259nl] 　 　adj. 偶然的；临时的；不时的。He"s someone I have an occasional chat and joke with.我偶然跟他闲聊，一起说笑话。An occasional outburst of anger creates wrinkles on the face.一次愤怒的偶然爆发会在脸部产生皱纹。辨析：occasional，uncommon，scare，rare这些形容词均含“稀罕的、很少发生”之意。occasional指偶然、不时或间或发生的事，侧重无规律可循。uncommon指一般不发生或很少发生的事情，故显得独特、异常与例外。scare指暂时不易发现、不存在或数量不足，供不应求的东西。rare指难得发生的事或难遇见的人或事，侧重特殊性。

个人觉得：occasion后用when还是where取决于使用者把它视为时间还是场合(即抽象的地点)。用法例句： 1.Please describe an occasion where you met with real difficulties. 2.In hard times, the Spring Festival was the only occasion where a family threw off the old attire and put on new clothes specially made for the festival. 3.Describe an occasion when you had to give a presentation to an audience.4.A training session should be an occasion where the whole team works together

名词 1.可数名词：场合，时刻；重大活动，盛典 2.时机，机会(+for) 3.起因，近因(+of) 4.不可数名词：理由；需要(+for)(+to-v) v. 1.及物动词：引起；惹起 词形变化：时态：occasioned，occasioning，occasions。 同义词：function，affair，social function，social occasion；juncture。 单词分析：这些名词均含“机会”之意。 chance：侧重指偶然或意外的机会，有时也指正常或好的机会。 opportunity：侧重指有利或适合于采取行动，以达到某一目的或实现某种愿望的时机或机会。 occasion：指特殊时机或良机，也指时节。 英语解释 a vaguely specified social event give occasion to reason an opportunity to do something the time of a particular event an event that occurs at a critical time 相似短语 ceremonial occasion phr. 正式场合 social occasion phr. 社交场合 great occasion 盛大的场面 on occasion 偶尔,有时,间或,必要时 occasion sentence 情境句 相似单词 occasionalist [哲] n.偶因论者 occasionality n. 偶然性 occasioned [ occasion ]的过去式 occasioning [ occasion ]的现在分词 occasions n. 场合

1、当occasion要表达“在??情况，场合下”的意思时，前面应与英语介词on搭配。I met strangers on that occasion. 在那次我遇见了一些陌生人。2、on occasion还有“偶尔地”的意思。I call on him on occasion. 我偶尔去拜访他。3、have occasion to?表示“有??的必要”，have no/little occasion to表示“没有??的必要”。此时occasion前面不能用冠词an或the。I have no occasion to see him these days. 我最近没必要见他。4、occasion指“机会”时，有“take occasion to?”的用法，表达“趁着机会做?”的意思。其反义词则是“not take occasion to?”，表示“不趁着??”。这里occasion前不能用冠词an或the；5、当occasion用作动词表示“引起”，“致使”时，可用双宾语结构。His long silence occasions me great anxiety. 他漫长的沉默让我焦虑不已。扩展资料：chance，opportunity，occasion这些名词均含“机会”之意。辨析如下：chance侧重指偶然或意外的机会，有时也指正常或好的机会。opportunity侧重指有利或适合于采取行动，以达到某一目的或实现某种愿望的最佳时机或机会。occasion指特殊时机或良机，也指时节。occasion的词汇搭配：1、celebrate an occasion 庆祝某个时刻。2、choose one"s occasion 选择时机。3、fit the occasion 适合这种场合。4、take occasion 利用机会。5、formal occasion 正式场合。

呕K深

名词 n. 1.场合,时刻;重大活动,盛典[C]2.时机,机会[S][(+for)]He seized the occasion to invite her home for dinner. 他抓住机会邀请她回家里吃饭。 3.起因,近因[S][(+of)]Her departure was the occasion of much sadness. 她的离别是令人十分悲伤的起因。 4.理由;需要[U][(+for)][+to-v]You have no occasion to buy another car. 你没有必要再买一辆汽车。

where用于抽象名词，翻译为某事物或某地点，when对时间起修饰；occasion时刻用when修饰。

场合

1、occasion，英 [u0259u02c8keu026au0292n] 美 [u0259u02c8keu026au0292n]n.场合;时机;某次;…的时候; 2、Foreign visitors help to give a truly international flavour to the occasion. 外国客人使这个场合显出一种真正国际性的气氛。 3、It happened on three separate occasions. 这事在三个不同的场合发生过。

occasion的读音是：英[_"ke__n]。occasion过去式:occasioned；过去分词:occasioned；现在分词:occasioning；第三人称单数:occasions。occasion【近义词】chance。一、详尽释义n.(名词)时机，机会场合时刻，时间，时节近因，起因，原因，诱因需要，必要重大活动，盛典事务，事工作，职业v.(动词)引起，惹起，造成，致使，导致赢得是...之源使发生二、双解释义n.(名词)[C]时刻,时候atimewhensthhappens[S]机会,时机asuitableorfavorabletime[C]特殊场合;庆典aspecialeventorceremony[S]原因,理由adirectcauseorreasonv.(动词)vt.惹起,引起cause三、英英释义Noun:aneventthatoccursatacriticaltime;"atsuchjunctureshealwayshadanimpulsetoleave""itwasneededonlyonspecialoccasions"avaguelyspecifiedsocialevent;"thepartywasquiteanaffair""anoccasionarrangedtohonorthepresident""aseeminglyendlessroundofsocialfunctions"reason;"therewasnooccasionforcomplaint"thetimeofaparticularevent;"ontheoccasionofhis60thbirthday"anopportunitytodosomething;"therewasneveranoccasionforhertodemonstrateherskill"Verb:giveoccasionto四、例句Ionlywearatieonspecialoccasions.我只在特殊场合才打领带。Thisisnotanoccasionforlaughter.这不是笑的时候.Therewasnooccasionforyoutobesorude.你没有理由这样粗鲁。Thiswillbeanoccasionforusalltomakeanewstart.这是我们大家重新开始的好机会。Theprince"sweddingwasquiteanoccasion.王子的婚礼可真是一场盛会。Whatoccasionedhisangryprotestistherival"sdeliberateandcynicalfoul.对手的恶意犯规引起他的愤怒反抗。Stephen"sbehaviouroccasionedhisparentsmuchanxiety.斯蒂芬的行为使其父母十分担心。五、词汇搭配用作名词(n.)动词+～celebrateanoccasion庆祝某个时刻chooseone"soccasion选择时机fittheoccasion适合这种场合takeoccasion利用机会形容词+～formaloccasion正式场合auspiciousoccasion吉祥的时刻thebigoccasion大庆的日子介词+～bytheoccasion利用这个机会ononeoccasion在一个时刻uponeveryoccasion一有机会～+介词occasionforlaughter笑的场合用作动词(v.)～+名词occasiontrouble引起麻烦六、经典引文FirstofallImusttaketheoccasionTowishMissAngeleveryhappiness.出自：T.S.EliotAbookwhich,eveninthosedays,occasionedsomecontroversy.出自：H.J.LaskiThiscuriosityfromabystanderoccasionedthemsomesurprise.出自：F.Tuohy七、词源解说☆14世纪晚期进入英语，直接源自古法语的occasion；最初源自拉丁语的occasionem，意为掉在一起。occasion的相关近义词chance、occurrence、timeoccasion的相关临近词occasional、Occam、occasioned、occasionlity、occasionoffer、occasiondelay、occasionarise、occasionchoice、occasionrequire、occasionanalysis、occasiondistress、occasionsentence

occasion的意思是场合。英 [ə"keɪʒn] 　 美 [ə"keɪʒn] 　 　n. 场合，时机，理由，机会，盛大场面vt. 引起，致使例句：I only wear a tie on special occasions.翻译：我只在特殊场合才打领带。短语：choose one"s occasion 选择时机用法1、当occasion要表达“在……情况，场合下”的意思时，前面应与英语介词on搭配。2、on occasion还有“偶尔地”的意思。3、have occasion to…表示“有……的必要”，have no/little occasion to表示“没有……的必要”。此时occasion前面不能用冠词an或the。

　　【歌名】：I Want You　　【英文歌词】：　　You sat down next to me, like poetry to wine　　Out window looked upon a yellow neon sign　　I took your hand while you decided what to do　　The only kiss, I ever miss, I shared with you　　The other cities hold a memory still of a place　　But, when I dream of London, I can only see your face　　I want you　　Or no one　　No one else will do　　You, or no one　　No one is the only one　　To fill the empty space I hold for you　　You simplified me down to slogans on the wall　　I took offense, but you were right about them all　　My friends are telling me I shouldn"t waste my time　　But I can"t concentrate until I make you mine　　I"m drawing cards and making wishes down by the well　　Who would"ve known I"d lose myself in that old hotel　　I want you　　Or no one　　No one else for me　　You, or no one　　"Cause no one else is strong enough, strong enough　　To slow me down in time to set me free　　I want you　　Or no one else　　No one else is fine　　Oh, you, or no one　　No one is the only one　　To fill me up until I make you mine　　【中文歌词】：　　你坐在我旁边，像诗酒　　窗外望着一个黄色的霓虹灯招牌　　当你决定要做什么时，我牵你的手　　唯一的吻，我曾经错过，我与你分享　　其他城市的记忆仍然是一个地方　　但是，当我梦见伦敦时，我只能看到你的脸　　我要你　　或没有人　　没有别人会做　　你，或没有人　　没有人是唯一的　　为你填补空白我为你举行　　你在墙上的标语上简化了我　　我犯了罪，但你对他们都是对的　　我的朋友们都在告诉我，我不该浪费我的时间　　但我不能集中，直到我让你我的　　我在画卡片，并希望在井　　谁知道我会在那家旧旅馆里迷失了自己　　我要你　　或没有人　　没有别人为我　　你，或没有人　　因为没有其他人足够强大，足够强大　　慢下来的时间，让我自由　　我要你　　或者没有其他人　　没有别人是好的　　哦，你，或者没有人　　没有人是唯一的　　把我填满，直到我让你我的

stair (countable noun) 楼梯的一级 (阶梯的某)一级 = one of the steps in a set of stairs stairs (plural noun) (楼层之间的) 楼梯 = a series of steps that go from one level or floor to another. staircase (singular noun) 楼梯 (包括扶手 栏杆) = a set of stairs inside a building including the posts and the rails (banisters) that are fixed at the sides. banister (noun) (楼梯的〕栏杆 扶手 = the posts and the rail which you can hold for support when going up or down stairs. 最大差异 stairs 不包括栏杆 扶手. 许多时 staircase 与 stairs (相同解”楼梯”) 可互换使用 不理有无栏杆 扶手 a flight of stairs = 一段楼梯 (无 a flight of staircases 这个 phrase) A stair is one of a succession of steps leading from one floor to another; stairs me either the steps of staircases or a series or "flights" of such steps. 2014-06-27 04:45:22 补充： Jenkin: "但外国住宅(例如三层的村屋或...里面的楼梯只会叫(stairs)" ~ 你这个 statement 是错 美国波士顿 不论 town houses bungalows 有些屋出售卖点是有 spiral staircase wickedlocalbostonhomes/2013/09/boston-real-estate/charlestown-triplex-boasts-signature-spiral-staircase/ 2014-06-27 09:00:57 补充： stairs 和 staircases 同是 plural staircases 是多过 one set of steps 例如前后门有 合计 o staircases stairs 多过一级楼梯 可能 2 3 4 ..estairs stairs 并且可指 one set of steps 参考: Yahoo Dictionary; Oxford Dictionary stairs通常是指上落的梯级 staircase是指建筑结构的整个楼梯内部= 梯间 stairs通常意义是指走上落的梯级 staircase是指建筑结构上设置的楼梯 中国香港见到的大都是大厦楼宇或商场公众的楼梯或走火通道的楼梯(staircase)，但外国住宅(例如三层的村屋或两层的别墅式平房里面的楼梯只会叫(stairs) 希望这种简单的分帮助你解决大部份写作的取舍。 He ran down the stairs in the fire escape staircase when he heard the fire alarm.

Weather man said it"s gonna snow 天气预报说 要下雪了But now I should be used to the cold 现在起 我应该要学着适应着冰冷的世界了Mid-february shouldn"t be so scary 二月中旬 不该这么恐怖的It was only december 那是12月I still remember 我依旧记得The presents 有礼物The tree 有圣诞树You and me 还有 你和我But you went away 但你走了How dare you? 你怎么就这么走了呢？I miss you 我很想你They say I"ll be okay 他们说我会好起来的But I"m not going to ever get over you 但我永远也不会忘记你Your favorite records make me feel better 听着你最爱的那些唱片 我感觉好了一些Cause you sing along with every song 因为你总会跟着唱片一起唱每首歌I kown you didn"t 我知道那些Mean to give them to me 只是你无意间给我留下的回忆But you went away 你走了How dare you? 你怎么就这么走了呢？I miss you 我很想你They say I"ll be okay 他们说我会好起来的But I"m not going to 但我不会ever get 永远都不会over you 忘记你

出口的货物在外包装上都要编号。如果用木箱装就用case no.，用尼龙包或塑料包装的就用bale no.（比如棉花）。用纸箱装就用carton no.，用托盘装就用pallet no.，不知你是否明白了

木箱用 WOOD CASES表示,一般都缩写为W/CS(这个是复数形式）,单数去掉S

歌曲名:Touch Me (SMASH Cast Version featuring Katharine McPhee)歌手:SMASH Cast专辑:The Music of SMASHThis is secret...my first touch! あぁ　私の声も　闻こえなくなったそれでも　ここにいる　alivetouch Me!作词：仓木麻衣作曲：Yue Mochizuki编曲：Takahiro Hiraga止められない感情が　わかってるけど　时々出て　やけっぱちな「ほっといてよ」友达には「変わったよね」って言われるけど　すいません....あと一歩がんばれないほらね　探りたくなる言叶「今日の味方は明日の敌」ほんの少し目を伏せただけなのに　このままで终わっていくのかな？押したり引いたり　もう头痛くなるほど　じれったい　胜ち负けじゃないよ君といたい　いつもいたい　ねぇ　本当のところ　わからないtouch me　はしゃぐ声の裏には隠す涙が　こんな私でも好きでいてくれるの？何も知らないのに...手に负えない　自分でももう身体中流れ出してく　touch me!だから　catch me hear me feel me touch me touch Me!「駆け込み乗车は危ないのでおやめ下さい」とアナウンスが流れて友达には「バカだよね」って言われたけど　最终电车にもミスしたみたいほらね　モロイ内面隠せない　今日のネタ　明日の笑い軽く演じてみる　梦物语　まだまだ　そう　始まったばかり笑ったり泣いたり　もう头痛くなる程テンパって　核心ふれずにホントのところは？う～ん本気でぶつかること避けたいだけ　リアルな感情出しても「わかるよ　わかる！」とかうわべだけの言叶はもう舍てて　もう充分伤ついた....それでも期待させてよ　全部壊してよ　ねぇ　touch meだから　catch me hear me feel me touch me touch Me!笑ったり泣いたり　もう头痛くなる程テンパってそれだけ　本気で　私たち　ねぇ　ホントのところはどうなの？全部壊しちゃうくらい　怖くないんだ守ってあげるなんて　うわべだけの言叶は舍てて一日千秋　それでも期待してしまう　あなたの优しさに　touch meだから　catch me hear me feel me touch me touch Me!ぐるぐる巡る　もう头痛くなるほどシミュレーションじれったい　じれったい君といたい　いつもいたい　ねぇ　本当のところ　わからないtouch me　はしゃぐ声の裏には隠す涙が　でも　そう思ったりもしてくれるんだね核心ふれずに...手に负えない　それでいてもう身体中に流れ出してく　touch me!だから　catch me hear me feel me touch me touch Me!http://music.baidu.com/song/13984124